颌面部火器伤损伤组织几种主要细胞外基质变化的研究
作者：秦军志 周树夏 刘荫秋
单位：秦军志(解放军323医院颌面外科，西安 710054)；周树夏(第四军医大学口腔医院颌面外科，西安 710032)；刘荫秋(第三军医大学野战外科研究所六室，重庆 400042)
关键词：颌面部；火器伤；胶原Ⅰ型；胶原Ⅲ型；纤维粘连蛋白；细胞外基质
创伤外科杂志000414 摘要：目的 探讨Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)等几种主要细胞外基质在颌面部火器伤损伤组织中的动态变化。方法 选取24条杂种犬，采用7.62mm制式枪弹，建立颌面部火器伤动物模型，应用免疫组化方法，对颌面部火器伤损伤组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和FN进行观察。结果 Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原，以及FN分布在炎性细胞和成纤维细胞中阳性率较高，尤以炎性细胞聚集区最为明显。Ⅲ型胶原主要在创伤早期含量较多，而Ⅰ型胶原和FN则分布较广，并且在损伤后持续呈高水平，FN在内皮细胞中含量较为丰富。结论 细胞外基质，尤其是Ⅰ型胶原和FN成份的变化在颌面部火器伤组织损伤反应中起重要作用。
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中图分类号：R782.403 R826.62；文献标识码：A
文章编号：1009-4237(2000)04-0229-04
Alterations of several important ECMs in injured tissues with
maxillofacial firearm trauma in dogs
QIN Jun-zhi, ZHOU Shu-xia, LIU Yin-qiu
(Department of stomatology,323th Hospital of PLA,Xian 710054)
Abstract：Objective To investigate the changes of extracellular matrix components(tyep Ⅰand type Ⅲ collagen,fibronectin) in the tissue of maxillofacial firearm trauma.Methods Twenty-four dogs were wounded with 7.62mm bullets for an animal model of maxillofacial firearm trauma,and several extracellular matrixes(ECMs) were studied by immunohistochemistry in postwounding conditions.Results TypeⅠcollagen,typeⅢcollagen and fibronectin(FN) were abundant on both inflammatory cells and fibroblasts,especially the recruitment of inflammatory cells contributed mainly to the deposition of ECMs. The typeⅢcollagen was present at the early stage postwounding,in contrast,the typeⅠcollagen and FN were found extensively at any times in the examination,and FN was rich in endothelial cells.Conclusion These observations suggest an involvement of ECMs in the regulation of maxillofacial firearm trauma, and type Ⅰcollagen and FN play more important roles in the activation of many types of cells in the maxillofacial firearm trauma.
, 百拇医药
Key words：maxillofacial；firearm trauma ；collagen Ⅰ；collagen Ⅲ； FN； ECM
创伤引起损伤组织微环境的一系列动态变化，其中包括细胞和基质的变化。细胞外基质作为细胞微环境的主要成分之一，它们不仅为多种细胞提供了粘连、迁移和附着的构架，更能对细胞表型的多方面进行调节，如基因表达、生长与分化状态等[1]。本实验应用免疫组织化学方法对Ⅰ型和Ⅲ型胶原，以及纤维粘连蛋白在颌面部火器伤不同区域损伤组织中的动态变化进行了研究。
材料与方法
1 颌面部火器伤动物模型建立及标本处理
采用国产制式7.62mm枪弹，质量7.9g，撞击速度为(742.5±7.5)m/s，射距6m，用TC-150型激光测速系统和DS-8型智能测速仪记录射速并推算致伤能量。选健康成年雄性杂种犬24条，体重(11.3±1.7)kg。全麻下将动物置于致伤架上，仰卧位，预弹着点位于下颌切迹前缘1.0cm处，致一侧下颌部软组织贯通伤，下颌骨体部后段下缘呈楔状缺损。分别于伤后6小时、1、3、7天取材观察(每个时相点6条犬)。以伤道为中心从内向外分别取0.5cm、1.5cm和2.5cm范围内肌肉组织，并切取对侧相应部位正常组织作为对照。
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2 免疫组织化学(IHC)观察
