哮喘大鼠淋巴细胞亚群失衡以及糖皮质激素和雷公藤对其影响
作者：孙洪涛 林江涛 王群 叶丽亚 李静 赵武述
单位：100029 北京 中日友好医院呼吸科
关键词：
中华医学杂志000429 我们采用酶联免疫斑点法在单个细胞水平上测定细胞内细胞因子的产生，研究T辅助淋巴细胞亚群(TH)TH2细胞和TH1细胞平衡的变化，以探讨TH失衡与哮喘发病的关系。
一、材料与方法
1.主要试剂与药品：卵白蛋白、莫能菌素、佛波纯酯(TPA)、依诺霉素购自美国Sigma公司；链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物(APAAP复合物)购自军事医学科学院；小鼠抗大鼠IFN-γ和IL-4单克隆抗体购自英国Seroct公司；生物素标记羊抗小鼠抗体购自美国PharMingen公司。
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2.动物分组：雄性Wistar大鼠40只，体重250～350 g，分为正常对照组10只，哮喘组10只，激素组10只、雷公藤组10只。哮喘模型采用卵蛋白建立。激素组大鼠在哮喘激发前腹腔注射地塞米松0.2 mg/kg；雷公藤组大鼠在激发前腹腔注射雷公藤多甙50 mg/kg。各组大鼠处死后，获取支气管肺泡灌洗液(BALF)和静脉血。
3.TH亚群测定方法：(1)BALF加入淋巴细胞分层液中，离心收集界面细胞；(2)温育：放入37℃温箱中培育1 h，使巨噬细胞贴壁后，吸取上清液，静脉血同样加入淋巴细胞分层液中分层以获得单个核细胞；(3)取2×106个细胞，放于培养瓶中，分别加依诺霉素、TPA、莫能菌素，放于37℃、体积分数为5% CO2下活化刺激5 h；(4)收集细胞，用涂片机涂片；(5)4%冰多聚甲醛固定；0.1%皂素通透；加封闭液；(6)按顺序加入小鼠抗大鼠单抗、生物素标记羊抗小鼠单抗、APAAP复合物、奈酚磷酸缓冲液-坚固红溶液，最后苏木精复染，明胶封片；(7)观察结果：在油镜下，阳性细胞胞浆内有成片大小不等的不规则条块或大颗粒状红色染斑，阴性细胞浆内无色。计数阳性细胞的百分数。
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4.统计学处理：计量资料均以
±s表示，组间差异显著性检验采用t检验。
二、结果
1.BALF中TH1和TH2的变化：BALF中表达IFN-γ阳性的淋巴细胞百分数代表TH1，哮喘组与正常组比较，明显下降；表达IL-4阳性的淋巴细胞百分数代表TH2，哮喘组TH2与正常组比较，明显升高。激素组与哮喘组比较，TH1明显升高，TH2明显下降雷公藤组与哮喘组比较，TH1有所升高，但差异无显著意义；而TH2明显下降(表1)。
表1 各组实验动物TH亚群分类百分数(%，±s) 组别
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鼠数
灌洗液TH1
灌洗液TH2
静脉血TH1
静脉血TH2
正常组
10
9.3±
3.2
4.9±
2.3
6.6±
, 百拇医药
1.7
3.0±
1.4
哮喘组
10
3.5±
1.7△
7.8±
3.0*
2.9±
1.5△
6.4±
, 百拇医药
2.8△
激素组
10
7.4±
3.5**
2.9±
1.5**
1.5±
1.1△△
0.6±
0.3**
雷公藤组
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10
4.8±
3.5
2.9±
2.2**
4.5±
0.8
2.9±
2.1**
注：与正常组比较△P<0.01，*P<0.05；与哮喘组比较△△P<0.05，**P<0.01
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2.静脉血中TH1和TH2的变化：哮喘组与正常组比较，TH1明显下降，TH2明显升高；激素组与哮喘组比较，TH1明显下降，TH2也明显下降，但TH2下降更明显。雷公藤组与哮喘组比较，TH1升高，但差异无显著意义；而TH2明显下降(P<0.01)。
3.BALF及静脉血中TH1/TH2比值的变化：哮喘组BALF和静脉血中TH1/TH2比值与正常组比较均明显降低。激素组BALF和静脉血中TH1/TH2比值与哮喘组比较均明显增高。雷公藤组BALF和静脉血中TH1/TH2比值与哮喘组比较均明显增高(表2)。
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表2 静脉血和BALF中TH1/TH2比值(±s) 组别
鼠数
静脉血
BALF
正常组
10
2.7±1.7
2.1±0.6
哮喘组
10
0.5±0.2△
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0.6±0.3△
激素组
10
2.8±1.9*
2.7±1.1*
雷公藤组
10
1.9±0.7*
3.1±1.9*
注：与正常组比较△P<0.01；与哮喘组比较*P<0.01 三、讨论
