碱性成纤维细胞生长因子预防球囊成形血管再狭窄
作者：乔延国 刘辉 王发强 卢柏桦
单位：乔延国 王发强 卢柏桦(北京武警总医院心内科 北京，100039)；刘辉(武警8640部队医院内科)
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；血管成形术；血管内皮
临床心血管病杂志000415 摘要 目的：探讨实验性兔髂动脉粥样硬化狭窄模型于血管成形后，给予碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，对改善血管内皮功能及对再狭窄的预防作用。方法：建立髂动脉狭窄模型兔60只，20只用于成形前(10只)和成形后即刻(10只)管腔面积的组织学分析，余40只随机分成bFGF组和对照组，于血管成形后4周两组兔均处死，行体外血管反应性测试和管腔面积的组织学分析。结果：由乙酰胆碱诱导的内皮依赖性最大舒张反应(Emax)bFGF组[(41±8)%]大于对照组[(12±9)%]，P<0.05；由硝普钠(SNP)诱导的内皮非依赖性血管Emax bFGF组[(88±7)%]大于对照组[(66±5)%]，P<0.05；血管成形后4周对照组腔面积[(0.54±0.26) mm2]小于bFGF组[(1.08±0.32) mm2]，P<0.05，比成形后即刻[(1.20±0.28) mm2]狭窄55%。结论：实验性髂动脉粥样硬化狭窄模型兔于血管成形后给予bFGF，在促进内皮依赖性及非依赖性血管舒张功能恢复的同时，有预防成形血管近期再狭窄发生的作用。
, 百拇医药
Experimental study of the preventive effects of basic fibroblast growth factor on vascular restenosis after balloon angioplasty
QIAO Yan-guo WANG Fa-qiang LU Bai-hua
(The General Hospital of the Chinese People′s Armed Police Forces,Beijing 100039)
LIU Hui
(Department of Medicine,8640 Hospital of the Chinease People′s Armed Police Forces)
, 百拇医药
Abstract Objective:To investigate whether chronic administration of basic fibroblast growth factor (bFGF) after angioplasty in rabbits model with atherosclerotic iliac stenosis can restore normal physiological responses to endothelium-dependent and independent agonists,and the effect of bFGF on the formation of restenosis (RS).Method:60 Japanese white rabbits with atherosclerotic stenosis of right iliac arteries were used.20 of them underwent histological study of lumen areas before (10 rabbits) and immediately after (10 rabbits) angioplasty.20 rabbits received intra-venous administration of bFGF.20 rabbits receiving vehicle injection served as controls.Animal in both groups were then killed on 28 days after operation for analysis of in vitro vasoreactivity and morphometric assessment of histological cross-section areas.Result:Showed the maximal endothelium-dependent Ach-induced relaxation of the bFGF-treated animals 〔Emax (41±8)%〕 was significantly greater than that of the control group 〔Emax (12±9)%,P<0.05〕.The maximal endothelium-independent response of the bFGF-treated group to SNP 〔Emax,(88±7)%〕 was greater than that of the control group 〔Emax (66±5)%,P<0.05〕.Lumen area 4 weeks after angioplasty in bFGF group 〔(1.08±0.32) mm2〕 was greater than that in control group 〔(0.54±0.26)mm2，P<0.05〕.Lumen area decreased by 55% from immediately after angioplasty to 4 weeks after angioplasty.Conclusion:The results suggested that the administration of bFGF could not only restore endothelium-dependent and-independent relaxation but also prevent RS in rabbits that had undergone angioplasty.