采用冰冻切片，按常规ABC染色法。切片经丙酮固定后分别经3%H2O2及正常血清处理后滴加一抗(collagenⅠ为上海医科大学产品，效价为1:100；collagenⅢ为第四军医大学产品，效价为1:500；FN为Sigma公司产品，效价为1:100)，4℃下过夜;此后依次滴加生物素化二抗及ABC复合物(美国Vector公司产品)各30分钟,最后经DAB显色。用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。应用CMIAS系列彩色图像分析系统对染色玻片进行图像分析，随机对每样本5个不同阳性区域作定量分析，且要求均匀分布于组织结构中。对平均灰度值(MG)依据情况作单因素分析或t检验。
结果
1 Ⅰ型胶原在损伤组织中的表达
正常情况下，Ⅰ型胶原有一定的表达，损伤后6小时，距伤道0.5cm肌层Ⅰ型胶原即发生增多变化,此后一直处于较高水平，伤后1天和7天较伤前明显升高(P<0.05，0.01)。不仅间质中有Ⅰ型胶原表达，而且有大量的炎细胞和成纤维细胞胞浆呈阳性。伤后1天，距伤道1.5cm肌层Ⅰ型胶原的表达较伤前和0.5cm肌层下降明显(P<0.01)(图1～3)。
, 百拇医药
2 Ⅲ型胶原在损伤组织中的表达
正常肌间质中阳性程度较低,部分血管内皮细胞呈阳性。伤后距伤道0.5cm肌层Ⅲ型胶原的表达情况与Ⅰ型胶原类似；但距伤道1.5cm肌层，在伤后7天时显著下降(P<0.01)；距伤道2.5cm肌层伤后1天、3天和7天一直处于低水平。表达细胞类型与Ⅰ型胶原相同(图4、5)。
图1 collagenⅠ免疫组化结果分析(灰度值，
±s)
图2 伤后6小时距伤道0.5cmⅠ型胶
原阳性炎细胞(ABC 10×3.3)
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图3 伤后6小时距伤道1.5cm肌束间及部分肌纤维间、成纤维细胞Ⅰ型胶原阳性(ABC 4×3.3)
图4 collagenⅢ免疫组化结果分析(灰度值，±s)
图5 伤后6小时距伤道2.5cm肌间质Ⅲ型胶
原强阳性(↑↑)(ABC 10×3.3)
图6 FN免疫组化结果分析(灰度值，±s)
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图7 伤后6小时距伤道0.5cm肌层炎细胞胞浆
FN强阳性(↑↑)(ABC 40×3.3)
3 FN在损伤组织中的表达
正常肌组织中FN表达较低，肌束间可见弱阳性。伤后6天,FN的表达即明显升高，并且在伤后早期表达最明显，至伤后7天时仍有较高的表达，而且累及各个不同的损伤区。表达细胞除了炎性细胞和成纤维细胞外，血管内皮细胞阳性率和程度均较高(图6、7)。
讨 论
创伤组织愈合过程中发生实质细胞再生和细胞外基质的产生，后者具有修补组织损伤和诱导实质细胞再生的功能，对调节创伤组织微环境状态是必要的，尤其是各种细胞因子生物活性和调节作用的发挥受到细胞外基质的很大影响。本实验对Ⅰ型和Ⅲ型胶原，以及纤维粘连蛋白(FN)在颌面部火器伤中的产生和分布作了动态观察，以探讨它们在颌面部火器伤愈合过程中的作用。
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本实验发现，正常情况下Ⅰ型胶原有一定的表达，损伤后，距伤道0.5cm肌层Ⅰ型胶原一直处于较高水平。距伤道0.5cm范围肌层受投射物直接致伤，损伤程度严重,破坏的细胞外基质能显著刺激多种细胞因子分泌参与炎症反应，使更多的炎性细胞聚集至损伤区[2]。细胞因子通过对相关细胞的趋化、分化、增殖对基质的形成发挥作用，并具有促进细胞移动、有丝分裂和胶原形成的作用[3]，同时,成纤维细胞也受到不同程度的刺激，其活化和合成Ⅰ型胶原作用表现也较为明显，因此伤后Ⅰ型胶原一直处于高表达状态。这提示，创伤组织Ⅰ型胶原的表达不仅与组织损伤程度呈现一致性，更为重要的是它与炎细胞聚集和活化反应有很大的关系，是局部损伤组织中各种细胞和细胞因子参与创伤反应的重要媒介和场所。本实验还观察到，伤后1天，距伤道1.5cm肌层Ⅰ型胶原的表达下降明显，分析可能与投射物的间接致伤效应有关。这部分肌组织受到投射物压力波的影响，在伤后1天时，一方面Ⅰ型胶原的降解加速，另一方面，炎性细胞聚集与活化能力受到抑制，以及细胞因子分泌减少，导致Ⅰ型胶原产生环节障碍。此外，直接损伤区所产生的大量细胞因子对间接损伤区炎性细胞、成纤维细胞发挥趋化作用，使其向直接损伤区迁移也有一定的关系[2～3]，从而造成间接损伤区Ⅰ型胶原表达的“一过性”下降，至伤后3天时，上述情况有所改善,故Ⅰ型胶原的表达又明显升高。对于以上结果发生的确切机制还有待进一步研究。本研究资料发现，Ⅲ型胶原的表达主要局限于距伤道0.5cm和1.5cm肌层，并且与Ⅰ型胶原类似，但距伤道1.5cm肌层在伤后7天时显著下降(P<0.01),而距伤道2.5cm肌层仅在伤后6小时有所升高,此后一直处于低水平。这说明Ⅲ型胶原尽管与Ⅰ型胶原的分布相似，但Ⅲ型胶原与损伤反应的时期有很大关系，其表达主要局限于创伤反应早期，并且在表达程度和范围上均不及Ⅰ型胶原。
, 百拇医药
FN是构成间充质组织的主要糖蛋白，其含量和分布的变化与细胞增殖、分化和细胞凋亡有密切关系。本实验中发现，伤后6小时，FN的表达即明显升高，而且愈是早期，FN表达愈明显，至伤后7天时仍有较高的表达，呈持续性和广泛性，这与创伤早期损伤和炎症反应较强有很大关系。FN不仅是炎细胞聚集和活化的重要介质，也是组织修复中成纤维细胞活化和作用过程中所必需的调节因子，FN在创伤炎症、免疫和修复中均起重要的作用。FN在血管内皮细胞中表达阳性率和程度均较高，这与Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原有所不同。这提示FN在内皮细胞激活，在各种血细胞与内皮细胞相互作用过程中起关键作用。内皮细胞能感受血管中压力的变化，并将其转化为生化信号引起内皮细胞的一系列信号转导和基因活化[4]。颌面部火器伤中投射物与组织相作用过程中可产生局部压力的剧烈变化，必然导致毛细血管内压力的改变，从而激活内皮细胞，使其合成FN的能力增强，FN产生增多，并分泌至细胞外间质中，发挥一系列调节作用。