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1.哮喘与TH亚群的关系：TH2细胞主要分泌IL-4和IL-5。IL-4具有促进肥大细胞的生长，促进IgE合成的作用；IL-5的作用是促进嗜酸性粒细胞的分化、粘附，还可以通过抑制嗜酸性粒细胞的凋亡来延长嗜酸性粒细胞的寿命。当TH2占优势时，易于发生高IgE血症和嗜酸性粒细胞的增多及寿命的延长。TH1细胞分泌IFN-γ可抑制 TH2的增殖 ，促进自身的增殖；TH2细胞分泌的IL-4可以促进自身的增殖。Akiyoshi等[1]发现，在哮喘患者中,TH2细胞在支气管局部炎症区积聚,当吸入过敏原时,释放IL-4和IL-5,导致哮喘发作。本实验采用王前奔等[2]的方法并有所改进，TH细胞最先在CD4+T细胞中发现，故检测CD4+T细胞中IFN-γ/IL-4阳性分泌细胞应该更能反映TH细胞亚群的变化，但最近的研究发现，CD8+T细胞也有类似的TH亚群[3]。因此检测外周血单个核细胞(PBMC)中的IFN-γ/IL-4阳性分泌细胞的变化可更全面地反应TH亚群的变化。
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2.糖皮质激素治疗和TH亚群平衡的关系：本实验发现，经激素治疗后，TH1/TH2的比值无论在BALF中还是在静脉血均明显升高，说明激素对TH亚群之间的影响可能是不仅仅局限于某一类细胞，而是对TH亚群之间的平衡产生一种复杂的影响，使哮喘大鼠中原来偏向TH2的平衡向TH1方向转变，说明激素治疗哮喘的作用至少有一部分是通过改变TH亚群的平衡来实现的。
3.雷公藤治疗哮喘与TH亚群的关系：本实验发现，哮喘大鼠经雷公藤多甙治疗后，TH1/TH2的比值无论在静脉血还是在BALF中都有明显上升。说明雷公藤多甙对TH亚群平衡有一定的影响，使TH亚群平衡向TH1方向转变。所以，雷公藤对哮喘的治疗可能是通过影响TH亚群的平衡来实现的，其具体机制还有待进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Akiyoshi H.Lymphocyte phenotype and cytokine mRNA expression of steady-state asthma BALF cells.Nippon Kyoba Shikkan Gakkai Zassh，1994，32：943-950.
2，王前奔，叶丽亚，赵武述.人静脉血CD4T细胞和单个核细胞中TH1和TH2细胞免疫组化检测的初步研究.中国免疫学杂志，1997，13：5-8.
3，山村昌弘.CD8+TH2细胞とサくしツサ-T细胞と关连.临床免疫，1996，28：2459.
(收稿日期：1999-06-30), 百拇医药
单位：100029 北京 中日友好医院呼吸科
关键词：
中华医学杂志000429 我们采用酶联免疫斑点法在单个细胞水平上测定细胞内细胞因子的产生，研究T辅助淋巴细胞亚群(TH)TH2细胞和TH1细胞平衡的变化，以探讨TH失衡与哮喘发病的关系。
一、材料与方法
1.主要试剂与药品：卵白蛋白、莫能菌素、佛波纯酯(TPA)、依诺霉素购自美国Sigma公司；链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物(APAAP复合物)购自军事医学科学院；小鼠抗大鼠IFN-γ和IL-4单克隆抗体购自英国Seroct公司；生物素标记羊抗小鼠抗体购自美国PharMingen公司。
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2.动物分组：雄性Wistar大鼠40只，体重250～350 g，分为正常对照组10只，哮喘组10只，激素组10只、雷公藤组10只。哮喘模型采用卵蛋白建立。激素组大鼠在哮喘激发前腹腔注射地塞米松0.2 mg/kg；雷公藤组大鼠在激发前腹腔注射雷公藤多甙50 mg/kg。各组大鼠处死后，获取支气管肺泡灌洗液(BALF)和静脉血。
3.TH亚群测定方法：(1)BALF加入淋巴细胞分层液中，离心收集界面细胞；(2)温育：放入37℃温箱中培育1 h，使巨噬细胞贴壁后，吸取上清液，静脉血同样加入淋巴细胞分层液中分层以获得单个核细胞；(3)取2×106个细胞，放于培养瓶中，分别加依诺霉素、TPA、莫能菌素，放于37℃、体积分数为5% CO2下活化刺激5 h；(4)收集细胞，用涂片机涂片；(5)4%冰多聚甲醛固定；0.1%皂素通透；加封闭液；(6)按顺序加入小鼠抗大鼠单抗、生物素标记羊抗小鼠单抗、APAAP复合物、奈酚磷酸缓冲液-坚固红溶液，最后苏木精复染，明胶封片；(7)观察结果：在油镜下，阳性细胞胞浆内有成片大小不等的不规则条块或大颗粒状红色染斑，阴性细胞浆内无色。计数阳性细胞的百分数。
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4.统计学处理：计量资料均以
±s表示，组间差异显著性检验采用t检验。二、结果
1.BALF中TH1和TH2的变化：BALF中表达IFN-γ阳性的淋巴细胞百分数代表TH1，哮喘组与正常组比较，明显下降；表达IL-4阳性的淋巴细胞百分数代表TH2，哮喘组TH2与正常组比较，明显升高。激素组与哮喘组比较，TH1明显升高，TH2明显下降雷公藤组与哮喘组比较，TH1有所升高，但差异无显著意义；而TH2明显下降(表1)。