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Key words Basic fibroblast growth factor Angioplasty Vascular endothelium
血管成形术后的主要问题是术后再狭窄(RS)，其形成是一复杂过程。本文着重探讨血管成形后应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对内皮依赖性及非依赖性血管舒张功能的影响和对RS的预防作用。
1 材料与方法
1.1 模型建立
选用雄性健康日本大耳白兔60只，平均体重3.2 kg。每日晨投以造型饲料50 g(胆固醇0.5 g，大油1.5 g，蛋黄5 g，普通混合饲料43 g)。1周后，将兔以5%异戊巴比妥钠(45 mg/kg)耳缘静脉麻醉，行右侧髂动脉内膜剥脱术(2.5 mm，Takumi球囊)。继续高胆固醇饲养10周。
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1.2 方法
1.2.1 髂动脉狭窄程度确认：60只兔中随机取10只用于髂动脉狭窄程度的评估。一导管从右侧颈动脉插入至腹主动脉，以4%多聚甲醛(于PBS液中)恒压〔12.0 kPa灌注髂动脉，灌注30 min，以维持两侧髂动脉于原位活体大小。进一步于4%多聚甲醛中浸入固定，植入石蜡中、间断均匀切片5～10张，Orcein-vangieson′s染色及苏木精-伊红染色后，以数字显微图像分析仪(Quantimet-520，英国剑桥)测量两侧髂动脉腔面积大小，明确狭窄程度。
1.2.2 球囊扩张：在X线导引下经股动脉送入球囊(2.5 mm，Takumi)于狭窄处，506.6 kPa下扩张1 min，间隔1 min，连续3次后撤出导管。成形后的50只兔随机取10只，观察血管成形后即刻管腔面积的变化(方法同前)。余40只兔随机分成bFGF组和对照组，每组各20只。bFGF组，给予重组bFGF(Sigma公司)2.5 μg，溶于0.5%白蛋白1 ml中，于成形后的第1、4、7、10天静脉注射；对照组给予等量同浓度白蛋白。两组兔于成形后第28天处死，行体外血管反应性测试与血管结构的组织学分析。
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1.2.3 组织学腔面积分析：20只兔(每组各10只)，标本固定、采集、染色、测量方法均同前。
1.2.4 体外血管反应性测试：右侧髂动脉成形后4周，分离双侧髂动脉(每组各10只)，切成5 mm长血管环。血管环置于盛有40 ml、37℃的K-H液中(pH值7.40)，同时注入95% O2和5% CO2的混合气体。血管环连接于压力转换器，后者与生理记录仪(日本，VM-180 G)相连。给药前血管环在最适静息张力(4 kPa)下稳定60 min。所有动脉环以苯肾上腺素预先缩窄处理(10-9～3×10-5 mol/L)。对苯肾上腺素的收缩反应稳定后，给予内皮依赖性或非依赖性血管扩张药。首先给乙酰胆碱(10-8～3×10-5 mol/L)，当最大舒张反应稳定地产生后，冲洗动脉环并使之稳定于静息张力下。平滑肌松弛剂硝普钠(10-9～3×10-5 mol/L)然后用于苯肾上腺素(3×10-5 mol/L)预先缩窄的动脉环。
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1.3 统计学处理
所有数据均以
±s表示，统计分析采用t检验。对硝普钠、乙酰胆碱的舒张反应表示为使苯肾上腺素预先缩窄血管舒张的百分比。Emax为最大血管反应，EC50为产生最大反应一半所需的浓度。
2 结果
2.1 髂动脉腔面积测定
造型后内膜剥脱侧(右侧)腔面积为(0.51±0.24) mm2，未剥脱侧(左侧)为(1.26±0.54) mm2，剥脱侧较未剥脱侧狭窄59.5%，P<0.05。成形后即刻测得右侧腔面积(1.20±0.28) mm2，较成形前(0.51±0.24) mm2显著增大(P<0.05)。右侧髂动脉成形后4周腔面积变化见表1。
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表1 两组右侧髂动脉成形后4周腔面积变化 mm2，±s 组别
成形侧
未成形侧
bFGF组
1.08±0.321)
1.23±0.482)
对照组
0.54±0.26
1.24±0.51
与对照组比较1) P<0.05，2) P>0.052.2 体外血管反应性
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成形侧与未成形侧髂动脉环对苯肾上腺素的缩血管反应在bFGF组与对照组间均无显著性差异。未成形侧髂动脉对硝普钠的非内皮依赖性舒张反应在bFGF组与对照组间无显著性差异[Emax:(95±6)%∶(92±5)%，P>0.05；EC50：(6.9±2.1)×10 mol/L∶(6.9±2.2)×10-7 mol/L，P>0.05]，对乙酰胆碱的内皮依赖性血管舒张反应在两组间亦无显著性差异[Emax:(43±7)%∶(45±7)%，P>0.05；EC50：(6.2±2.2)×10-7 mol/L∶(6.3±2.1)×10-7mol/L，P>0.05]。右侧髂动脉成形后4周，由乙酰胆碱诱发的内皮依赖性Emax在bFGF组显著大于对照组[(41±8)%∶(12±9)%，P<0.05]，且成形侧髂动脉的Emax和EC50在bFGF组均恢复至对侧(未剥脱侧)水平[Emax:(41±8)%∶(43±7)%，P>0.05；EC50：(6.4±2.5)×10-7 mol/L∶(6.2±2.2)×10-7 mol/L，P>0.05]。血管成形后，成形侧髂动脉对硝普钠的非内皮依赖性Emax较未成形侧明显减弱[bFGF组：(88±7)%∶(95±6)%，P<0.05；对照组：(66±5)%∶(92±5)%，P<0.05]，但bFGF组成形侧髂动脉Emax显著大于对照组(P<0.05)。
