仙灵骨葆对卵巢切除大鼠骨组织形态学的影响
作者：赵咏芳 石印玉 沈培芝 徐宇 王海彬
单位：赵咏芳 石印玉(上海曙光医院 200021)；沈培芝 徐宇(上海中医药研究院骨伤科研究所)；王海彬(广州中医药大学博士后流动站)
关键词：骨质疏松症；中医药疗法；仙灵骨葆；治疗应用；骨；病理学；骨；组织形态学；实验研究；动 物；大鼠
中医正骨000401 提要 采用卵巢切除的方法建立原发性骨质疏松症的动物模型，观察中药仙灵骨葆和西药倍美力对 去势大鼠骨组织光镜、电镜及骨组织形态计量学等指标的影响。结果表明，应用仙灵骨葆治 疗以后，模型大鼠的骨组织形态学发生明显改变，单位面积内骨小梁的体积增加，骨小梁宽 度增加，但骨小梁之间的间距并不减少，在光镜和电镜下可以观察到类似改变，与所 应用对照药物倍美力的治疗效果相似，无统计学差异。说明仙灵骨葆可以在一定程度上改善 骨质疏松大鼠的骨结构，恢复骨组织的形态，在骨质疏松症的治疗中发挥作用。
, http://www.100md.com
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1001-6015(2000)04-0003-03
THE EFFECT OF “XIANLING GUBAO” ON BONE HISTOMORPHOLOGY IN OVARIECTOMIZED RATS
Zhao Yongfang Shi Yinyu Shen Peizhi，et al
Shanghai Shuguang Hospital,Shanghai 200021
Rat models of primary osteoporosis were made by ovariectomy and treated by “XIANLING GUBAO”(XLGB, a TCD preparation) and Premarin (the control Western drug), respectively. Then, the bone tissues of the modelled rats were observed by optical and electronic microscopes and analyzed by histomorphometry. The results showed an obvious change of the bone histomorphology of the rat models treated by XLGB: increased bone trabecula volume and width per unit area but no bone trabecula space decrease. The similar changes were observed under optical and electronic microscopes, being similar with the therapeutic effect of Premarin, the control drug, without a statistical difference. It was concluded that XLGB could improve the bone structure of osteoporosis rats and restore the bone histomorphology to a certain extent and play the role in the treatment of osteoporosis.
, 百拇医药
Key Words: osteoporosis/TCM therapy “XIANLING GUBAO”/therapeutic application bone histomorphology experimental study animal rat
骨质疏松症是影响中老年人生活质量的一类重要疾病，通过建立骨质疏松症的动物模型，筛 选有效治疗药物，探索药物的作用机理无疑具有重要意义。仙灵骨葆胶囊是经临床初步验证 有效的中药制剂，我们通过观察其对去势大鼠骨组织形态学的影响，了解仙灵骨葆胶囊在恢 复骨结构方面的作用。
1 材料与方法
1.1 药物 仙灵骨葆胶囊(96黔卫药准字100019，贵州仙灵药业有限公司产品)。倍美力(96卫药准字J- 35号，美国惠氏艾尔斯特公司大药厂产品)。
1.2 实验动物及饲养 10月龄健康雌性SD大鼠36只，体重350±20g(由上海中医药大学实验动物部提供，合 格证号01597)。各组大鼠分笼饲养，自由摄取标准大鼠饲 料，自由饮用蒸馏水，室温22±2℃。
