亚甲蓝对结肠癌细胞系Lovo的杀伤和抑制作用
作者：冯树 曾青 周丽娜 郝林
单位：冯树 郝林 曾青(中国科学院沈阳应用生态研究所微生物工程室,沈阳 110015)；周丽娜(沈阳药科大学制药系,沈阳 110015)
关键词：亚甲蓝；人大肠癌细胞；抗肿瘤作用
沈阳药科大学学报000418 摘 要 为探讨亚甲蓝对体外培养的人大肠癌细胞的抗肿瘤作用,采用直接杀伤实验、细胞生长抑制实验和细胞集落形成能力实验方法研究了亚甲蓝对体外培养的人大肠癌细胞系Lovo的作用，同时用透射电镜技术观察了该药对癌细胞的损伤部位.结果显示13.25 μmol/L亚甲蓝作用24 h 可杀死79.4%的大肠癌细胞,53 μmol/L亚甲蓝作用24 h可杀死全部大肠癌细胞，0.27 μmol/L亚甲蓝即可明显抑制人结肠癌细胞的增殖.透射电镜观察显示亚甲蓝损伤细胞的部位在线粒体.研究结果表明, 亚甲蓝对体外培养的人大肠癌细胞Lovo具有显著的杀伤和抑制作用，其损伤癌细胞的部位在线粒体.
, 百拇医药
分类号 R735
The Antitumor Effect of Methylene Blue on Human Colorectal Carcinoma Cell Line Lovo
Feng Shu，Zeng Qing,Zhou Li′na，Hao Lin
(Microbial Engineering Department,Institute of Applied Ecology,Academia Sinica,Shenyang 110015)
Abstract To study the antitumor effect of methylene blue on human colorectal carcinoma cell line Lovo in vitro, methods of direct killing and inhibition of cell growth and clonegenic survival were used and the transmission electron microscope was used to demonstrate the damage location of cancer cells.The results showed that the mortality of the human colorectal carcinoma cell line Lovo was 79.4% treated by 13.25 μmol/L of methylene blue for 24h and was 100% with 53 μmol/L of methylene blue.0.27 μmol/L of methylene blue could obviously inhibit the growth and clonegenic survival of human colorectal carcinoma cell line Lovo.The damage of cancer cells was located mainly in mitochondria. It was concluded that the methylene blue exhibited antitumor effect on human colorectal carcinoma cells in vitro,the damage of cancer cells was located mainly in mitochondria.
, http://www.100md.com
Key words methylene blue;human colorectal carcinoma cell line;antitumor effect
亚甲蓝(methylene blue,MB)又名美蓝、甲烯蓝，在现代医学诊断及治疗方面具有广泛的用途，如用于诊断角膜淀粉样病变、花斑病、妊娠菌尿症、血黄素沉着病及治疗氰化物中毒、疟疾、精神抑郁症等.1990年，赖百强等〔1〕报道在研究肺癌细胞代谢时发现亚甲蓝可直接杀伤及抑制肺癌细胞LTEP-a3在体外的生长，引起人们对亚甲蓝抗癌作用的关注，但尚未见亚甲蓝对其他癌细胞杀伤作用的报道.作者研究了亚甲蓝对人结肠癌细胞Lovo的体外杀伤和抑制作用.
1 材料与试药
细胞及细胞培养：人结肠癌细胞系Lovo由美国哈佛大学Dana-Farber癌研究所惠赠，于含10%小牛血清、2U/mL庆大霉素的DMEM培养基(Sigma)中在95%湿度、37℃、5%CO2的培养箱中培养.
, http://www.100md.com
亚甲蓝：北京制药厂药用粉末.
2 实验
2.1 细胞直接杀伤实验
取对数期大肠癌细胞Lovo置于含DMEM培养基的小平皿中，加入无血清DMEM培养基稀释的亚甲蓝溶液，使细胞终浓度为105个/mL, 亚甲蓝终浓度为0.27～106 μmol/L,每个浓度3个平皿，置于95%湿度、37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h.以0.2%胎盘蓝做活细胞记数，计算细胞死亡率.