参考文献：
, http://www.100md.com
[1]Juliano RL,Haskill S.Signal transduction from the extracellular matrix[J].J Cell Biol，1993，120(3):577-585.
[2]Gorski A.The role of cell adhesion molecules in immunopathology[J].Immunol Today，1994，15(6)：251-225.
[3]王正国.创伤病理学研究进展[J]. 中华创伤杂志，1997，13(5):266-269.
[4]Daives PF,Tripathi SC. Mechanical stress mechanisms and the cell:an endothelial paradigm.Circ Res，1993，73:239-245.
收稿日期：2000-04-24；修回日期：2000-05-29, 百拇医药
单位：秦军志(解放军323医院颌面外科，西安 710054)；周树夏(第四军医大学口腔医院颌面外科，西安 710032)；刘荫秋(第三军医大学野战外科研究所六室，重庆 400042)
关键词：颌面部；火器伤；胶原Ⅰ型；胶原Ⅲ型；纤维粘连蛋白；细胞外基质
创伤外科杂志000414 摘要：目的 探讨Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)等几种主要细胞外基质在颌面部火器伤损伤组织中的动态变化。方法 选取24条杂种犬，采用7.62mm制式枪弹，建立颌面部火器伤动物模型，应用免疫组化方法，对颌面部火器伤损伤组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和FN进行观察。结果 Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原，以及FN分布在炎性细胞和成纤维细胞中阳性率较高，尤以炎性细胞聚集区最为明显。Ⅲ型胶原主要在创伤早期含量较多，而Ⅰ型胶原和FN则分布较广，并且在损伤后持续呈高水平，FN在内皮细胞中含量较为丰富。结论 细胞外基质，尤其是Ⅰ型胶原和FN成份的变化在颌面部火器伤组织损伤反应中起重要作用。
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中图分类号：R782.403 R826.62；文献标识码：A
文章编号：1009-4237(2000)04-0229-04
Alterations of several important ECMs in injured tissues with
maxillofacial firearm trauma in dogs
QIN Jun-zhi, ZHOU Shu-xia, LIU Yin-qiu
(Department of stomatology,323th Hospital of PLA,Xian 710054)
Abstract：Objective To investigate the changes of extracellular matrix components(tyep Ⅰand type Ⅲ collagen,fibronectin) in the tissue of maxillofacial firearm trauma.Methods Twenty-four dogs were wounded with 7.62mm bullets for an animal model of maxillofacial firearm trauma,and several extracellular matrixes(ECMs) were studied by immunohistochemistry in postwounding conditions.Results TypeⅠcollagen,typeⅢcollagen and fibronectin(FN) were abundant on both inflammatory cells and fibroblasts,especially the recruitment of inflammatory cells contributed mainly to the deposition of ECMs. The typeⅢcollagen was present at the early stage postwounding,in contrast,the typeⅠcollagen and FN were found extensively at any times in the examination,and FN was rich in endothelial cells.Conclusion These observations suggest an involvement of ECMs in the regulation of maxillofacial firearm trauma, and type Ⅰcollagen and FN play more important roles in the activation of many types of cells in the maxillofacial firearm trauma.
