CagA基因对胃粘膜上皮细胞增殖和凋亡的影响
作者：卢世云 潘秀珍 彭孝伟 施作霖 林 棱 陈明红
单位：卢世云 潘秀珍 彭孝伟 林 棱 陈明红(福建省立医院消化内科福建省福州市 350001)；施作霖(福建省立医院 病理科 福建省福州市 350001)
关键词：胃疾病；胃粘膜；cagA基因；螺杆菌感染
摘 要摘 要：目的 观察不同基因型Hp感染对胃上皮细胞增殖和凋亡的影响，进而探讨Hp增加胃癌发生危险性的机制。方法 研究对象为19例Hp阴性的慢性浅表性胃炎和37例Hp阳性的慢性浅表性胃炎患者应用ki-67免疫组化技术评价胃幽门窦上皮细胞增生，用切口末端标记法(TUNEL)检测胃上皮细胞凋亡，应用聚合酶链反应(PCR)技术检测Hp的cagA基因。结果 Hp阳性患者的增殖指数(LI)和凋亡指数(AI)显著高于Hp阴性者(17±4对7.3±3.3和11.3±3.8对6.6±1.2，P<0.01)，cagA+或cagA-患者的LI和AI均显著高于Hp-患者，cagA+患者(n=27)的LI明显高于cagA-Hp患者(n=10)(18.6±5.8对13.8±4.2，P<0.05)，而AI则明显低于cagA-Hp患者(8.9±3.2对12.2± 4.6，P<0.01).LI和Al与胃粘膜炎症程度无明显关系。结论 Hp感染诱导胃上皮细胞过度增殖和凋亡，cagA-Hp与cagA-Hp促增殖和凋亡作用的能力明显不同。
Effect of Hp infection on gastric epithelial cell kinetics in stomach diseases
Shi Yun Lu ,Xiu Zhen Pan , Xiao Wei Peng
(Department of Gastroenterology,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350001,Fujian Province,China)
Zuo Lin Shi
(hi Yun Lu,Department of Gastroenterology,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350001,Fujian Province,China)
Ling Lin ,Ming Hong Chen
(Department of Gastroenterology,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350001,Fujian Province,China)
Abstract：AIM To investigate the effects of different genotype Helicobacter pylori (Hp) infection on the gastric epithelial cell proliferstion and apoptosis and further investigate the mechanisms of Hp increasing the risk for the development of gastric cancer. Methods Endoscopic gastric mucosal biopsies were taken from 19 cases of Hp negative chronic superficial gastritis and 37 Hp positive chronic superficial gastritis. The gastric antral epithelial cell proliferation was evaluated by ki-67 immunohistochemical technique and apoptosis cells in the gastric mucosa were quantitated after terminal deoxynucleotidyl transferase mediated Dutp nick end-labelling and Hp cagA gene was detected by polymerase chain reaction (PCR).RESULTS Ki-67 labelling index (LI) and apoptosis index (Al) of Hp positive patients were significantly higher than that of Hp negative patients ( l7±4 vs 7.3±3.3 and 11.3±3.8 vs 6.6±1.2, P0.05) and much lower Al (8.9±3.2 vs 12.2±4.6, P<0.01 ) than that infected with cagA-Hp(n=10). There was no correlation between LI or Al and the severity of gastritis,EONCLUSION Hp infection induced gastric epithelialhyperproliferation and apoptosis, cagA+Hp and cagA-Hp had different ability of inducing proliferation and apoptosis.
