用氰化高铁血红蛋白液作标准测定血清游离血红蛋白
作者：刘春生 王勇 何东风
单位：刘春生(南充市中心医院检验科，四川南充 637000)；王勇(川北医学院附属医院，四川 南充 637000)；何东风(南充市中心血站，四川南充 637000)
关键词：
川北医学院学报000467 中图分类号：R446.11 文献标识码 ：E
文章编号：1005-3697(2000)04-0083-02
测定血清(浆)游离血红蛋白的经典方法是以联苯胺作显色底物的 比色法。在此方法中，其血红蛋白标准液存在配制繁杂、保存时间短的缺点，加之临床样本零散，每次测定要花费很多时间配制标准液。作者通过在传统方法的基础上，用氰化高铁血红蛋白(HiCN)作标准，进行了血清游离血红蛋白测定的探索，证实血红蛋白转化为HiCN后仍有类似过氧化物酶的作用。因而，用HiCN作标准解决了原方法之不足。 现报道如下：
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂
1.1.1 氰化高铁血红蛋白转化液(试剂1)：配制同文齐氏(VanKampen-Zijlstra)液[1]。用其1/2浓度。
1.1.2 血红蛋白标准液：按常规CCl4法制备血红蛋白溶液，用HiCN法定值并稀释到10g/L之浓度。取此液1.0ml，用试剂1稀释至100ml,即为100mg/L。置4℃保存备用。
1.1.3 其余试剂同原法。[1]
1.2 方法：检测血清样本按表1进行。
2 实验结果
2.1 呈色稳定性观察：用两份血清标本和Hb标准液同时进行测定。显色后在10min、30min、50min、60min及80min用比色计比色。结果显示在1h内颜色基本不变(见表2)。
, 百拇医药
2.2 线性范围：将Hb标准液作成100、200、300、400、500、600mg/L，用721分光光度计观察本法线性关系。本法在400mg/L内线性关系良好。样品含量高于400mg/L时，应稀释重做。 10min后比色，波长500nm，蒸馏水调零，结果按下式计算：
血清游离血红蛋白(mg/L)=[Ua-Ba1(Sa-Sa×0.1)-Ba]×100
Ua:测定管光密度 Sa：标准管光密度 Ba：空白管光密度
2.3 精密度：用三份未知值血清样本，进行批内、批间各10次重复测定。结果见表3，显示精密度较好。
2.4 回收实验：在含Hb61.29mg/L的血清0.2ml中，分别加入0.02ml含量为50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准Hb液进行回收。结果为97.58%～101.11%，平均回收率为99.69%。
, 百拇医药
2.5 与原法比较：采用本操作方法与原法同时进行临床31份样本测定。结果显示本法与原法有密切正相关。
y=1.308x+6.16，r=0.9915,α=0.05,P<0.01。
2.6 干扰实验
2.6.1 胆红素的干扰：在已知值的血清标本中加入胆红素，使加入后终浓度为50mg/L和10mg/L。实验结果表明，胆红素浓度达10mg/L时可使本法光密度值减少8%。
2.6.2 抗坏血酸的干扰：[2]将抗坏血酸按20mg/L、2mg/L、0.2mg/L三种浓度，分别加入待检血清测定，结果在20mg/L时，可使原光密度值降低17.9%。
2.6.3 葡萄糖的干扰：在样本中分别加入100mg/L、200mg/L、300mg/L葡萄糖进行实验。结果对本法无影响。
, 百拇医药
2.7 抗凝剂的选择：选用含枸椽酸钠(10.90mmol/L)、EDTA(1.5g/L)、肝素(1.0g/L)的基质血清测定，结果枸椽酸钠、EDTA均可引起光密度值下降，产生干扰(α=0.05,P<0.05)，而肝素对测定结果无影响。故用血浆进行本法测定时，最好使用肝素抗凝。
