气泡法测定血清中尿激酶的活性
作者：孟德鸣 庄燕黎 史炳照
单位：上海 200437 上海医药工业研究院药理室
关键词：气泡法；尿激酶；纤溶活性；血清
中国现代应用药学000423 摘要 目的：考察气泡法可否用于血清中尿激酶(UK)的活性测定 。方法：用气泡法测定加入不同量的血清后尿激酶的活性，以及小鼠静 脉注射尿激酶后不同时间血清中尿激酶的活性。结果：随着血清量的增 加达终点的时间延长；小鼠静脉注射尿激酶后，10min后仍可检测到尿激酶的活性。结论：气泡法可用于血清中尿激酶活性的测定。
Determination of fibrinolytic activity of urokinase in serum by bubble method
Meng Deming(Meng D)，Zhuang Yanli(Zhuang YL)，Shi Bingzhao(S hi BZ)
, 百拇医药
(Dept of Pharmacology，Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 200437)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study whether bubble method could be used to determine the fibrinolytic activity of urokinase in serum.METHODS:T he effect of amount of serum on the end of reaction was investigated by bubble m ethod，and the fibrinolytic activity of urokinase in serum was determined after I V dosing in mice.RESULTS:The end of reaction was delayed when serum was added.And the fibrinolytic activity of urokinase in serum could be measured ten minutes after IV dosing in mice.CONCLUSION:Bubble method could b e used to determine the fibrinolytic activity of urokinase in serum.
, 百拇医药
KEY WORDS bubble method，urokinase，fibrinolytic activity，serum
气泡法是中国药典(1995年版)测定尿激酶(UK)效价的方法，本文将其用于血 清中UK活性的测定，并考察了血清对测定的影响，为研究UK等促纤维蛋白溶解药在血中的药 代动力学特征提供参考。
1 材 料
牛纤维蛋白原(凝蛋白83mg/支)、牛凝血酶(50BP单位/支)、牛纤维蛋白溶酶原(8酪蛋白单位 /支)、尿激酶标准品(800IU/支)由中国药品生物制品检定所提供。昆明种小鼠及Wistar大鼠 由本院实验动物房(沪动合证字107号)提供。
2 方法与结果
2.1 溶液的配制
, 百拇医药
参照文献[卫生部药政局，中国药品生物制品检定所编.中国药 品检验标准操作规范.北京：中国医药科技出版社，1996∶366]配制6.67mg/ml的牛纤维蛋 白原溶液、5.0IU/ml的牛凝血酶溶液、60IU/ml的UK标准品溶液、1.4酪蛋白单位/ml的牛纤 维蛋白溶酶原溶液。临用前将牛凝血酶溶液和牛纤维蛋白溶酶原溶液以1∶1配制成混合液。
2.2 血清对UK活性测定的影响
取试管7支，置4℃冰浴，按表1依次加 入巴比妥-氯化钠缓冲液、UK标准品溶液、血清及牛凝血酶与牛纤维蛋白溶酶原混合液，立 即摇匀后，置37℃水浴中，并分别用秒表记时。当试管中凝块内小气泡上升到反应系统体积 一半时，作为反应终点，立即记时，结果见图1、表1。
表1 血清对尿激酶活性测定的影响 样品号
空白对照
, 百拇医药
小鼠血清
大鼠血清
1
2
3
4
5
6
7
牛纤维蛋白原溶液/ml
0.3
0.3
0.3
, http://www.100md.com 0.3
0.3
0.3
0.3
巴比妥-氯化钠缓冲液/ml
0.5
0.49
0.48
0.47
0.46
0.47
0.46
尿激酶标准品/IU