Keywords：stomach disease; gastricmucosa; cagA gene; Helicobacter infection
0引言1994年世界卫生组织明确将幽门螺杆菌(Hp)定为Ⅰ类致癌因子，本实验室研究已提示Hp感染主要在胃癌发生的起始阶断起作用[1]，人群的Hp感染率较高，然而仅小部分Hp感染患者最终发展为胃癌，这可能与宿主对细菌的反应及特定细菌产物的表达不同有关.而cagA基因作为Hp的毒力基因，与Hp的致病密切相关.不少研究证明cagA+Hp明显增加萎缩性胃炎和胃癌发生的危险性[2，3].我们应用PCR技术对Hp进行基因分型，通过观察Hp感染及其不同基因型对胃粘膜上皮细胞增殖和凋亡的影响，进而探讨Hp感染增加胃癌发生危险性的机制。1材料和方法1.1材料经内镜及胃粘膜病理确诊的慢性浅表性胃炎患者56例，Hp阳性37例，Hp阴性19例，男32例，女24例，年龄23岁～75岁，平均43.5岁.前3mo内进行过Hp根治疗法、用过非甾体类抗炎药或抗生素治疗等患者均不包括在本研究中。1.2方法1.2.1标本来源及Hp感染的诊断和基因分型每例患者取6块胃粘膜(胃窦部5块，胃体1块)，用于快速尿素酶试验(试剂由福建三强公司提供)、PCR检测Hp的ureA基因和cagA基因、Warthin-Starry银染色、病理组织学检查及进行增生和凋亡分析.HpDNA经PCR扩增后，20mL/L琼脂糖凝胶电泳显示一条清晰的条带.ureA片段约长411bp，cagA片段约为349bp.Warthin-Starry银染色见到典型形态者或快速尿素酶试验和ureA基因两项阳性者即诊断为Hp感染.Hp阴性的标准是上述3项检查均为阴性.根据cagA基因将Hp分为cagA-与cagA-两型.1.2.2组织学检查胃窦活检标本常规石蜡包埋，连续切片，脱蜡至水化，行HE染色，根据悉尼系统将胃粘膜炎症分为轻、中、重3级.1.2.3胃粘膜上皮细胞增殖的检测采用链霉素亲生物素-过氧化物酶(SP)法免疫组化方法检测ki-67抗原，所有试剂均购自福州迈新生物技术公司.高压修复抗原，PBS代替一抗作阴性对照.每张切片至少观察5个以上高倍视野，1000个以上完整上皮细胞，计算每100个上皮细胞内的阳性细胞数，即为增殖指数LI.1.2.4胃粘膜上皮细胞凋亡的检测应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的Dutp切口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞.试剂盒(Insitucelldeathdetectionkit，AP)为德国宝灵曼公司产品.蛋白酶K、正常血清、BCIP、核快红均购自福州迈新生物技术公司.操作步骤简述如下：石蜡切片常规脱蜡至水化，20μm/Ml蛋白酶K室温消化15min，PBS洗5min×3次，100mL/L非免疫羊血清封闭15min，加Tunel反应液，37°C湿盒中孵育1h；PBS洗5min×3次，滴加碱性磷酸酶连接的荧光素抗体，37°C湿盒中反应30min；PBS洗5min×3次，BClP显色10min，核快红复染，脱水、透明、封片.用DNA酶处理过的切片作阳性对照，以PBS代替Tunel反应液作阴性对照.细胞核中出现紫蓝色颗粒者为阳性.每张切片至少观察5个以上高倍视野，1000个以上完整上皮细胞，计算每100个上皮细胞内的阳性细胞数，即为凋亡指数(Apoptoticlndex，AI).Hp感染的诊断、组织学、细胞增殖、细胞凋亡的观察采用双盲法。统计学处理两样本均数比较采用t检验进行显著性检验，多样本均数的比较及均数的两两比较采用方差分析.统计取值为均数±标准差(±s%)。2结果2.1Hp感染及cagA基因对胃粘膜上皮细胞增殖的作用37例Hp+患者检出cagA-者27例，Hp+患者于整个胃小凹包括小凹的顶部都可见到ki-67阳性细胞，cogA-者更为明显.Hp+患者的LI明显高于Hp-患者(17±4对7.3±3.3，PO.05)，而后者又明显高于Hp-患者(P<0.01)，cagA+Hp，cagA-Hp，Hp-三组患者胃粘膜上皮细胞LI两两比较结果(表1).表1cagA+Hp，cagA-Hp，Hp-三组LI的Q值检验表P0.01,cagA-vscagA+P>0.05,cagA-vsHp2.3胃粘膜炎症程度与细胞增殖和凋亡的关系Hp阳性或阴性患者的LI和AI与胃粘膜炎症程度无明显关系(表3，4).P>0.05，vs组间。2讨论正常胃粘膜上皮细胞凋亡与增殖一起维持细胞生理动态平衡.细胞凋亡与增殖的异常与多种疾病特别是肿瘤的发生有密切关系.有关Hp对细胞增殖作用的报道不一，大多数体外试验显示Hp能抑制细胞增殖[4]，但多数人体内胃粘膜细胞研究显示Hp能促进细胞增殖[5].我们的研究结果支持Hp感染促进细胞增殖，与后者结论一致.Hp对增殖作用的研究结果不一致的可能原因是Hp的促增殖作用是Hp持续感染的临床研究，而抑制增殖是Hp中介的急性实验研究，另外也可能与体内外不同的环境因素有关.