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3 讨论
bFGF是一分子量为16 ku的单链多肽，其pH值为9.6，具有强烈促有丝分裂及促血管生长作用〔1〕。本研究发现，髂动脉粥样硬化狭窄模型兔于血管成形后，应用bFGF不但能提高内皮依赖性血管舒张反应，而且亦可改善非内皮依赖性血管舒张功能，进一步证实了bFGF对实验性血管损伤的有益影响。已积累的资料表明，单纯血管内皮剥脱后给予bFGF，在促进内皮再生的同时可改善内皮依赖性血管舒张反应，而对内皮非依赖性血管舒张反应没有影响〔2〕；慢性应用bFGF，保留了冠状动脉逐渐狭窄后建立起来的侧支血管受体介导的内皮功能，但不影响正常灌注区的血管〔3，4〕。分析现有资料发现，bFGF是否引起新内膜肥厚及(或)中层平滑肌增生与所应用bFGF剂量相关，大剂量时可观察到上述现象，小剂量bFGF仅对内皮细胞产生有益影响。这也正体现了作为细胞因子的成纤维细胞生长因子(FGF)作用的双重性及高效性这一生物学特点。鉴于上述原因，我们采用小剂量bFGF。所观察到的成形血管内皮依赖性及非依赖性舒张功能的改善，其原因可能是由于bFGF在促进内皮细胞功能恢复的同时，改善了血管壁平滑肌细胞(SMC)对内皮细胞源松弛因子(EDRF)，即一氧化氮(NO)的敏感性。但本实验中，成形髂动脉对硝普钠敏感性(EC50)在bFGF组与对照组间未发现有显著性差异。但另有报道〔5〕，bFGF可上调SMC中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达，提高血管舒张功能，与低氧具有协同作用。因此，bFGF改善内皮依赖性及非依赖性血管舒张功能的确切机制尚需进一步研究。
, 百拇医药
于成形后4周，对照组观察到腔面积显著缩小，而bFGF组腔面积则无明显变化，表明bFGF有预防实验性血管成形后RS发生的作用。其机制可能与bFGF促进内皮细胞功能恢复和改善成形血管舒张功能有关。另外，内膜未剥脱侧腔面积无明显变化，说明功能正常的内皮细胞是防止动脉粥样硬化性管腔狭窄的必需条件。
参考文献
1，Reidy M A,Clowes A W,Schwartz S M.Endothelial regeneration,V:inhibition of endothelial regrowth in arteries of rat and rabbit.Lab Invest,1983,49:569～575
2，Meurice T,Bauters C,Auffray J C,et al.bFGF restores endothelium-dependent responses after balloon injury of rabbit arteries.Circulation,1996,93:18～22
, http://www.100md.com
3，Bauters C,Asahara T,Zheng L P,et al.Recovery of disturbed endothelium-dependent flow in the collateral-perfused rabbit ischemic hind limb after administration of VEGF.Circulation,1995,91:2802～2809
4，Sellke F W,Wang S Y,Friedman M,et al.bFGF enhances endothelium-dependent relaxation of the collateral-perfused coronary microcirculation.Am J Physiol,1994,269:H1303～1311
5，Geogre T,Ian C,Paul A,et al.bFGF up regulates the expression of VEGF in VSMC.Circulation,1995,92:11～14
(收稿 1999-07-23), 百拇医药
单位：乔延国 王发强 卢柏桦(北京武警总医院心内科 北京，100039)；刘辉(武警8640部队医院内科)
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；血管成形术；血管内皮