2.8 正常参考范围：用本法测定正常健康体检人员67人，结果均值42.83mg/L。参考范围：42.83±3.8mg/L(x±2SD)，比原法(<40mg/L)稍高。
2.9 标准液保存时间观察：将本法配制的标准液置4℃冰箱保存，每月按样本操作并记录其光密度值。8mon后，其光密度逐渐减低。因此，此标准液在4℃可保存至少7mon。表1 按此表加入样本和试剂 试剂(ml)
测定管(U)
标准管(S)
, 百拇医药
空白管(B)
血清
0.02
-
-
转化液
0.02
-
0.02
-
Hb标准液
-
0.02
, 百拇医药
-
放置5min后
1%联苯胺
0.5
0.5
0.5
1%过氧化氢
0.5
0.5
0.5
混匀，置37℃水浴20min
10%醋酸
5.0
, 百拇医药
5.0
5.0
10min后比色，波长500nm，蒸馏水调零，结果按下式计算：
血清游离血红蛋白(mg/L)=[Ua-Ba1(Sa-Sa×0.1)-Ba]×100
Ua:测定管光密度 Sa：标准管光密度 Ba：空白管光密度表2 呈色稳定性观察 时间
10min
30min
50min
60min
80min
, 百拇医药
标准
0.50
0.50
0.50
0.495
0.49
样本1
0.80
0.80
0.80
0.79
0.78
样本2
, http://www.100md.com
1.10
1.10
1.09
1.08
1.08
2.3 精密度：用三份未知值血清样本，进行批内、批间各10次重复测定。结果见表3，显示精密度较好。表3 重复试验结果 样本
批 间
批 内
均值
SD
CV(%)
均值
, 百拇医药
SD
CV(%)
A
110.2
3.33
3.02
113.06
2.84
2.5
B
103.0
4.3
4.1
, 百拇医药
110.9
3.56
3.2
C
67.4
2.67
3.9
67.82
2.67
3.9
3 讨 论
3.1 据文献[3]报道，白蛋白可使生理盐水配制的标准Hb液光密度值减低。我们用白蛋白标准液(北京化工厂99-2)按20g/L、30g/L、40g/L、60g/L浓度加入Hb标准液中进行测定。结果在30g/L时光密度值下降5%，40g/L时下降10%，并开始出现随浓度增加而呈平缓增加的趋势。若在标准液中加入白蛋白成本颇高，作者选定近似生理浓度(40g/L)的光密度下降比值0.1作为本法白蛋白校正系数来解决这一问题。计算时将标准光密度值减去标准液值乘以系数的值。
, http://www.100md.com
3.2 波长的确定：用岛津UV-260分光光度计在400～650nm波长范围内同时对标准、样本和空白进行连续自动扫描。结果显示，在500nm处标准和样本均有最大吸收峰，因此本法选用500nm波长。原法的波长为530nm。
3.3 氰化高铁血红蛋白转化液浓度的选择：我们将文齐氏液的原浓度、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6浓度分别制成本标准血红蛋白液，按本法测定其光密度，发现从1/4开始随浓度减低其光密度值也减小。1/2的光密度值与原浓度相同，而空白值则小于原浓度且随时间的延长波动小。
按文齐氏液最大转化能力：5ml可使4mgHb(相当于常规Hb测定浓度200g/L 20μl)转化推算，1/2浓度能足够保证本法标准Hb的全部转化。故本法选用文齐氏液1/2浓度作Hb标准液的稀释液。
3.4 本文改用HiCN作标准测定血清(浆)游离血红蛋白，大大延长了血红蛋白标准的保存时间，操作更简便。实验证实，本法的线性、回收率和精密度均良好，便于临床常规检测。
参考文献：
[1] 庄威远，等.临床血液学检验[M].吉林：吉林医学院处，19 88，66.
[2] Antal Ferencz etal.Clin.Chim.Acta,1983，135～136.
[3] 王学珍，等.血浆游离血红蛋白测定——酚、4—AAP法[J].中华血液学杂志，1988，9(8)：497～498.