2.2 细胞生长抑制实验
将对数期大肠癌细胞Lovo接种于DMEM培养基中，实验组加入亚甲蓝(终浓度为0.27、1.35、2.65 μmol/L)，对照组加同体积不含亚甲蓝的无血清DMEM培养基.95%湿度、37℃、5%CO2的培养箱中培养7天, 每隔24 h从每组分别取出3瓶细胞，以0.2%胎盘蓝染色做活细胞记数.以天数为横坐标，每天细胞增殖数为纵坐标，作生长曲线.
, http://www.100md.com
2.3 集落形成能力实验
将对数期大肠癌细胞Lovo置于小平皿中培养24 h,弃去培养基，加入含亚甲蓝的培养基(终浓度分别为0.27、1.35、2.65 μmol/L)继续培养24 h后，弃去培养基，以生理盐水洗涤2次，胰酶消化细胞，记数.以1 000个细胞/皿分装细胞，加新培养基培养10 d.Carnnoy固定，Giemsa染色，显微镜下记数细胞集落数.按下列公式计算细胞存活率.每个浓度设3个样本.
集落形成率=集落形成数/接种细胞数×100%；
细胞存活率=给药组集落形成率/对照组集落形成率×100%.
2.4 透射电镜技术观察细胞损伤部位
取对数生长期人大肠癌细胞Lovo接种于培养瓶中，培养2天后，实验组换培养液为含0.27 μmol/L亚甲蓝的DMED培养液，对照组换不含亚甲蓝的DMED培养液，继续培养24 h.常规消化、离心，细胞团块经2.5%的戊二醛固定，1%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，醋酸铀染色，Epon812包埋.超薄切片，于透射电镜下观察.
, http://www.100md.com
3 结果
3.1 体外直接杀伤作用
由表1可见经24h作用，6.63 μmol/L亚甲蓝杀死79.4%人结肠癌细胞，53 μmol/L甲烯蓝杀死100%人结肠癌细胞.
Tab.1 The direct killing effect of methylene blue on colorectal carcinoma cell line Lovo Concentration of MB
(μmol.L-1)
Cell mortality
(%)
0.27
, http://www.100md.com
25.9
1.35
28.6
2.65
33.6
6.63
79.4
13.25
91.3
26.50
95.1
53.0
100
, 百拇医药
3.2 亚甲蓝对大肠癌细胞的体外生长抑制作用 由图1可见，0.27 μmol/L甲烯蓝即可明显抑制人结肠癌细胞Lovo增殖.
Fig.1 The inhibitary effect of methylene blue on the growth of colorectal carcinoma cell line Lovo
3.3 亚甲蓝对大肠癌细胞集落形成能力的影响
表2可见,0.27 μmol/L亚甲蓝作用24 h即对Lovo细胞的存活率具有明显的抑制作用, 亚甲蓝对该细胞存活率的抑制作用具有浓度依赖性.
3.4 细胞损伤部位
透射电镜观察表明，甲烯蓝对人结肠癌细胞Lovo的损伤部位为线粒体，表现为线粒体结构破坏、肿胀，断面呈空腔(见图2,3).