临床心血管病杂志000415 摘要 目的：探讨实验性兔髂动脉粥样硬化狭窄模型于血管成形后，给予碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，对改善血管内皮功能及对再狭窄的预防作用。方法：建立髂动脉狭窄模型兔60只，20只用于成形前(10只)和成形后即刻(10只)管腔面积的组织学分析，余40只随机分成bFGF组和对照组，于血管成形后4周两组兔均处死，行体外血管反应性测试和管腔面积的组织学分析。结果：由乙酰胆碱诱导的内皮依赖性最大舒张反应(Emax)bFGF组[(41±8)%]大于对照组[(12±9)%]，P<0.05；由硝普钠(SNP)诱导的内皮非依赖性血管Emax bFGF组[(88±7)%]大于对照组[(66±5)%]，P<0.05；血管成形后4周对照组腔面积[(0.54±0.26) mm2]小于bFGF组[(1.08±0.32) mm2]，P<0.05，比成形后即刻[(1.20±0.28) mm2]狭窄55%。结论：实验性髂动脉粥样硬化狭窄模型兔于血管成形后给予bFGF，在促进内皮依赖性及非依赖性血管舒张功能恢复的同时，有预防成形血管近期再狭窄发生的作用。
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Experimental study of the preventive effects of basic fibroblast growth factor on vascular restenosis after balloon angioplasty
QIAO Yan-guo WANG Fa-qiang LU Bai-hua
(The General Hospital of the Chinese People′s Armed Police Forces,Beijing 100039)
LIU Hui
(Department of Medicine,8640 Hospital of the Chinease People′s Armed Police Forces)
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Abstract Objective:To investigate whether chronic administration of basic fibroblast growth factor (bFGF) after angioplasty in rabbits model with atherosclerotic iliac stenosis can restore normal physiological responses to endothelium-dependent and independent agonists,and the effect of bFGF on the formation of restenosis (RS).Method:60 Japanese white rabbits with atherosclerotic stenosis of right iliac arteries were used.20 of them underwent histological study of lumen areas before (10 rabbits) and immediately after (10 rabbits) angioplasty.20 rabbits received intra-venous administration of bFGF.20 rabbits receiving vehicle injection served as controls.Animal in both groups were then killed on 28 days after operation for analysis of in vitro vasoreactivity and morphometric assessment of histological cross-section areas.Result:Showed the maximal endothelium-dependent Ach-induced relaxation of the bFGF-treated animals 〔Emax (41±8)%〕 was significantly greater than that of the control group 〔Emax (12±9)%,P<0.05〕.The maximal endothelium-independent response of the bFGF-treated group to SNP 〔Emax,(88±7)%〕 was greater than that of the control group 〔Emax (66±5)%,P<0.05〕.Lumen area 4 weeks after angioplasty in bFGF group 〔(1.08±0.32) mm2〕 was greater than that in control group 〔(0.54±0.26)mm2，P<0.05〕.Lumen area decreased by 55% from immediately after angioplasty to 4 weeks after angioplasty.Conclusion:The results suggested that the administration of bFGF could not only restore endothelium-dependent and-independent relaxation but also prevent RS in rabbits that had undergone angioplasty.