表1 各组实验动物TH亚群分类百分数(%，
±s) 组别, http://www.100md.com
鼠数
灌洗液TH1
灌洗液TH2
静脉血TH1
静脉血TH2
正常组
10
9.3±
3.2
4.9±
2.3
6.6±
, 百拇医药
1.7
3.0±
1.4
哮喘组
10
3.5±
1.7△
7.8±
3.0*
2.9±
1.5△
6.4±
, 百拇医药
2.8△
激素组
10
7.4±
3.5**
2.9±
1.5**
1.5±
1.1△△
0.6±
0.3**
雷公藤组
, http://www.100md.com
10
4.8±
3.5
2.9±
2.2**
4.5±
0.8
2.9±
2.1**
注：与正常组比较△P<0.01，*P<0.05；与哮喘组比较△△P<0.05，**P<0.01
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2.静脉血中TH1和TH2的变化：哮喘组与正常组比较，TH1明显下降，TH2明显升高；激素组与哮喘组比较，TH1明显下降，TH2也明显下降，但TH2下降更明显。雷公藤组与哮喘组比较，TH1升高，但差异无显著意义；而TH2明显下降(P<0.01)。
3.BALF及静脉血中TH1/TH2比值的变化：哮喘组BALF和静脉血中TH1/TH2比值与正常组比较均明显降低。激素组BALF和静脉血中TH1/TH2比值与哮喘组比较均明显增高。雷公藤组BALF和静脉血中TH1/TH2比值与哮喘组比较均明显增高(表2)。
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表2 静脉血和BALF中TH1/TH2比值(
±s) 组别鼠数
静脉血
BALF
正常组
10
2.7±1.7
2.1±0.6
哮喘组
10
0.5±0.2△
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0.6±0.3△
激素组
10
2.8±1.9*
2.7±1.1*
雷公藤组
10
1.9±0.7*
3.1±1.9*
注：与正常组比较△P<0.01；与哮喘组比较*P<0.01 三、讨论
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1.哮喘与TH亚群的关系：TH2细胞主要分泌IL-4和IL-5。IL-4具有促进肥大细胞的生长，促进IgE合成的作用；IL-5的作用是促进嗜酸性粒细胞的分化、粘附，还可以通过抑制嗜酸性粒细胞的凋亡来延长嗜酸性粒细胞的寿命。当TH2占优势时，易于发生高IgE血症和嗜酸性粒细胞的增多及寿命的延长。TH1细胞分泌IFN-γ可抑制 TH2的增殖 ，促进自身的增殖；TH2细胞分泌的IL-4可以促进自身的增殖。Akiyoshi等[1]发现，在哮喘患者中,TH2细胞在支气管局部炎症区积聚,当吸入过敏原时,释放IL-4和IL-5,导致哮喘发作。本实验采用王前奔等[2]的方法并有所改进，TH细胞最先在CD4+T细胞中发现，故检测CD4+T细胞中IFN-γ/IL-4阳性分泌细胞应该更能反映TH细胞亚群的变化，但最近的研究发现，CD8+T细胞也有类似的TH亚群[3]。因此检测外周血单个核细胞(PBMC)中的IFN-γ/IL-4阳性分泌细胞的变化可更全面地反应TH亚群的变化。
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2.糖皮质激素治疗和TH亚群平衡的关系：本实验发现，经激素治疗后，TH1/TH2的比值无论在BALF中还是在静脉血均明显升高，说明激素对TH亚群之间的影响可能是不仅仅局限于某一类细胞，而是对TH亚群之间的平衡产生一种复杂的影响，使哮喘大鼠中原来偏向TH2的平衡向TH1方向转变，说明激素治疗哮喘的作用至少有一部分是通过改变TH亚群的平衡来实现的。
3.雷公藤治疗哮喘与TH亚群的关系：本实验发现，哮喘大鼠经雷公藤多甙治疗后，TH1/TH2的比值无论在静脉血还是在BALF中都有明显上升。说明雷公藤多甙对TH亚群平衡有一定的影响，使TH亚群平衡向TH1方向转变。所以，雷公藤对哮喘的治疗可能是通过影响TH亚群的平衡来实现的，其具体机制还有待进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Akiyoshi H.Lymphocyte phenotype and cytokine mRNA expression of steady-state asthma BALF cells.Nippon Kyoba Shikkan Gakkai Zassh，1994，32：943-950.
2，王前奔，叶丽亚，赵武述.人静脉血CD4T细胞和单个核细胞中TH1和TH2细胞免疫组化检测的初步研究.中国免疫学杂志，1997，13：5-8.
3，山村昌弘.CD8+TH2细胞とサくしツサ-T细胞と关连.临床免疫，1996，28：2459.
(收稿日期：1999-06-30), 百拇医药
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