, 百拇医药
1.3 动物分组与处理 将实验大鼠随机分为4组，氯胺酮腹腔麻醉，采用背侧切口，无菌条件下切开皮肤、皮下组 织，摘除双侧卵巢。假切除组只切除一小块腹腔脂肪组织。手术后，每只每天给予注射用青 霉素钠盐 5万单位，肌肉注射3天。术后3个月进行药物治疗，假切除组和模型组均给予生理盐水口 服，倍美力组和仙灵骨葆组按照体表面积法折算人等效剂量口服。各组大鼠服药3个月后处 死，进行各项指标检测。
1.4 光镜观察 大鼠处死以后，每组取3个右侧胫骨，去除附着的软组织，立即放入10%福尔马林中固定24小 时，脱钙，石蜡包埋，在YL3回转式切片机(上海仪表厂产品)上切片，沿胫骨矢状面切成10 μm厚度切片，HE染色，在Olympus光镜下观察骨小梁的形态结构〔1〕。
1.5 扫描电镜观察 大鼠处死后每组取3个第1腰椎标本，去除附着软组织，置于2%的戊二醛溶液中固定24小时 ，8%的中性EDTA脱钙7天，10%次氯酸钠溶液浸泡8小时，1%四氯化锇溶液固定2小时，乙醇逐级脱水，醋酸异戊酯保存12小时，二氧化碳临界点干燥、真 空喷金，在JMS-840扫描电镜上观察骨小梁的形态结构 〔2〕。
, 百拇医药
1.6 骨组织形态计量学研究 大鼠处死后取左侧胫骨，去除附着的软组织，立即放入Millonig's液体中固定24小时。乙醇 逐级脱水，每次24小时，最后二甲苯透吸4小时，甲基丙烯酸甲酯包埋。在Polycnt-s型硬 组 织切片机上沿胫骨矢状面切10μm厚度切片。切片做甲苯胺蓝染色，参照Parfitt等人 〔3〕骨小梁参数计量方法，借助VIDAS图象分析系统进行测量，参数包括骨小梁的体 积(total bone volume,TBV)、骨小梁的宽度(bone trabecula thickness,Th.T)、骨小梁的 间隙(bone trabecula separation ,Th.S)。
1.7 统计学处理 各组大鼠所有观察结果均以均数±标准差(
±s)表示，两组均数之 间比较采用t检验。
2 结果
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2.1 光镜观察结果 光镜观察结果显示假切除组骨小梁排列密集，互相连接成网状结构，骨小梁的厚度大，其间 距小；切除卵 巢以后大鼠骨小梁明显稀少，同样倍数下骨小梁的连接中断点多，骨小梁明显变细，间 距加宽，甚至在部分区域出现较大的空白区域(图1AB)。应用仙灵骨葆治疗以后，骨小梁 排列密集，之间的连接明显增加，厚度 增宽，间隙变窄，三维结构恢复，与假切除组、倍美力组的表现类似( 图1CD)。
图1 光镜片 (A)假切除组；(B)模型组：(C)仙灵骨葆组；(D)倍美力组 ×40
2.2 扫描电镜观察结果 扫描电镜观察结果显示假切除组骨小梁排列以纵向为主，并有横向骨小梁 连接，构成立体网状 ，骨小梁间距小；切除卵巢后大鼠骨小梁明显变细，且排列稀疏，骨小梁之间的间隙增宽， 部分区域的骨小梁出现断裂，残端游离，连接中断，三维结构破坏，并出现骨 小梁的空缺区域。仙灵骨葆治疗后，可以见到不同程度的改善，骨小梁排列较密集，其 间的连接明显增多，空间结构得到恢复(图2)。
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图2 L1椎体扫描电镜片 (A)假切除组：(B)模型组；(C)仙灵骨葆组
2.3 骨形态计量学结果 骨形态计量学观察显示切除卵巢以后，单位体积内骨小梁减少，厚度变窄，间距加宽，与假切除组 比有显著性差异；应用仙灵骨葆治疗以后，单位体积内的骨小梁量明显增加，厚度明显加宽，与假切除组和倍美力组比较无差异；但骨小梁之间的间距并未变窄，与切卵巢组比较无统计学差异。
附表 骨形态计量学结果 组 别
数量
TBV(%)
Th.T(μm.10-2)
Th.S(μm.10-1 )
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假切除组
6
38.433±2.391
453.928±88.545
600.321± 193.655
切卵组
6
31.468±1.864#
368.445±34 .117＃
806.365±108.930＃
倍美力组
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6
41.962±9.680*
460.879±68.810*
657.601±164.340
仙灵骨葆组
6
36.468±6.412*△
453.480±97.123*△