(收稿日期：2000-08-24), 百拇医药
单位：刘春生(南充市中心医院检验科，四川南充 637000)；王勇(川北医学院附属医院，四川 南充 637000)；何东风(南充市中心血站，四川南充 637000)
关键词：
川北医学院学报000467 中图分类号：R446.11 文献标识码 ：E
文章编号：1005-3697(2000)04-0083-02
测定血清(浆)游离血红蛋白的经典方法是以联苯胺作显色底物的 比色法。在此方法中，其血红蛋白标准液存在配制繁杂、保存时间短的缺点，加之临床样本零散，每次测定要花费很多时间配制标准液。作者通过在传统方法的基础上，用氰化高铁血红蛋白(HiCN)作标准，进行了血清游离血红蛋白测定的探索，证实血红蛋白转化为HiCN后仍有类似过氧化物酶的作用。因而，用HiCN作标准解决了原方法之不足。 现报道如下：
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂
1.1.1 氰化高铁血红蛋白转化液(试剂1)：配制同文齐氏(VanKampen-Zijlstra)液[1]。用其1/2浓度。
1.1.2 血红蛋白标准液：按常规CCl4法制备血红蛋白溶液，用HiCN法定值并稀释到10g/L之浓度。取此液1.0ml，用试剂1稀释至100ml,即为100mg/L。置4℃保存备用。
1.1.3 其余试剂同原法。[1]
1.2 方法：检测血清样本按表1进行。
2 实验结果
2.1 呈色稳定性观察：用两份血清标本和Hb标准液同时进行测定。显色后在10min、30min、50min、60min及80min用比色计比色。结果显示在1h内颜色基本不变(见表2)。
, 百拇医药
2.2 线性范围：将Hb标准液作成100、200、300、400、500、600mg/L，用721分光光度计观察本法线性关系。本法在400mg/L内线性关系良好。样品含量高于400mg/L时，应稀释重做。 10min后比色，波长500nm，蒸馏水调零，结果按下式计算：
血清游离血红蛋白(mg/L)=[Ua-Ba1(Sa-Sa×0.1)-Ba]×100
Ua:测定管光密度 Sa：标准管光密度 Ba：空白管光密度
2.3 精密度：用三份未知值血清样本，进行批内、批间各10次重复测定。结果见表3，显示精密度较好。
2.4 回收实验：在含Hb61.29mg/L的血清0.2ml中，分别加入0.02ml含量为50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准Hb液进行回收。结果为97.58%～101.11%，平均回收率为99.69%。
, 百拇医药
2.5 与原法比较：采用本操作方法与原法同时进行临床31份样本测定。结果显示本法与原法有密切正相关。
y=1.308x+6.16，r=0.9915,α=0.05,P<0.01。
2.6 干扰实验
2.6.1 胆红素的干扰：在已知值的血清标本中加入胆红素，使加入后终浓度为50mg/L和10mg/L。实验结果表明，胆红素浓度达10mg/L时可使本法光密度值减少8%。
2.6.2 抗坏血酸的干扰：[2]将抗坏血酸按20mg/L、2mg/L、0.2mg/L三种浓度，分别加入待检血清测定，结果在20mg/L时，可使原光密度值降低17.9%。
2.6.3 葡萄糖的干扰：在样本中分别加入100mg/L、200mg/L、300mg/L葡萄糖进行实验。结果对本法无影响。
, 百拇医药
2.7 抗凝剂的选择：选用含枸椽酸钠(10.90mmol/L)、EDTA(1.5g/L)、肝素(1.0g/L)的基质血清测定，结果枸椽酸钠、EDTA均可引起光密度值下降，产生干扰(α=0.05,P<0.05)，而肝素对测定结果无影响。故用血浆进行本法测定时，最好使用肝素抗凝。
2.8 正常参考范围：用本法测定正常健康体检人员67人，结果均值42.83mg/L。参考范围：42.83±3.8mg/L(x±2SD)，比原法(<40mg/L)稍高。