, http://www.100md.com
30
30
30
30
30
30
30
血清/ml
-
0.01
0.02
0.03
0.04
, http://www.100md.com 0.03
0.04
牛凝血酶与牛纤维蛋白溶酶原混合物/ml
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
终点时间/min
5.27
7.03
, 百拇医药
8.67
11.27
14.80
>40*
>40*
注：*观察到40min还未达反应终点
图1 小鼠血清量对气泡法终点时间的影响
由图1、表1可知，用气泡法测定UK的活性，加入小鼠血清后的终点时间比空白对照明显延长 了，并且终点时间随着小鼠血清量的增加而延长。加入大鼠血清的终点时间比小鼠血清更长 。
, 百拇医药
2.3 标准曲线的制备
取试管4支，置4℃冰浴，按表2依次加入巴比 妥-氯化钠缓冲液、UK标准品溶液(60IU/ml)、小鼠血清及牛凝血酶与牛纤维蛋白溶酶原混 合液，立即摇匀后，置37℃水浴中(反应系统应在30～40秒内凝集)，分别用秒表记时。当试 管中凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时，作为反应终点，立即记时，结果见表2。以U K的血清浓度(C)的对数对终点时间(t)的对数进行回归，得标准曲线lgt=2.59-0.49lgC，r=-0.9998。
表2 尿激酶在小鼠血清中的标准曲线 样品号
1
2
3
4
, http://www.100md.com 牛纤维蛋白原溶液/ml
0.3
0.3
0.3
0.3
巴比妥-氯化钠缓冲液/ml
0.79
0.69
0.59
0.49
尿激酶标准品/IU
0.20
0.30
, http://www.100md.com
0.40
0.50
血清/ml
0.01
0.01
0.01
0.01
牛凝血酶与牛纤维蛋白溶
0.4
0.4
0.4
0.4
酶原混合物/ml
, 百拇医药
血清浓度/IU.ml-1
1200
1800
2400
3000
终点时间/min
12.02
9.78
8.52
7.67
2.4 重现性及回收率
取试管1支，置4℃冰浴，依次加入0.59ml巴比妥 -氯化钠缓冲液、0.40ml UK标准品溶液(60IU/ml)、0.01ml小鼠血清及0.4ml牛凝血酶 与牛纤维蛋白溶酶原混合液，从“立即摇匀”起操作同标准曲线项下。重复测定5次，各终 点时间的RSD为6.6%。
, 百拇医药
取试管9支，置4℃冰浴，依次加入适量巴比妥-氯化钠缓冲液、UK标准品溶液、0.01ml小鼠 血清及0.4ml牛凝血酶与 牛纤维蛋白溶酶原混合液，从“立即摇匀”起操作同标准曲线项下 。以标准曲线计算测得量，按测得量与加入量计算UK低、中、高浓度的回收率，结果见表3 。表3 UK在小鼠血清中的回收率/n= 3 加入量/IU*ml-1
测得量/IU *ml-1
回收率/%
RSD/%
1200
1255
104.6
7.3
, 百拇医药
2400
2598
108.2
7.7
3000
3198
106.6
7.8
2.5 小鼠静脉注射UK后血清中UK活性的测定
取小鼠4只，分别以2×106 IU/kg静脉注射UK，于1，2，5及10min取血，分离血清，按标 准曲线项下自“依 次加入巴比妥-氯化钠缓冲液”起，同法操作。根据标准曲线计算不同时间小鼠血清中UK的 活性，结果见表4。表4 不同时间小鼠血清中尿激酶的活性 取血时间/min
, 百拇医药
终点时间/min
尿激酶的活性/IU.ml-1
1
6.17
4646.7
2
8.75
2279.3
5
11.05
1416.3
10
, http://www.100md.com
29.97
185.22
15
>60*
-
注：*观察到60min还未达反应终点
由表3可知，UK进入血中后很快被清除，1min时在血清中的活性为4646.7 IU/ml，10min时仅 为1min时的4.0%，15min后未观察到反应终点。
3 讨 论
用气泡法测定UK的活性，加入小鼠血清后的终点时间比空白对照明显延长了，表明血清抑制 了UK的活性，而且随着血清量的增加表现得更明显。此外不同动物血清在气泡法测定UK活性 中有不同的影响。
本文所建立的气泡法测定血清中UK的活性的方法可为研究UK等促纤维蛋 白溶解药在血中的药代动力学特征作参考。
收稿日期：1999-07-26, http://www.100md.com
