高效液相色谱“柱切换法”测定血液及腹腔液中5-氟尿嘧啶的浓度Foute Nelong J C(富特)
作者：耿秋明 周孝思
单位：Foute Nelong J C(富特)(北京医科大学第三临床医院普通外科 100083)；周孝思(北京医科大学第三临床医院普通外科 100083)；耿秋明(联系人：北京医科大学第三临床医院中心实验室 100083)
关键词：5-氟尿嘧啶；高效液相色谱；柱切换法；体液
药物分析杂志000416 摘要 目的：评价高效液相色谱柱切换法在测定体液中5-氟尿嘧啶(5FU)浓度的优点。方法：高效液相色谱柱切换法测定血及腹腔液中5FU浓度。结果：标准曲线的回归方程为Y=9.69×10-6X-1.33,r=0.999 8,P<0.000 1；体液测定5FU浓度的RSD为0.2%～5.6%，但是浓度小于或等于0.05 μg.mL-1时，RSD为15.7%。体液中5FU的回收率为88.87%～116.8%。测定的最小浓度为0.05 μg.mL-1。结论：高效液相色谱柱切换法有样品处理简捷快速，灵敏度高，重复性好等优点；在临床药物监测时，可以起主要的作用。
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Determination of 5-Fluorouracil Concentrations in Biological Fluids by HPLC “Column Replacement Technique”
Foute Nelong J C Zhou Xiaosi
(Third Hospital of Beijing Medical University,Department of General Surgery,Beijing 100083)
Geng Qiuming
(Third Hospital of Beijing Medical University,Central Laboratory,Beijing 100083)
Abstract Objective：To evaluate the advantages of HPLC Column Replacement Technique in the determination of 5FU concentrations in biological fluids.Methods:Blood and peritoneal fluid concentration of 5FU were determined by HPLC Column Replacement Technique.Results:The calibration curve was linear in the range of 0.05～500 μg.mL-1.The standard curve equation was Y=9.69×10-6X-1.33,r=0.999 8,P<0.000 1.Reproducible blood and ascites concentrations were determined with RSD ranging from 0.2% to 5.6%.RSD was 15.7% for concentrations equal to 0.05 μg.mL-1.The recovery rate ranged from 88.87% to 116.8%.The minimal detectable concentration was 50 μg.L-1.Conclusions:The HPLC Column Replacement Technique has many advantages:(1)extraction procedure is easier and less time consuming;(2)sensitivity is high;(3)reproducibility is good.HPLC Column Replacement Technique can have good application in the monitoring of therapeutics drugs.
, 百拇医药
Key words 5-fluorouracil(5FU),HPLC,Column Replacement Technique,body fluids▲
在胃肠道恶性肿瘤辅助化疗中，5-氟尿嘧啶(5FU)被公认为效果较好的药物[1，2]。其临床给药方式较多，外周静脉注射，门静脉注射，肝动脉注射，腹腔注射，口服，灌肠等。各个临床医院以经验为根据选择某种给药方式。用药的量及注射药物的速度也同样缺少实验根据。为了确定各给药方法的优点及其可行性，研究各种给药途径及不同药量的药代动力学特点对指导临床用药有重要的意义。
对5FU的测定报道有高效液相色谱法[3～5]。但较为繁琐。为此我们建立了高效液相色谱柱切换法，不经提取，直接测定血液及腹腔液中的5FU浓度。本法具有样品处理简捷、快速，灵敏度高等优点。特别适应于临床血液及其他体液药物浓度的监测及药代动力学研究。
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1 仪器与试药
高效液相色谱泵：SP8810，Spectra Physics,USA；可变波长紫外线检测仪：Spectra 200,Spectra Physics,USA；数据处理机：Data jet integrator,Spectra Physics,USA。
5FU标准品：由Sigma公司提供；10%高氯酸及磷酸二氢钠：AR级，北京化工厂；去离子水：Millipore-Q Ⅱ。
2 色谱条件