748.109±114.263
注 *：与切卵巢组比较P<0.05，有显著性差异；＃：与假切除组比较P<0.05，有显著性差异；△与假切除组比较P>0.05，无统计学差异。
, 百拇医药
3 讨论
骨质疏松症(osteoporosis)的概念于1885年由Pommer首先提出，其意为骨质减少的一种疾病 。 1948年，Albright认为这种病是由于雌激素减少，导致骨小梁形成减少、蛋白质代谢异常的 一种疾病〔4〕。早期对骨质疏松症的认识仅限于骨量的丢失，在治疗上强调提高 骨 量。随着检测手段的进步和认识的深入，对骨质疏松症的概念的研究开始扩展到骨结构上， 强调恢复骨结构的重要性，因此1994年WHO组织对骨质疏松症的概念进行重新定义〔5〕 ，指出“骨质疏松症是以骨组织的量减少，骨的显微结构退化，导致骨的脆性增加，易于 骨折的一类疾病”。决定骨折的主要因素为骨骼强度，我们的另一项研究表明，骨量与骨骼 强度的改变并不 平行，从20岁到80岁椎体骨密度约减少50%，而垂直压缩强度却只减少到20岁的25%，水平压 缩强度减少到只有5%。现代临床通过对骨量在正常范围内而发生髋部骨折的患 者进行骨结构的观察，发现其骨小梁发生明显的结构改变，从而指出由于骨结构的退化所引 起的骨折危险性的增加要高于由骨量减低所引起的骨折危险性〔6〕。
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卵巢切除以后，由于雌激素水平迅速下降，破骨细胞功能活跃，骨吸收增加，而由成骨细胞 形成的新骨数量难以弥补破骨细胞所形成的骨陷窝。同时，在骨转换过程中存在着短暂的骨 丢失，雌激素水平降低引起的高转换状态不仅加速负平衡引起的骨丢失，同时也增加了暂时 的骨 丢失，从而造成骨结构上明显的改变。在静力学参数上表现为骨小梁体积减少，骨小梁厚 度变窄，间隙增加；在光镜、电镜下出现三维结构的变化为小梁之间的连接减少，游离 末端增加，甚至出现空隙，导致难以修复的损伤〔6〕。
中医药治疗骨质疏松症多以补肾为主要治疗原则，“肾主骨”，补肾即是强骨。仙灵骨葆 胶囊由黔岭藿、骨碎补等药物组成，通过发挥黔岭藿“益气力，强志，坚筋骨”，从而使“ 元阳振作”，单位体积内的骨小梁量增加，小梁厚度增加，结构得到一定程度的恢复。根据 我们的实验结果可以看出，骨结构的代偿有一定限度，无论是倍美力还是仙灵骨葆，都只 能使骨小梁的宽度增加，并不能恢复骨小梁之间较宽的间距，说明当骨质疏松严重时，即使 增加骨量，也只能使骨结构得到部分恢复，而无法恢复到原来的状态。因此骨质疏松症的治 疗应重视预防，在骨结构尚未发生明显退变时就应给予治疗，维护骨结构的效果 要优于骨结构已明显退化、骨质疏松症严重时方给予治疗。
, 百拇医药
参考文献
1，汪青春，沈培芝，徐宇，等。不同方药治疗膝骨关节炎的组织形态学对比研 究。中国中医骨伤科 1998；6(2)：1
2，谢华，吴铁，李青南，等。芪藿肾宝抗泼尼松所致大鼠松质骨结构破坏的作 用。中国骨质疏松杂志 1998；4(3)：54
3，Parfitt MA,Mathews CHE,Villaneuva AR.Relati onship between surface ,volume and thickness of iliac traecular bone in aging and in osteoporosis.J Clin Invest 1 983；72：1396
4，刘忠厚。骨质疏松症。北京：化学工业出版社，1992，173
, 百拇医药 5，靳家玉，译。关于绝经的研究。世界卫生组织编。北京：人民卫生出版社，1 985；50
6，Mosekilde L.Sex differences in age-related loss of Vertebral trabecular bone mass and structure-biomechanical consequen ces.Bone 1989，10：425
7，沈培芝，陈东煜，张戈，等。补肾方防治地塞米松致雄性大鼠骨质疏松及其 生化机制探讨。中国中西医结合杂志 1998，18(5)：290
8，Cummings SR .Are patients with hip fractur e more osteoporotic ?Am J Med 1985，78：487
(1999-12-14收稿 2000-02-15修回), 百拇医药
单位：赵咏芳 石印玉(上海曙光医院 200021)；沈培芝 徐宇(上海中医药研究院骨伤科研究所)；王海彬(广州中医药大学博士后流动站)
关键词：骨质疏松症；中医药疗法；仙灵骨葆；治疗应用；骨；病理学；骨；组织形态学；实验研究；动 物；大鼠