单位：上海 200437 上海医药工业研究院药理室
关键词：气泡法；尿激酶；纤溶活性；血清
中国现代应用药学000423 摘要 目的：考察气泡法可否用于血清中尿激酶(UK)的活性测定 。方法：用气泡法测定加入不同量的血清后尿激酶的活性，以及小鼠静 脉注射尿激酶后不同时间血清中尿激酶的活性。结果：随着血清量的增 加达终点的时间延长；小鼠静脉注射尿激酶后，10min后仍可检测到尿激酶的活性。结论：气泡法可用于血清中尿激酶活性的测定。
Determination of fibrinolytic activity of urokinase in serum by bubble method
Meng Deming(Meng D)，Zhuang Yanli(Zhuang YL)，Shi Bingzhao(S hi BZ)
, 百拇医药
(Dept of Pharmacology，Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 200437)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study whether bubble method could be used to determine the fibrinolytic activity of urokinase in serum.METHODS:T he effect of amount of serum on the end of reaction was investigated by bubble m ethod，and the fibrinolytic activity of urokinase in serum was determined after I V dosing in mice.RESULTS:The end of reaction was delayed when serum was added.And the fibrinolytic activity of urokinase in serum could be measured ten minutes after IV dosing in mice.CONCLUSION:Bubble method could b e used to determine the fibrinolytic activity of urokinase in serum.
, 百拇医药
KEY WORDS bubble method，urokinase，fibrinolytic activity，serum
气泡法是中国药典(1995年版)测定尿激酶(UK)效价的方法，本文将其用于血 清中UK活性的测定，并考察了血清对测定的影响，为研究UK等促纤维蛋白溶解药在血中的药 代动力学特征提供参考。
1 材 料
牛纤维蛋白原(凝蛋白83mg/支)、牛凝血酶(50BP单位/支)、牛纤维蛋白溶酶原(8酪蛋白单位 /支)、尿激酶标准品(800IU/支)由中国药品生物制品检定所提供。昆明种小鼠及Wistar大鼠 由本院实验动物房(沪动合证字107号)提供。
2 方法与结果
2.1 溶液的配制
, 百拇医药
参照文献[卫生部药政局，中国药品生物制品检定所编.中国药 品检验标准操作规范.北京：中国医药科技出版社，1996∶366]配制6.67mg/ml的牛纤维蛋 白原溶液、5.0IU/ml的牛凝血酶溶液、60IU/ml的UK标准品溶液、1.4酪蛋白单位/ml的牛纤 维蛋白溶酶原溶液。临用前将牛凝血酶溶液和牛纤维蛋白溶酶原溶液以1∶1配制成混合液。
2.2 血清对UK活性测定的影响
取试管7支，置4℃冰浴，按表1依次加 入巴比妥-氯化钠缓冲液、UK标准品溶液、血清及牛凝血酶与牛纤维蛋白溶酶原混合液，立 即摇匀后，置37℃水浴中，并分别用秒表记时。当试管中凝块内小气泡上升到反应系统体积 一半时，作为反应终点，立即记时，结果见图1、表1。
表1 血清对尿激酶活性测定的影响 样品号
空白对照
, 百拇医药
小鼠血清
大鼠血清
1
2
3
4
5
6
7
牛纤维蛋白原溶液/ml
0.3
0.3
0.3
, http://www.100md.com 0.3
0.3
0.3
0.3
巴比妥-氯化钠缓冲液/ml
0.5
0.49
0.48
0.47
0.46
0.47
0.46
尿激酶标准品/IU
, http://www.100md.com
30
30
30
30
30
30
30
血清/ml