, 百拇医药
Tab.2 The effect of methylene blue on clonogenic survival of colorectal carcinoma cell line Lovo Concentration of MB
(μmol*L-1)
Survival rate
(%)
0.27
63.4
0.53
52.1
1.35
31.7
, 百拇医药
2.70
18.2
Fig.2 The Lovo cell untreated with methylene blue TEM 2000×
Fig.3 The Lovo cell treated with methylene blue TEM 2000×
4 讨论
亚甲蓝在生物氧化中广泛用作电子受氢体，氧化型显兰色，还原型无色.在电子从还原型吡啶核苷酸NAD(P)H向高铁血红蛋白传递中，亚甲蓝作为电子受体，促进高铁血红蛋白还原成血红蛋白，因此，低剂量的亚甲蓝可用以治疗亚硝酸盐、氯酸盐、醌类、醌亚胺类、苯胺及硝基苯类中毒所致的高铁血红蛋白血症, 高剂量的亚甲蓝可使高铁血红蛋白氧化为血红蛋白，因而可用于治疗氰化物中毒〔2〕.Katsuki〔3〕发现亚甲蓝可抑制NO供体激活的血浆可溶性鸟苷酸环化酶，而后，亚甲蓝广泛用作鸟苷酸环化酶抑制剂. 其作用机理尚不完全清楚，有文献报道〔4〕，亚甲蓝通过细胞氧化还原反应产生超氧阴离子自由基，抑制鸟苷酸环化酶活性.美国FDA已批准含有亚甲蓝的药物进入临床应用，对膀胱炎，尿道炎等下泌尿道平滑肌运动性增强所致的症状有明显疗效，且亚甲蓝能口服使用，毒副作用小〔5〕.
, 百拇医药
亚甲蓝对肺癌细胞的抗肿瘤作用赖百强等已作了报道〔1，6，7〕.本文研究了亚甲蓝对体外培养的人大肠癌细胞的作用, 证实其对人大肠癌细胞亦具有明显的体外杀伤和抑制作用，13.25 μmol/L亚甲蓝作用24 h可杀死79.4%的大肠癌细胞Lovo,53 μmol/L亚甲蓝作用24 h可杀死全部大肠癌细胞Lovo，0.27 μmol/L亚甲蓝即可明显抑制人结肠癌细胞Lovo增殖.透射电镜观察显示亚甲蓝损伤细胞的部位在线粒体，与赖百强等〔1〕报道亚甲蓝损伤肺癌细胞LTEP-a3的部位一致，支持有关亚甲蓝抗癌机制为干扰癌细胞NAD(P)H递氢过程，干扰其氧化还原平衡，引起癌细胞呼吸能量代谢障碍而抑制和杀伤癌细胞的推测〔8，9〕.
中国科学院“百人计划”资助项目
参考文献
1，赖百强，汪惠，刘桂芝.亚甲蓝对人肺癌细胞(LTEP-a3)的体外杀伤作用的研究.肿瘤防治研究，1990,17(1)：1～3
, 百拇医药
2，华希明.王秀清.药理学.北京:人民卫生出版社，1985.313～315
3，Katsuki S W,Mittal A C,Murad F.Stimulation of guanylate cyclase by sodium nitroprusside, nitroglycerin and nitric oxide in various tissue preparations.Adv Cyclic Nucleotide Res, 1977,3：23～31
4，Wolin M S, Cherry P O, Roclenburg J M, et al. Methylen blue inhibits vosodolation of skeletal muscle arterioles to acetylcholine and nitric oxide via the extrocellular generation of superoxide anion. J Pharmacol Exp Ther, 1990,254:872～879
, 百拇医药
5，Herman B H, Vocci F, Bridge P. The effects of NMDA receptor anagonists and nitric oxidae synthese inhibitors on opioid tolerance and withdrawal medication development issues for opiate addiction.Neuropysychopharmacology, 1995,13:271～277
6，赖百强,汪蕙,湛秀萍，等.亚甲蓝体内抗肿瘤作用及药理学的研究.中华肿瘤杂志,1989,11(2):98～100
7，赖百强,汪蕙,湛秀萍，等.亚甲蓝体内抗肿瘤作用的研究.结核病与肺部肿瘤,1988,2:1～3
8，William JM,Randal D,Steven M，et al.Modifying intracellular redox balance:an approach to improving the therapeutic index.The Lancet,1985,9：565～570
9，Hui Wang,Vipin S,Kaarl W L.Use of oxidizing dyes in combination with cyanccinnamic acid to enhance hyperthermic cytoxicity in L929 cells.Cancer Research,1987,47:3341～3345