另外我们发现细胞增殖指数与胃粘膜炎症程度无关，从而支持Hp的促增殖作用为Hp的直接作用.Hp感染促进胃上皮细胞凋亡已为大多数学者所证实[6],Hp感染促进胃上皮细胞凋亡好象与Hp感染促进胃癌发生相矛盾，但是有研究表明，许多致癌因素如放射线、病毒、化学致癌物早期都能引起细胞凋亡增加，而细胞凋亡增加，刺激胃粘膜细胞增生，加速细胞更新，容易产生抵抗凋亡的细胞，随后才出现细胞凋亡的抑制，进而导致优势细胞过度增生，有利于肿瘤的形成.这能合理解释Hp感染增加胃癌发生危险性.我们还发现HP感染的促凋亡作用与胃粘膜炎症程度无关，说明Hp感染诱导凋亡为Hp的直接作用.Hp有两个毒力基因，vacA基因和cagA基因，分别表达两个毒力因子：87KDa的细胞空泡毒素(vacA)和(120～140)Kda细胞空泡毒素相关蛋白(cagA).关于cagA基因在细胞增殖和凋亡中的作用尚缺泛深入的研究，我们应用PCR技术对Hp进行基因分型.我们的研究结果显示不管cagA+Hp或cagA-Hp感染患者的LI和AI均较Hp-患者高，这说明Hp的促凋亡作用除与cagA基因有关外，还有其他因素的参与.另外我们还发现cagA+菌株较cagA-菌株具有较强的促增殖作用和更低的促凋亡作用，与Peeketal报道一致[7].这一发现能很好解释cagA+菌株感染进—步增加Hp致癌的危险性.因cagA+Hp患者较高的细胞增殖和相对低的细胞凋亡有助于增加基因突变细胞的保留及随后肿瘤形成的危险性，并最终向肿瘤方向发展，cagA+Hp更强的促增殖作用及相对低的促凋亡作用的详细机制尚不清楚，有待进一步的研究，而有文献报道可能与picB基因及NF-Kb的参与有关[8].Hp感染引起胃上皮细胞过度增殖和凋亡的具体机制尚不明确，推测乃Hp脂多糖、Hp产生的毒素(cagA，vacA)，尿素酶分解尿素产生的氨、Hp感染后单氯胺的产生及炎症反应释放的细胞因子和氧自由基、胃腔中维生素C含量减低、一些生长因子(EGF，TGF-a)、癌基因(bcl-2，ras)和肿瘤抑制基因(p53)等多种因素综合作用的结果。
作者简介：卢世云，男，1970年10月出生，江西万载县人，汉族，1999年福建医科大学消化内科学硕士毕业，主要从事幽门螺杆菌感染的基础与临床研究，发表论文1篇。
参考文献：
[1]Lu SY, Par XZ, Peng XW, Shi ZL Effect of Hp infection on gastric epithelial cell kinetics in stomach diseases.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7:760-762
[2]Figura N,Vindigni C,Covacci A,Presenti L,Burroni D,Vernillo R,Banducci T,Roviello F,Marrelli D,Biscontri M,Kristodhullu S,Gennari C,Vaira D.cagA positive and negative Helicobacter pylori strains are simultaneously present in the stomach of most patients with non-ulcer dyspepsia:relevance to histological damage.Gut,1998;42:772-778
[3]Shimoyama T,Fukuda S,Tanaka M,Mikami T,Munakata A,Crabtree JE.CagA seropositivity associated with development of gastric cancer in a Japanese Population,J Clin Pathol,1998;51:225-228
[4]Ricci V, Ciacci C,Zarrilli R,Sommi P,Tummuru MKR,Baanco CDV,Bruni CB,Cover TL,Blaser MJ,Romano M.Effect of Helicobacter Pylori on gastric epithelial cell migration and proliferation in uitro:role of VacA and CagA.Infect Immmun,1996;65:2829-2833
[5]Jones NL,Shannon PT,Cutz E,Yeger H,Sherman PM.Increase in proliferation and apoptosis of gastric epithelial cells early in the natural history of Helicobacter pylori infection.Am J Pathol,1997;151:1695-1703