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Key words Basic fibroblast growth factor Angioplasty Vascular endothelium
血管成形术后的主要问题是术后再狭窄(RS)，其形成是一复杂过程。本文着重探讨血管成形后应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对内皮依赖性及非依赖性血管舒张功能的影响和对RS的预防作用。
1 材料与方法
1.1 模型建立
选用雄性健康日本大耳白兔60只，平均体重3.2 kg。每日晨投以造型饲料50 g(胆固醇0.5 g，大油1.5 g，蛋黄5 g，普通混合饲料43 g)。1周后，将兔以5%异戊巴比妥钠(45 mg/kg)耳缘静脉麻醉，行右侧髂动脉内膜剥脱术(2.5 mm，Takumi球囊)。继续高胆固醇饲养10周。
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1.2 方法
1.2.1 髂动脉狭窄程度确认：60只兔中随机取10只用于髂动脉狭窄程度的评估。一导管从右侧颈动脉插入至腹主动脉，以4%多聚甲醛(于PBS液中)恒压〔12.0 kPa灌注髂动脉，灌注30 min，以维持两侧髂动脉于原位活体大小。进一步于4%多聚甲醛中浸入固定，植入石蜡中、间断均匀切片5～10张，Orcein-vangieson′s染色及苏木精-伊红染色后，以数字显微图像分析仪(Quantimet-520，英国剑桥)测量两侧髂动脉腔面积大小，明确狭窄程度。
1.2.2 球囊扩张：在X线导引下经股动脉送入球囊(2.5 mm，Takumi)于狭窄处，506.6 kPa下扩张1 min，间隔1 min，连续3次后撤出导管。成形后的50只兔随机取10只，观察血管成形后即刻管腔面积的变化(方法同前)。余40只兔随机分成bFGF组和对照组，每组各20只。bFGF组，给予重组bFGF(Sigma公司)2.5 μg，溶于0.5%白蛋白1 ml中，于成形后的第1、4、7、10天静脉注射；对照组给予等量同浓度白蛋白。两组兔于成形后第28天处死，行体外血管反应性测试与血管结构的组织学分析。
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1.2.3 组织学腔面积分析：20只兔(每组各10只)，标本固定、采集、染色、测量方法均同前。
1.2.4 体外血管反应性测试：右侧髂动脉成形后4周，分离双侧髂动脉(每组各10只)，切成5 mm长血管环。血管环置于盛有40 ml、37℃的K-H液中(pH值7.40)，同时注入95% O2和5% CO2的混合气体。血管环连接于压力转换器，后者与生理记录仪(日本，VM-180 G)相连。给药前血管环在最适静息张力(4 kPa)下稳定60 min。所有动脉环以苯肾上腺素预先缩窄处理(10-9～3×10-5 mol/L)。对苯肾上腺素的收缩反应稳定后，给予内皮依赖性或非依赖性血管扩张药。首先给乙酰胆碱(10-8～3×10-5 mol/L)，当最大舒张反应稳定地产生后，冲洗动脉环并使之稳定于静息张力下。平滑肌松弛剂硝普钠(10-9～3×10-5 mol/L)然后用于苯肾上腺素(3×10-5 mol/L)预先缩窄的动脉环。
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1.3 统计学处理
所有数据均以
±s表示，统计分析采用t检验。对硝普钠、乙酰胆碱的舒张反应表示为使苯肾上腺素预先缩窄血管舒张的百分比。Emax为最大血管反应，EC50为产生最大反应一半所需的浓度。2 结果
2.1 髂动脉腔面积测定
造型后内膜剥脱侧(右侧)腔面积为(0.51±0.24) mm2，未剥脱侧(左侧)为(1.26±0.54) mm2，剥脱侧较未剥脱侧狭窄59.5%，P<0.05。成形后即刻测得右侧腔面积(1.20±0.28) mm2，较成形前(0.51±0.24) mm2显著增大(P<0.05)。右侧髂动脉成形后4周腔面积变化见表1。
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表1 两组右侧髂动脉成形后4周腔面积变化 mm2，
±s 组别成形侧
未成形侧
bFGF组
1.08±0.321)
1.23±0.482)
对照组
0.54±0.26
1.24±0.51
与对照组比较1) P<0.05，2) P>0.052.2 体外血管反应性