收稿日期:1999-11-20
, http://www.100md.com
单位：冯树 郝林 曾青(中国科学院沈阳应用生态研究所微生物工程室,沈阳 110015)；周丽娜(沈阳药科大学制药系,沈阳 110015)
关键词：亚甲蓝；人大肠癌细胞；抗肿瘤作用
沈阳药科大学学报000418 摘 要 为探讨亚甲蓝对体外培养的人大肠癌细胞的抗肿瘤作用,采用直接杀伤实验、细胞生长抑制实验和细胞集落形成能力实验方法研究了亚甲蓝对体外培养的人大肠癌细胞系Lovo的作用，同时用透射电镜技术观察了该药对癌细胞的损伤部位.结果显示13.25 μmol/L亚甲蓝作用24 h 可杀死79.4%的大肠癌细胞,53 μmol/L亚甲蓝作用24 h可杀死全部大肠癌细胞，0.27 μmol/L亚甲蓝即可明显抑制人结肠癌细胞的增殖.透射电镜观察显示亚甲蓝损伤细胞的部位在线粒体.研究结果表明, 亚甲蓝对体外培养的人大肠癌细胞Lovo具有显著的杀伤和抑制作用，其损伤癌细胞的部位在线粒体.
, 百拇医药
分类号 R735
The Antitumor Effect of Methylene Blue on Human Colorectal Carcinoma Cell Line Lovo
Feng Shu，Zeng Qing,Zhou Li′na，Hao Lin
(Microbial Engineering Department,Institute of Applied Ecology,Academia Sinica,Shenyang 110015)
Abstract To study the antitumor effect of methylene blue on human colorectal carcinoma cell line Lovo in vitro, methods of direct killing and inhibition of cell growth and clonegenic survival were used and the transmission electron microscope was used to demonstrate the damage location of cancer cells.The results showed that the mortality of the human colorectal carcinoma cell line Lovo was 79.4% treated by 13.25 μmol/L of methylene blue for 24h and was 100% with 53 μmol/L of methylene blue.0.27 μmol/L of methylene blue could obviously inhibit the growth and clonegenic survival of human colorectal carcinoma cell line Lovo.The damage of cancer cells was located mainly in mitochondria. It was concluded that the methylene blue exhibited antitumor effect on human colorectal carcinoma cells in vitro,the damage of cancer cells was located mainly in mitochondria.
, http://www.100md.com
Key words methylene blue;human colorectal carcinoma cell line;antitumor effect
亚甲蓝(methylene blue,MB)又名美蓝、甲烯蓝，在现代医学诊断及治疗方面具有广泛的用途，如用于诊断角膜淀粉样病变、花斑病、妊娠菌尿症、血黄素沉着病及治疗氰化物中毒、疟疾、精神抑郁症等.1990年，赖百强等〔1〕报道在研究肺癌细胞代谢时发现亚甲蓝可直接杀伤及抑制肺癌细胞LTEP-a3在体外的生长，引起人们对亚甲蓝抗癌作用的关注，但尚未见亚甲蓝对其他癌细胞杀伤作用的报道.作者研究了亚甲蓝对人结肠癌细胞Lovo的体外杀伤和抑制作用.
1 材料与试药
细胞及细胞培养：人结肠癌细胞系Lovo由美国哈佛大学Dana-Farber癌研究所惠赠，于含10%小牛血清、2U/mL庆大霉素的DMEM培养基(Sigma)中在95%湿度、37℃、5%CO2的培养箱中培养.
, http://www.100md.com
亚甲蓝：北京制药厂药用粉末.
2 实验
2.1 细胞直接杀伤实验
取对数期大肠癌细胞Lovo置于含DMEM培养基的小平皿中，加入无血清DMEM培养基稀释的亚甲蓝溶液，使细胞终浓度为105个/mL, 亚甲蓝终浓度为0.27～106 μmol/L,每个浓度3个平皿，置于95%湿度、37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h.以0.2%胎盘蓝做活细胞记数，计算细胞死亡率.