色谱柱：YWG-C18柱(4.6 mm×250 mm)，北京分析仪器厂；保护柱：Waters Gaund-PAKTM；流动相：0.05 mol.L-1磷酸二氢钠；流速：1 mL.min-1；紫外检测波长：256 nm；室温下操作。
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仪器操作方法：用六通阀连接3个色谱柱。先用被测物的标准品测知其流经第一色谱柱的保留时间。根据已知的保留时间，再将小段携有样品峰的流动相切换到第二色谱柱上进一步分离并检测。六通阀在标准品保留时间前后40 s切换。
3 标准液的配制
精密称取5FU标准品50 mg于50 mL容量瓶中，加去离子水溶解并稀释至刻度，配成浓度为1 000 μg.mL-1的5FU溶液。取该液分别配成0.05，0.1,0.2,1.0,2.0,6.0,10,20,40,80,100,500 μg.mL-1系列浓度的5FU标准液。
4 血及腹腔内液标本的处理
静脉取血，静置至开始出现血凝现象，用小塑料棍稍微搅拌后，离心5 min(离心力=133×g)。取血清0.5 mL，分2次加10%高氯酸0.1 mL。每次加后，旋涡混合机中振动5 min，再次离心5 min(离心力=133×g)。取上清液经过0.45 μm微孔滤膜滤过。取20 μL进样。
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腹腔液的处理同血液。
5 结果与讨论
5.1 5FU色谱图 5FU标准品以及未经5FU治疗患者的血清添加5FU标准液经过处理后，分别用单柱法及柱切换法HPLC测定的色谱图见图1及图2。
图1 5FU标准品的色谱图
A.单柱法 B.柱切换法
1. 5FU
图2 血清中添加5FU的色谱图
A.单柱法 B.柱切换法
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1. 5FU
5.2 线性关系 取不同浓度的5FU标准液20 μL，进样。以峰面积对浓度作图，绘制标准曲线。得出的回归方程为：
Y=9.69×10-6X-1.33 r=0.999 8
P<0.000 1，因此可知5FU浓度在0.05～500 μg.mL-1呈线性关系。
5.3 回收率试验 取血清0.45 mL，分别加入不同浓度的5FU标准液50 μL，配成5FU 1，10，50，100 μg.mL-1的血清液。经过上述样品处理方法处理后，取20 μL进样。1种浓度作3份平行样品。腹腔液的处理同血清。结果血清中5FU的回收率为88.87%～116.8%，RSD<10.8%；腹腔液中5FU的回收率为96.22%～115.6%，RSD<12.7%。
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5.4 精密度试验 每种浓度的标准液作3份平行样品，计算其RSD。当5FU浓度≥0.1 μg.mL-1时，RSD的范围为0.2%～5.6%。但5FU浓度过低时(≤0.05 μg.mL-1)，RSD较高，为15.7%。
5.5 最小检测浓度 本实验检测最小浓度为50 μg.L-1。
6 讨论
上述的结果表明用柱切换高效液相色谱法，可以提高分离5FU的效果。主要优点是可以提高5FU和血或腹腔液中与其相似杂质的分离效果，节省分析时间，对分析柱有保护作用。
血清及组织液中的杂物的色谱峰对5FU的峰无干扰[3]。我们在实验当中发现，用单色谱柱时，杂物对5FU的峰常有不同程度的干扰，使5FU的峰常包含在1个组合峰里而影响检测的准确度(图2)。应用3个色谱柱及柱切换法时，可以排除5FU出峰前后阶段杂物峰的干扰，并对5FU的组合峰再作进一步分离。这样可以提高实验的特异性和测定值的精确度。本实验的RSD在0.2%～15.7%之间。最小测定浓度为50 μg.L-1。与文献的结果基本符合。腹腔液及血液5FU回收率分别为96%～113%和88%～115%。文献中的5FU回收率在约75%～80%之间[5，6]。这说明本方法较合理，可以更真实地反映血液或腹腔液中的药物浓度。本方法对指导临床用5FU有积极意义。■
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参考文献
1.Markman M.胃肠道恶性肿瘤的腹腔化疗.国外医学外科分册，1987，4：203
2.van Triest B,van Groenigen C J,Pinedo H M.Current chemotherapeutic possibilities in the treatment of colorectal cancer. Eur J Cancer,1995,31A(7/8):1193
3.卿三华，周锡庚，徐俊昌等.高效液相色谱法测定血液、体腔和组织中5FU浓度的研究.肿瘤，1990，10(4)：168
4.Benvenuto J A,Lu K,Ti Li Loo. High pressure liquid chromatography analysis of Ftorafur and its metabolites in biological fluids.J Chromatogr,1977,134:219
5.Christophidis N,Mihaly G,Vajdu F.Comparison of liquid and gas-liquid chromatography assays of 5FU in plasma.Clin Chem,1979,25(1):83
6.Cohen J L, Brennan P B.GLC assay for 5-fluorouracil biological fluids.J Pharm Sci,1973,62(4):572
(本文于1999年5月10日收到), 百拇医药