中医正骨000401 提要 采用卵巢切除的方法建立原发性骨质疏松症的动物模型，观察中药仙灵骨葆和西药倍美力对 去势大鼠骨组织光镜、电镜及骨组织形态计量学等指标的影响。结果表明，应用仙灵骨葆治 疗以后，模型大鼠的骨组织形态学发生明显改变，单位面积内骨小梁的体积增加，骨小梁宽 度增加，但骨小梁之间的间距并不减少，在光镜和电镜下可以观察到类似改变，与所 应用对照药物倍美力的治疗效果相似，无统计学差异。说明仙灵骨葆可以在一定程度上改善 骨质疏松大鼠的骨结构，恢复骨组织的形态，在骨质疏松症的治疗中发挥作用。
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中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1001-6015(2000)04-0003-03
THE EFFECT OF “XIANLING GUBAO” ON BONE HISTOMORPHOLOGY IN OVARIECTOMIZED RATS
Zhao Yongfang Shi Yinyu Shen Peizhi，et al
Shanghai Shuguang Hospital,Shanghai 200021
Rat models of primary osteoporosis were made by ovariectomy and treated by “XIANLING GUBAO”(XLGB, a TCD preparation) and Premarin (the control Western drug), respectively. Then, the bone tissues of the modelled rats were observed by optical and electronic microscopes and analyzed by histomorphometry. The results showed an obvious change of the bone histomorphology of the rat models treated by XLGB: increased bone trabecula volume and width per unit area but no bone trabecula space decrease. The similar changes were observed under optical and electronic microscopes, being similar with the therapeutic effect of Premarin, the control drug, without a statistical difference. It was concluded that XLGB could improve the bone structure of osteoporosis rats and restore the bone histomorphology to a certain extent and play the role in the treatment of osteoporosis.
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Key Words: osteoporosis/TCM therapy “XIANLING GUBAO”/therapeutic application bone histomorphology experimental study animal rat
骨质疏松症是影响中老年人生活质量的一类重要疾病，通过建立骨质疏松症的动物模型，筛 选有效治疗药物，探索药物的作用机理无疑具有重要意义。仙灵骨葆胶囊是经临床初步验证 有效的中药制剂，我们通过观察其对去势大鼠骨组织形态学的影响，了解仙灵骨葆胶囊在恢 复骨结构方面的作用。
1 材料与方法
1.1 药物 仙灵骨葆胶囊(96黔卫药准字100019，贵州仙灵药业有限公司产品)。倍美力(96卫药准字J- 35号，美国惠氏艾尔斯特公司大药厂产品)。
1.2 实验动物及饲养 10月龄健康雌性SD大鼠36只，体重350±20g(由上海中医药大学实验动物部提供，合 格证号01597)。各组大鼠分笼饲养，自由摄取标准大鼠饲 料，自由饮用蒸馏水，室温22±2℃。