2.9 标准液保存时间观察：将本法配制的标准液置4℃冰箱保存，每月按样本操作并记录其光密度值。8mon后，其光密度逐渐减低。因此，此标准液在4℃可保存至少7mon。表1 按此表加入样本和试剂 试剂(ml)
测定管(U)
标准管(S)
, 百拇医药
空白管(B)
血清
0.02
-
-
转化液
0.02
-
0.02
-
Hb标准液
-
0.02
, 百拇医药
-
放置5min后
1%联苯胺
0.5
0.5
0.5
1%过氧化氢
0.5
0.5
0.5
混匀，置37℃水浴20min
10%醋酸
5.0
, 百拇医药
5.0
5.0
10min后比色，波长500nm，蒸馏水调零，结果按下式计算：
血清游离血红蛋白(mg/L)=[Ua-Ba1(Sa-Sa×0.1)-Ba]×100
Ua:测定管光密度 Sa：标准管光密度 Ba：空白管光密度表2 呈色稳定性观察 时间
10min
30min
50min
60min
80min
, 百拇医药
标准
0.50
0.50
0.50
0.495
0.49
样本1
0.80
0.80
0.80
0.79
0.78
样本2
, http://www.100md.com
1.10
1.10
1.09
1.08
1.08
2.3 精密度：用三份未知值血清样本，进行批内、批间各10次重复测定。结果见表3，显示精密度较好。表3 重复试验结果 样本
批 间
批 内
均值
SD
CV(%)
均值
, 百拇医药
SD
CV(%)
A
110.2
3.33
3.02
113.06
2.84
2.5
B
103.0
4.3
4.1
, 百拇医药
110.9
3.56
3.2
C
67.4
2.67
3.9
67.82
2.67
3.9
3 讨 论
3.1 据文献[3]报道，白蛋白可使生理盐水配制的标准Hb液光密度值减低。我们用白蛋白标准液(北京化工厂99-2)按20g/L、30g/L、40g/L、60g/L浓度加入Hb标准液中进行测定。结果在30g/L时光密度值下降5%，40g/L时下降10%，并开始出现随浓度增加而呈平缓增加的趋势。若在标准液中加入白蛋白成本颇高，作者选定近似生理浓度(40g/L)的光密度下降比值0.1作为本法白蛋白校正系数来解决这一问题。计算时将标准光密度值减去标准液值乘以系数的值。
, http://www.100md.com
3.2 波长的确定：用岛津UV-260分光光度计在400～650nm波长范围内同时对标准、样本和空白进行连续自动扫描。结果显示，在500nm处标准和样本均有最大吸收峰，因此本法选用500nm波长。原法的波长为530nm。
3.3 氰化高铁血红蛋白转化液浓度的选择：我们将文齐氏液的原浓度、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6浓度分别制成本标准血红蛋白液，按本法测定其光密度，发现从1/4开始随浓度减低其光密度值也减小。1/2的光密度值与原浓度相同，而空白值则小于原浓度且随时间的延长波动小。
按文齐氏液最大转化能力：5ml可使4mgHb(相当于常规Hb测定浓度200g/L 20μl)转化推算，1/2浓度能足够保证本法标准Hb的全部转化。故本法选用文齐氏液1/2浓度作Hb标准液的稀释液。
3.4 本文改用HiCN作标准测定血清(浆)游离血红蛋白，大大延长了血红蛋白标准的保存时间，操作更简便。实验证实，本法的线性、回收率和精密度均良好，便于临床常规检测。
参考文献：
[1] 庄威远，等.临床血液学检验[M].吉林：吉林医学院处，19 88，66.
[2] Antal Ferencz etal.Clin.Chim.Acta,1983，135～136.
[3] 王学珍，等.血浆游离血红蛋白测定——酚、4—AAP法[J].中华血液学杂志，1988，9(8)：497～498.
(收稿日期：2000-08-24), 百拇医药