单位：Foute Nelong J C(富特)(北京医科大学第三临床医院普通外科 100083)；周孝思(北京医科大学第三临床医院普通外科 100083)；耿秋明(联系人：北京医科大学第三临床医院中心实验室 100083)
关键词：5-氟尿嘧啶；高效液相色谱；柱切换法；体液
药物分析杂志000416 摘要 目的：评价高效液相色谱柱切换法在测定体液中5-氟尿嘧啶(5FU)浓度的优点。方法：高效液相色谱柱切换法测定血及腹腔液中5FU浓度。结果：标准曲线的回归方程为Y=9.69×10-6X-1.33,r=0.999 8,P<0.000 1；体液测定5FU浓度的RSD为0.2%～5.6%，但是浓度小于或等于0.05 μg.mL-1时，RSD为15.7%。体液中5FU的回收率为88.87%～116.8%。测定的最小浓度为0.05 μg.mL-1。结论：高效液相色谱柱切换法有样品处理简捷快速，灵敏度高，重复性好等优点；在临床药物监测时，可以起主要的作用。
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Determination of 5-Fluorouracil Concentrations in Biological Fluids by HPLC “Column Replacement Technique”
Foute Nelong J C Zhou Xiaosi
(Third Hospital of Beijing Medical University,Department of General Surgery,Beijing 100083)
Geng Qiuming
(Third Hospital of Beijing Medical University,Central Laboratory,Beijing 100083)
Abstract Objective：To evaluate the advantages of HPLC Column Replacement Technique in the determination of 5FU concentrations in biological fluids.Methods:Blood and peritoneal fluid concentration of 5FU were determined by HPLC Column Replacement Technique.Results:The calibration curve was linear in the range of 0.05～500 μg.mL-1.The standard curve equation was Y=9.69×10-6X-1.33,r=0.999 8,P<0.000 1.Reproducible blood and ascites concentrations were determined with RSD ranging from 0.2% to 5.6%.RSD was 15.7% for concentrations equal to 0.05 μg.mL-1.The recovery rate ranged from 88.87% to 116.8%.The minimal detectable concentration was 50 μg.L-1.Conclusions:The HPLC Column Replacement Technique has many advantages:(1)extraction procedure is easier and less time consuming;(2)sensitivity is high;(3)reproducibility is good.HPLC Column Replacement Technique can have good application in the monitoring of therapeutics drugs.
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Key words 5-fluorouracil(5FU),HPLC,Column Replacement Technique,body fluids▲
在胃肠道恶性肿瘤辅助化疗中，5-氟尿嘧啶(5FU)被公认为效果较好的药物[1，2]。其临床给药方式较多，外周静脉注射，门静脉注射，肝动脉注射，腹腔注射，口服，灌肠等。各个临床医院以经验为根据选择某种给药方式。用药的量及注射药物的速度也同样缺少实验根据。为了确定各给药方法的优点及其可行性，研究各种给药途径及不同药量的药代动力学特点对指导临床用药有重要的意义。
对5FU的测定报道有高效液相色谱法[3～5]。但较为繁琐。为此我们建立了高效液相色谱柱切换法，不经提取，直接测定血液及腹腔液中的5FU浓度。本法具有样品处理简捷、快速，灵敏度高等优点。特别适应于临床血液及其他体液药物浓度的监测及药代动力学研究。
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1 仪器与试药
高效液相色谱泵：SP8810，Spectra Physics,USA；可变波长紫外线检测仪：Spectra 200,Spectra Physics,USA；数据处理机：Data jet integrator,Spectra Physics,USA。
5FU标准品：由Sigma公司提供；10%高氯酸及磷酸二氢钠：AR级，北京化工厂；去离子水：Millipore-Q Ⅱ。
2 色谱条件