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1.3 动物分组与处理 将实验大鼠随机分为4组，氯胺酮腹腔麻醉，采用背侧切口，无菌条件下切开皮肤、皮下组 织，摘除双侧卵巢。假切除组只切除一小块腹腔脂肪组织。手术后，每只每天给予注射用青 霉素钠盐 5万单位，肌肉注射3天。术后3个月进行药物治疗，假切除组和模型组均给予生理盐水口 服，倍美力组和仙灵骨葆组按照体表面积法折算人等效剂量口服。各组大鼠服药3个月后处 死，进行各项指标检测。
1.4 光镜观察 大鼠处死以后，每组取3个右侧胫骨，去除附着的软组织，立即放入10%福尔马林中固定24小 时，脱钙，石蜡包埋，在YL3回转式切片机(上海仪表厂产品)上切片，沿胫骨矢状面切成10 μm厚度切片，HE染色，在Olympus光镜下观察骨小梁的形态结构〔1〕。
1.5 扫描电镜观察 大鼠处死后每组取3个第1腰椎标本，去除附着软组织，置于2%的戊二醛溶液中固定24小时 ，8%的中性EDTA脱钙7天，10%次氯酸钠溶液浸泡8小时，1%四氯化锇溶液固定2小时，乙醇逐级脱水，醋酸异戊酯保存12小时，二氧化碳临界点干燥、真 空喷金，在JMS-840扫描电镜上观察骨小梁的形态结构 〔2〕。
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1.6 骨组织形态计量学研究 大鼠处死后取左侧胫骨，去除附着的软组织，立即放入Millonig's液体中固定24小时。乙醇 逐级脱水，每次24小时，最后二甲苯透吸4小时，甲基丙烯酸甲酯包埋。在Polycnt-s型硬 组 织切片机上沿胫骨矢状面切10μm厚度切片。切片做甲苯胺蓝染色，参照Parfitt等人 〔3〕骨小梁参数计量方法，借助VIDAS图象分析系统进行测量，参数包括骨小梁的体 积(total bone volume,TBV)、骨小梁的宽度(bone trabecula thickness,Th.T)、骨小梁的 间隙(bone trabecula separation ,Th.S)。
1.7 统计学处理 各组大鼠所有观察结果均以均数±标准差(
±s)表示，两组均数之 间比较采用t检验。2 结果
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2.1 光镜观察结果 光镜观察结果显示假切除组骨小梁排列密集，互相连接成网状结构，骨小梁的厚度大，其间 距小；切除卵 巢以后大鼠骨小梁明显稀少，同样倍数下骨小梁的连接中断点多，骨小梁明显变细，间 距加宽，甚至在部分区域出现较大的空白区域(图1AB)。应用仙灵骨葆治疗以后，骨小梁 排列密集，之间的连接明显增加，厚度 增宽，间隙变窄，三维结构恢复，与假切除组、倍美力组的表现类似( 图1CD)。
图1 光镜片 (A)假切除组；(B)模型组：(C)仙灵骨葆组；(D)倍美力组 ×40
2.2 扫描电镜观察结果 扫描电镜观察结果显示假切除组骨小梁排列以纵向为主，并有横向骨小梁 连接，构成立体网状 ，骨小梁间距小；切除卵巢后大鼠骨小梁明显变细，且排列稀疏，骨小梁之间的间隙增宽， 部分区域的骨小梁出现断裂，残端游离，连接中断，三维结构破坏，并出现骨 小梁的空缺区域。仙灵骨葆治疗后，可以见到不同程度的改善，骨小梁排列较密集，其 间的连接明显增多，空间结构得到恢复(图2)。
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图2 L1椎体扫描电镜片 (A)假切除组：(B)模型组；(C)仙灵骨葆组
2.3 骨形态计量学结果 骨形态计量学观察显示切除卵巢以后，单位体积内骨小梁减少，厚度变窄，间距加宽，与假切除组 比有显著性差异；应用仙灵骨葆治疗以后，单位体积内的骨小梁量明显增加，厚度明显加宽，与假切除组和倍美力组比较无差异；但骨小梁之间的间距并未变窄，与切卵巢组比较无统计学差异。
附表 骨形态计量学结果 组 别
数量
TBV(%)
Th.T(μm.10-2)
Th.S(μm.10-1 )
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假切除组
6
38.433±2.391
453.928±88.545
600.321± 193.655
切卵组
6
31.468±1.864#
368.445±34 .117＃
806.365±108.930＃
倍美力组
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6
41.962±9.680*
460.879±68.810*
657.601±164.340
仙灵骨葆组
6
36.468±6.412*△