-
0.01
0.02
0.03
0.04
, http://www.100md.com 0.03
0.04
牛凝血酶与牛纤维蛋白溶酶原混合物/ml
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
终点时间/min
5.27
7.03
, 百拇医药
8.67
11.27
14.80
>40*
>40*
注：*观察到40min还未达反应终点
图1 小鼠血清量对气泡法终点时间的影响
由图1、表1可知，用气泡法测定UK的活性，加入小鼠血清后的终点时间比空白对照明显延长 了，并且终点时间随着小鼠血清量的增加而延长。加入大鼠血清的终点时间比小鼠血清更长 。
, 百拇医药
2.3 标准曲线的制备
取试管4支，置4℃冰浴，按表2依次加入巴比 妥-氯化钠缓冲液、UK标准品溶液(60IU/ml)、小鼠血清及牛凝血酶与牛纤维蛋白溶酶原混 合液，立即摇匀后，置37℃水浴中(反应系统应在30～40秒内凝集)，分别用秒表记时。当试 管中凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时，作为反应终点，立即记时，结果见表2。以U K的血清浓度(C)的对数对终点时间(t)的对数进行回归，得标准曲线lgt=2.59-0.49lgC，r=-0.9998。
表2 尿激酶在小鼠血清中的标准曲线 样品号
1
2
3
4
, http://www.100md.com 牛纤维蛋白原溶液/ml
0.3
0.3
0.3
0.3
巴比妥-氯化钠缓冲液/ml
0.79
0.69
0.59
0.49
尿激酶标准品/IU
0.20
0.30
, http://www.100md.com
0.40
0.50
血清/ml
0.01
0.01
0.01
0.01
牛凝血酶与牛纤维蛋白溶
0.4
0.4
0.4
0.4
酶原混合物/ml
, 百拇医药
血清浓度/IU.ml-1
1200
1800
2400
3000
终点时间/min
12.02
9.78
8.52
7.67
2.4 重现性及回收率
取试管1支，置4℃冰浴，依次加入0.59ml巴比妥 -氯化钠缓冲液、0.40ml UK标准品溶液(60IU/ml)、0.01ml小鼠血清及0.4ml牛凝血酶 与牛纤维蛋白溶酶原混合液，从“立即摇匀”起操作同标准曲线项下。重复测定5次，各终 点时间的RSD为6.6%。
, 百拇医药
取试管9支，置4℃冰浴，依次加入适量巴比妥-氯化钠缓冲液、UK标准品溶液、0.01ml小鼠 血清及0.4ml牛凝血酶与 牛纤维蛋白溶酶原混合液，从“立即摇匀”起操作同标准曲线项下 。以标准曲线计算测得量，按测得量与加入量计算UK低、中、高浓度的回收率，结果见表3 。表3 UK在小鼠血清中的回收率/n= 3 加入量/IU*ml-1
测得量/IU *ml-1
回收率/%
RSD/%
1200
1255
104.6
7.3
, 百拇医药
2400
2598
108.2
7.7
3000
3198
106.6
7.8
2.5 小鼠静脉注射UK后血清中UK活性的测定
取小鼠4只，分别以2×106 IU/kg静脉注射UK，于1，2，5及10min取血，分离血清，按标 准曲线项下自“依 次加入巴比妥-氯化钠缓冲液”起，同法操作。根据标准曲线计算不同时间小鼠血清中UK的 活性，结果见表4。表4 不同时间小鼠血清中尿激酶的活性 取血时间/min
, 百拇医药
终点时间/min
尿激酶的活性/IU.ml-1
1
6.17
4646.7
2
8.75
2279.3
5
11.05
1416.3
10
, http://www.100md.com
29.97
185.22
15
>60*
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注：*观察到60min还未达反应终点
由表3可知，UK进入血中后很快被清除，1min时在血清中的活性为4646.7 IU/ml，10min时仅 为1min时的4.0%，15min后未观察到反应终点。
3 讨 论
用气泡法测定UK的活性，加入小鼠血清后的终点时间比空白对照明显延长了，表明血清抑制 了UK的活性，而且随着血清量的增加表现得更明显。此外不同动物血清在气泡法测定UK活性 中有不同的影响。
本文所建立的气泡法测定血清中UK的活性的方法可为研究UK等促纤维蛋 白溶解药在血中的药代动力学特征作参考。
收稿日期：1999-07-26, http://www.100md.com