色谱柱：YWG-C18柱(4.6 mm×250 mm)，北京分析仪器厂；保护柱：Waters Gaund-PAKTM；流动相：0.05 mol.L-1磷酸二氢钠；流速：1 mL.min-1；紫外检测波长：256 nm；室温下操作。
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仪器操作方法：用六通阀连接3个色谱柱。先用被测物的标准品测知其流经第一色谱柱的保留时间。根据已知的保留时间，再将小段携有样品峰的流动相切换到第二色谱柱上进一步分离并检测。六通阀在标准品保留时间前后40 s切换。
3 标准液的配制
精密称取5FU标准品50 mg于50 mL容量瓶中，加去离子水溶解并稀释至刻度，配成浓度为1 000 μg.mL-1的5FU溶液。取该液分别配成0.05，0.1,0.2,1.0,2.0,6.0,10,20,40,80,100,500 μg.mL-1系列浓度的5FU标准液。
4 血及腹腔内液标本的处理
静脉取血，静置至开始出现血凝现象，用小塑料棍稍微搅拌后，离心5 min(离心力=133×g)。取血清0.5 mL，分2次加10%高氯酸0.1 mL。每次加后，旋涡混合机中振动5 min，再次离心5 min(离心力=133×g)。取上清液经过0.45 μm微孔滤膜滤过。取20 μL进样。
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腹腔液的处理同血液。
5 结果与讨论
5.1 5FU色谱图 5FU标准品以及未经5FU治疗患者的血清添加5FU标准液经过处理后，分别用单柱法及柱切换法HPLC测定的色谱图见图1及图2。
图1 5FU标准品的色谱图
A.单柱法 B.柱切换法
1. 5FU
图2 血清中添加5FU的色谱图
A.单柱法 B.柱切换法
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1. 5FU
5.2 线性关系 取不同浓度的5FU标准液20 μL，进样。以峰面积对浓度作图，绘制标准曲线。得出的回归方程为：
Y=9.69×10-6X-1.33 r=0.999 8
P<0.000 1，因此可知5FU浓度在0.05～500 μg.mL-1呈线性关系。
5.3 回收率试验 取血清0.45 mL，分别加入不同浓度的5FU标准液50 μL，配成5FU 1，10，50，100 μg.mL-1的血清液。经过上述样品处理方法处理后，取20 μL进样。1种浓度作3份平行样品。腹腔液的处理同血清。结果血清中5FU的回收率为88.87%～116.8%，RSD<10.8%；腹腔液中5FU的回收率为96.22%～115.6%，RSD<12.7%。
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5.4 精密度试验 每种浓度的标准液作3份平行样品，计算其RSD。当5FU浓度≥0.1 μg.mL-1时，RSD的范围为0.2%～5.6%。但5FU浓度过低时(≤0.05 μg.mL-1)，RSD较高，为15.7%。
5.5 最小检测浓度 本实验检测最小浓度为50 μg.L-1。
6 讨论
上述的结果表明用柱切换高效液相色谱法，可以提高分离5FU的效果。主要优点是可以提高5FU和血或腹腔液中与其相似杂质的分离效果，节省分析时间，对分析柱有保护作用。
血清及组织液中的杂物的色谱峰对5FU的峰无干扰[3]。我们在实验当中发现，用单色谱柱时，杂物对5FU的峰常有不同程度的干扰，使5FU的峰常包含在1个组合峰里而影响检测的准确度(图2)。应用3个色谱柱及柱切换法时，可以排除5FU出峰前后阶段杂物峰的干扰，并对5FU的组合峰再作进一步分离。这样可以提高实验的特异性和测定值的精确度。本实验的RSD在0.2%～15.7%之间。最小测定浓度为50 μg.L-1。与文献的结果基本符合。腹腔液及血液5FU回收率分别为96%～113%和88%～115%。文献中的5FU回收率在约75%～80%之间[5，6]。这说明本方法较合理，可以更真实地反映血液或腹腔液中的药物浓度。本方法对指导临床用5FU有积极意义。■
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参考文献
1.Markman M.胃肠道恶性肿瘤的腹腔化疗.国外医学外科分册，1987，4：203
2.van Triest B,van Groenigen C J,Pinedo H M.Current chemotherapeutic possibilities in the treatment of colorectal cancer. Eur J Cancer,1995,31A(7/8):1193
3.卿三华，周锡庚，徐俊昌等.高效液相色谱法测定血液、体腔和组织中5FU浓度的研究.肿瘤，1990，10(4)：168
4.Benvenuto J A,Lu K,Ti Li Loo. High pressure liquid chromatography analysis of Ftorafur and its metabolites in biological fluids.J Chromatogr,1977,134:219
5.Christophidis N,Mihaly G,Vajdu F.Comparison of liquid and gas-liquid chromatography assays of 5FU in plasma.Clin Chem,1979,25(1):83
6.Cohen J L, Brennan P B.GLC assay for 5-fluorouracil biological fluids.J Pharm Sci,1973,62(4):572
(本文于1999年5月10日收到), 百拇医药