453.480±97.123*△
748.109±114.263
注 *：与切卵巢组比较P<0.05，有显著性差异；＃：与假切除组比较P<0.05，有显著性差异；△与假切除组比较P>0.05，无统计学差异。
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3 讨论
骨质疏松症(osteoporosis)的概念于1885年由Pommer首先提出，其意为骨质减少的一种疾病 。 1948年，Albright认为这种病是由于雌激素减少，导致骨小梁形成减少、蛋白质代谢异常的 一种疾病〔4〕。早期对骨质疏松症的认识仅限于骨量的丢失，在治疗上强调提高 骨 量。随着检测手段的进步和认识的深入，对骨质疏松症的概念的研究开始扩展到骨结构上， 强调恢复骨结构的重要性，因此1994年WHO组织对骨质疏松症的概念进行重新定义〔5〕 ，指出“骨质疏松症是以骨组织的量减少，骨的显微结构退化，导致骨的脆性增加，易于 骨折的一类疾病”。决定骨折的主要因素为骨骼强度，我们的另一项研究表明，骨量与骨骼 强度的改变并不 平行，从20岁到80岁椎体骨密度约减少50%，而垂直压缩强度却只减少到20岁的25%，水平压 缩强度减少到只有5%。现代临床通过对骨量在正常范围内而发生髋部骨折的患 者进行骨结构的观察，发现其骨小梁发生明显的结构改变，从而指出由于骨结构的退化所引 起的骨折危险性的增加要高于由骨量减低所引起的骨折危险性〔6〕。
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卵巢切除以后，由于雌激素水平迅速下降，破骨细胞功能活跃，骨吸收增加，而由成骨细胞 形成的新骨数量难以弥补破骨细胞所形成的骨陷窝。同时，在骨转换过程中存在着短暂的骨 丢失，雌激素水平降低引起的高转换状态不仅加速负平衡引起的骨丢失，同时也增加了暂时 的骨 丢失，从而造成骨结构上明显的改变。在静力学参数上表现为骨小梁体积减少，骨小梁厚 度变窄，间隙增加；在光镜、电镜下出现三维结构的变化为小梁之间的连接减少，游离 末端增加，甚至出现空隙，导致难以修复的损伤〔6〕。
中医药治疗骨质疏松症多以补肾为主要治疗原则，“肾主骨”，补肾即是强骨。仙灵骨葆 胶囊由黔岭藿、骨碎补等药物组成，通过发挥黔岭藿“益气力，强志，坚筋骨”，从而使“ 元阳振作”，单位体积内的骨小梁量增加，小梁厚度增加，结构得到一定程度的恢复。根据 我们的实验结果可以看出，骨结构的代偿有一定限度，无论是倍美力还是仙灵骨葆，都只 能使骨小梁的宽度增加，并不能恢复骨小梁之间较宽的间距，说明当骨质疏松严重时，即使 增加骨量，也只能使骨结构得到部分恢复，而无法恢复到原来的状态。因此骨质疏松症的治 疗应重视预防，在骨结构尚未发生明显退变时就应给予治疗，维护骨结构的效果 要优于骨结构已明显退化、骨质疏松症严重时方给予治疗。
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参考文献
1，汪青春，沈培芝，徐宇，等。不同方药治疗膝骨关节炎的组织形态学对比研 究。中国中医骨伤科 1998；6(2)：1
2，谢华，吴铁，李青南，等。芪藿肾宝抗泼尼松所致大鼠松质骨结构破坏的作 用。中国骨质疏松杂志 1998；4(3)：54
3，Parfitt MA,Mathews CHE,Villaneuva AR.Relati onship between surface ,volume and thickness of iliac traecular bone in aging and in osteoporosis.J Clin Invest 1 983；72：1396
4，刘忠厚。骨质疏松症。北京：化学工业出版社，1992，173
, 百拇医药 5，靳家玉，译。关于绝经的研究。世界卫生组织编。北京：人民卫生出版社，1 985；50
6，Mosekilde L.Sex differences in age-related loss of Vertebral trabecular bone mass and structure-biomechanical consequen ces.Bone 1989，10：425
7，沈培芝，陈东煜，张戈，等。补肾方防治地塞米松致雄性大鼠骨质疏松及其 生化机制探讨。中国中西医结合杂志 1998，18(5)：290
8，Cummings SR .Are patients with hip fractur e more osteoporotic ?Am J Med 1985，78：487
(1999-12-14收稿 2000-02-15修回), 百拇医药