2.2 细胞生长抑制实验
将对数期大肠癌细胞Lovo接种于DMEM培养基中，实验组加入亚甲蓝(终浓度为0.27、1.35、2.65 μmol/L)，对照组加同体积不含亚甲蓝的无血清DMEM培养基.95%湿度、37℃、5%CO2的培养箱中培养7天, 每隔24 h从每组分别取出3瓶细胞，以0.2%胎盘蓝染色做活细胞记数.以天数为横坐标，每天细胞增殖数为纵坐标，作生长曲线.
, http://www.100md.com
2.3 集落形成能力实验
将对数期大肠癌细胞Lovo置于小平皿中培养24 h,弃去培养基，加入含亚甲蓝的培养基(终浓度分别为0.27、1.35、2.65 μmol/L)继续培养24 h后，弃去培养基，以生理盐水洗涤2次，胰酶消化细胞，记数.以1 000个细胞/皿分装细胞，加新培养基培养10 d.Carnnoy固定，Giemsa染色，显微镜下记数细胞集落数.按下列公式计算细胞存活率.每个浓度设3个样本.
集落形成率=集落形成数/接种细胞数×100%；
细胞存活率=给药组集落形成率/对照组集落形成率×100%.
2.4 透射电镜技术观察细胞损伤部位
取对数生长期人大肠癌细胞Lovo接种于培养瓶中，培养2天后，实验组换培养液为含0.27 μmol/L亚甲蓝的DMED培养液，对照组换不含亚甲蓝的DMED培养液，继续培养24 h.常规消化、离心，细胞团块经2.5%的戊二醛固定，1%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，醋酸铀染色，Epon812包埋.超薄切片，于透射电镜下观察.
, http://www.100md.com
3 结果
3.1 体外直接杀伤作用
由表1可见经24h作用，6.63 μmol/L亚甲蓝杀死79.4%人结肠癌细胞，53 μmol/L甲烯蓝杀死100%人结肠癌细胞.
Tab.1 The direct killing effect of methylene blue on colorectal carcinoma cell line Lovo Concentration of MB
(μmol.L-1)
Cell mortality
(%)
0.27
, http://www.100md.com
25.9
1.35
28.6
2.65
33.6
6.63
79.4
13.25
91.3
26.50
95.1
53.0
100
, 百拇医药
3.2 亚甲蓝对大肠癌细胞的体外生长抑制作用 由图1可见，0.27 μmol/L甲烯蓝即可明显抑制人结肠癌细胞Lovo增殖.
Fig.1 The inhibitary effect of methylene blue on the growth of colorectal carcinoma cell line Lovo
3.3 亚甲蓝对大肠癌细胞集落形成能力的影响
表2可见,0.27 μmol/L亚甲蓝作用24 h即对Lovo细胞的存活率具有明显的抑制作用, 亚甲蓝对该细胞存活率的抑制作用具有浓度依赖性.
3.4 细胞损伤部位
透射电镜观察表明，甲烯蓝对人结肠癌细胞Lovo的损伤部位为线粒体，表现为线粒体结构破坏、肿胀，断面呈空腔(见图2,3).