[6]Moss SF,Calam J,Agarwal B,Wang S,Holt PR.Induction of gastric epithelial apoptosis by Helicobacter pylori.Gut,1996;38:498-501
[7]Peek RMJr,Moss SF,Tham KT,Perez-Perez GI,Wang SB,Miller GG,Athrton JC,Holt PR,Blaser MJ.Helicobacter pylori cagA+strains and dissociation of gastric epithelial cell proliferation from apoptosis.J Natl Cancer Inst,1997;89:863-868
[8] Munzenmaier A,Pahl HL,Covacci A,Bereswill S,Baeuerle PA,Kist M.Helicobacter pylori activates transcription factor NF-kB in CATO-Ⅲ cells.Gut,1996;38:A55
收稿日期：1999-12-22
作者简介：卢世云，男，1970年10月出生，江西万载县人，汉族，1999年福建医科大学消化内科学硕士毕业，主要从事幽门螺杆菌感染的基础与临床研究，发表论文1篇。
参考文献：
[1]Lu SY, Par XZ, Peng XW, Shi ZL Effect of Hp infection on gastric epithelial cell kinetics in stomach diseases.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7:760-762
[2]Figura N,Vindigni C,Covacci A,Presenti L,Burroni D,Vernillo R,Banducci T,Roviello F,Marrelli D,Biscontri M,Kristodhullu S,Gennari C,Vaira D.cagA positive and negative Helicobacter pylori strains are simultaneously present in the stomach of most patients with non-ulcer dyspepsia:relevance to histological damage.Gut,1998;42:772-778
[3]Shimoyama T,Fukuda S,Tanaka M,Mikami T,Munakata A,Crabtree JE.CagA seropositivity associated with development of gastric cancer in a Japanese Population,J Clin Pathol,1998;51:225-228
[4]Ricci V, Ciacci C,Zarrilli R,Sommi P,Tummuru MKR,Baanco CDV,Bruni CB,Cover TL,Blaser MJ,Romano M.Effect of Helicobacter Pylori on gastric epithelial cell migration and proliferation in uitro:role of VacA and CagA.Infect Immmun,1996;65:2829-2833
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[6]Moss SF,Calam J,Agarwal B,Wang S,Holt PR.Induction of gastric epithelial apoptosis by Helicobacter pylori.Gut,1996;38:498-501
[7]Peek RMJr,Moss SF,Tham KT,Perez-Perez GI,Wang SB,Miller GG,Athrton JC,Holt PR,Blaser MJ.Helicobacter pylori cagA+strains and dissociation of gastric epithelial cell proliferation from apoptosis.J Natl Cancer Inst,1997;89:863-868
[8] Munzenmaier A,Pahl HL,Covacci A,Bereswill S,Baeuerle PA,Kist M.Helicobacter pylori activates transcription factor NF-kB in CATO-Ⅲ cells.Gut,1996;38:A55
收稿日期：1999-12-22