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成形侧与未成形侧髂动脉环对苯肾上腺素的缩血管反应在bFGF组与对照组间均无显著性差异。未成形侧髂动脉对硝普钠的非内皮依赖性舒张反应在bFGF组与对照组间无显著性差异[Emax:(95±6)%∶(92±5)%，P>0.05；EC50：(6.9±2.1)×10 mol/L∶(6.9±2.2)×10-7 mol/L，P>0.05]，对乙酰胆碱的内皮依赖性血管舒张反应在两组间亦无显著性差异[Emax:(43±7)%∶(45±7)%，P>0.05；EC50：(6.2±2.2)×10-7 mol/L∶(6.3±2.1)×10-7mol/L，P>0.05]。右侧髂动脉成形后4周，由乙酰胆碱诱发的内皮依赖性Emax在bFGF组显著大于对照组[(41±8)%∶(12±9)%，P<0.05]，且成形侧髂动脉的Emax和EC50在bFGF组均恢复至对侧(未剥脱侧)水平[Emax:(41±8)%∶(43±7)%，P>0.05；EC50：(6.4±2.5)×10-7 mol/L∶(6.2±2.2)×10-7 mol/L，P>0.05]。血管成形后，成形侧髂动脉对硝普钠的非内皮依赖性Emax较未成形侧明显减弱[bFGF组：(88±7)%∶(95±6)%，P<0.05；对照组：(66±5)%∶(92±5)%，P<0.05]，但bFGF组成形侧髂动脉Emax显著大于对照组(P<0.05)。
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3 讨论
bFGF是一分子量为16 ku的单链多肽，其pH值为9.6，具有强烈促有丝分裂及促血管生长作用〔1〕。本研究发现，髂动脉粥样硬化狭窄模型兔于血管成形后，应用bFGF不但能提高内皮依赖性血管舒张反应，而且亦可改善非内皮依赖性血管舒张功能，进一步证实了bFGF对实验性血管损伤的有益影响。已积累的资料表明，单纯血管内皮剥脱后给予bFGF，在促进内皮再生的同时可改善内皮依赖性血管舒张反应，而对内皮非依赖性血管舒张反应没有影响〔2〕；慢性应用bFGF，保留了冠状动脉逐渐狭窄后建立起来的侧支血管受体介导的内皮功能，但不影响正常灌注区的血管〔3，4〕。分析现有资料发现，bFGF是否引起新内膜肥厚及(或)中层平滑肌增生与所应用bFGF剂量相关，大剂量时可观察到上述现象，小剂量bFGF仅对内皮细胞产生有益影响。这也正体现了作为细胞因子的成纤维细胞生长因子(FGF)作用的双重性及高效性这一生物学特点。鉴于上述原因，我们采用小剂量bFGF。所观察到的成形血管内皮依赖性及非依赖性舒张功能的改善，其原因可能是由于bFGF在促进内皮细胞功能恢复的同时，改善了血管壁平滑肌细胞(SMC)对内皮细胞源松弛因子(EDRF)，即一氧化氮(NO)的敏感性。但本实验中，成形髂动脉对硝普钠敏感性(EC50)在bFGF组与对照组间未发现有显著性差异。但另有报道〔5〕，bFGF可上调SMC中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达，提高血管舒张功能，与低氧具有协同作用。因此，bFGF改善内皮依赖性及非依赖性血管舒张功能的确切机制尚需进一步研究。
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于成形后4周，对照组观察到腔面积显著缩小，而bFGF组腔面积则无明显变化，表明bFGF有预防实验性血管成形后RS发生的作用。其机制可能与bFGF促进内皮细胞功能恢复和改善成形血管舒张功能有关。另外，内膜未剥脱侧腔面积无明显变化，说明功能正常的内皮细胞是防止动脉粥样硬化性管腔狭窄的必需条件。
参考文献
1，Reidy M A,Clowes A W,Schwartz S M.Endothelial regeneration,V:inhibition of endothelial regrowth in arteries of rat and rabbit.Lab Invest,1983,49:569～575
2，Meurice T,Bauters C,Auffray J C,et al.bFGF restores endothelium-dependent responses after balloon injury of rabbit arteries.Circulation,1996,93:18～22
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3，Bauters C,Asahara T,Zheng L P,et al.Recovery of disturbed endothelium-dependent flow in the collateral-perfused rabbit ischemic hind limb after administration of VEGF.Circulation,1995,91:2802～2809
4，Sellke F W,Wang S Y,Friedman M,et al.bFGF enhances endothelium-dependent relaxation of the collateral-perfused coronary microcirculation.Am J Physiol,1994,269:H1303～1311
5，Geogre T,Ian C,Paul A,et al.bFGF up regulates the expression of VEGF in VSMC.Circulation,1995,92:11～14
(收稿 1999-07-23), 百拇医药