, 百拇医药
Tab.2 The effect of methylene blue on clonogenic survival of colorectal carcinoma cell line Lovo Concentration of MB
(μmol*L-1)
Survival rate
(%)
0.27
63.4
0.53
52.1
1.35
31.7
, 百拇医药
2.70
18.2
Fig.2 The Lovo cell untreated with methylene blue TEM 2000×
Fig.3 The Lovo cell treated with methylene blue TEM 2000×
4 讨论
亚甲蓝在生物氧化中广泛用作电子受氢体，氧化型显兰色，还原型无色.在电子从还原型吡啶核苷酸NAD(P)H向高铁血红蛋白传递中，亚甲蓝作为电子受体，促进高铁血红蛋白还原成血红蛋白，因此，低剂量的亚甲蓝可用以治疗亚硝酸盐、氯酸盐、醌类、醌亚胺类、苯胺及硝基苯类中毒所致的高铁血红蛋白血症, 高剂量的亚甲蓝可使高铁血红蛋白氧化为血红蛋白，因而可用于治疗氰化物中毒〔2〕.Katsuki〔3〕发现亚甲蓝可抑制NO供体激活的血浆可溶性鸟苷酸环化酶，而后，亚甲蓝广泛用作鸟苷酸环化酶抑制剂. 其作用机理尚不完全清楚，有文献报道〔4〕，亚甲蓝通过细胞氧化还原反应产生超氧阴离子自由基，抑制鸟苷酸环化酶活性.美国FDA已批准含有亚甲蓝的药物进入临床应用，对膀胱炎，尿道炎等下泌尿道平滑肌运动性增强所致的症状有明显疗效，且亚甲蓝能口服使用，毒副作用小〔5〕.
, 百拇医药
亚甲蓝对肺癌细胞的抗肿瘤作用赖百强等已作了报道〔1，6，7〕.本文研究了亚甲蓝对体外培养的人大肠癌细胞的作用, 证实其对人大肠癌细胞亦具有明显的体外杀伤和抑制作用，13.25 μmol/L亚甲蓝作用24 h可杀死79.4%的大肠癌细胞Lovo,53 μmol/L亚甲蓝作用24 h可杀死全部大肠癌细胞Lovo，0.27 μmol/L亚甲蓝即可明显抑制人结肠癌细胞Lovo增殖.透射电镜观察显示亚甲蓝损伤细胞的部位在线粒体，与赖百强等〔1〕报道亚甲蓝损伤肺癌细胞LTEP-a3的部位一致，支持有关亚甲蓝抗癌机制为干扰癌细胞NAD(P)H递氢过程，干扰其氧化还原平衡，引起癌细胞呼吸能量代谢障碍而抑制和杀伤癌细胞的推测〔8，9〕.
中国科学院“百人计划”资助项目
参考文献
1，赖百强，汪惠，刘桂芝.亚甲蓝对人肺癌细胞(LTEP-a3)的体外杀伤作用的研究.肿瘤防治研究，1990,17(1)：1～3
, 百拇医药
2，华希明.王秀清.药理学.北京:人民卫生出版社，1985.313～315
3，Katsuki S W,Mittal A C,Murad F.Stimulation of guanylate cyclase by sodium nitroprusside, nitroglycerin and nitric oxide in various tissue preparations.Adv Cyclic Nucleotide Res, 1977,3：23～31
4，Wolin M S, Cherry P O, Roclenburg J M, et al. Methylen blue inhibits vosodolation of skeletal muscle arterioles to acetylcholine and nitric oxide via the extrocellular generation of superoxide anion. J Pharmacol Exp Ther, 1990,254:872～879
, 百拇医药
5，Herman B H, Vocci F, Bridge P. The effects of NMDA receptor anagonists and nitric oxidae synthese inhibitors on opioid tolerance and withdrawal medication development issues for opiate addiction.Neuropysychopharmacology, 1995,13:271～277
6，赖百强,汪蕙,湛秀萍，等.亚甲蓝体内抗肿瘤作用及药理学的研究.中华肿瘤杂志,1989,11(2):98～100
7，赖百强,汪蕙,湛秀萍，等.亚甲蓝体内抗肿瘤作用的研究.结核病与肺部肿瘤,1988,2:1～3
8，William JM,Randal D,Steven M，et al.Modifying intracellular redox balance:an approach to improving the therapeutic index.The Lancet,1985,9：565～570
9，Hui Wang,Vipin S,Kaarl W L.Use of oxidizing dyes in combination with cyanccinnamic acid to enhance hyperthermic cytoxicity in L929 cells.Cancer Research,1987,47:3341～3345
收稿日期:1999-11-20
, http://www.100md.com