, 百拇医药
Key words：maxillofacial；firearm trauma ；collagen Ⅰ；collagen Ⅲ； FN； ECM
创伤引起损伤组织微环境的一系列动态变化，其中包括细胞和基质的变化。细胞外基质作为细胞微环境的主要成分之一，它们不仅为多种细胞提供了粘连、迁移和附着的构架，更能对细胞表型的多方面进行调节，如基因表达、生长与分化状态等[1]。本实验应用免疫组织化学方法对Ⅰ型和Ⅲ型胶原，以及纤维粘连蛋白在颌面部火器伤不同区域损伤组织中的动态变化进行了研究。
材料与方法
1 颌面部火器伤动物模型建立及标本处理
采用国产制式7.62mm枪弹，质量7.9g，撞击速度为(742.5±7.5)m/s，射距6m，用TC-150型激光测速系统和DS-8型智能测速仪记录射速并推算致伤能量。选健康成年雄性杂种犬24条，体重(11.3±1.7)kg。全麻下将动物置于致伤架上，仰卧位，预弹着点位于下颌切迹前缘1.0cm处，致一侧下颌部软组织贯通伤，下颌骨体部后段下缘呈楔状缺损。分别于伤后6小时、1、3、7天取材观察(每个时相点6条犬)。以伤道为中心从内向外分别取0.5cm、1.5cm和2.5cm范围内肌肉组织，并切取对侧相应部位正常组织作为对照。
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2 免疫组织化学(IHC)观察
采用冰冻切片，按常规ABC染色法。切片经丙酮固定后分别经3%H2O2及正常血清处理后滴加一抗(collagenⅠ为上海医科大学产品，效价为1:100；collagenⅢ为第四军医大学产品，效价为1:500；FN为Sigma公司产品，效价为1:100)，4℃下过夜;此后依次滴加生物素化二抗及ABC复合物(美国Vector公司产品)各30分钟,最后经DAB显色。用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。应用CMIAS系列彩色图像分析系统对染色玻片进行图像分析，随机对每样本5个不同阳性区域作定量分析，且要求均匀分布于组织结构中。对平均灰度值(MG)依据情况作单因素分析或t检验。
结果
1 Ⅰ型胶原在损伤组织中的表达
正常情况下，Ⅰ型胶原有一定的表达，损伤后6小时，距伤道0.5cm肌层Ⅰ型胶原即发生增多变化,此后一直处于较高水平，伤后1天和7天较伤前明显升高(P<0.05，0.01)。不仅间质中有Ⅰ型胶原表达，而且有大量的炎细胞和成纤维细胞胞浆呈阳性。伤后1天，距伤道1.5cm肌层Ⅰ型胶原的表达较伤前和0.5cm肌层下降明显(P<0.01)(图1～3)。
, 百拇医药
2 Ⅲ型胶原在损伤组织中的表达
正常肌间质中阳性程度较低,部分血管内皮细胞呈阳性。伤后距伤道0.5cm肌层Ⅲ型胶原的表达情况与Ⅰ型胶原类似；但距伤道1.5cm肌层，在伤后7天时显著下降(P<0.01)；距伤道2.5cm肌层伤后1天、3天和7天一直处于低水平。表达细胞类型与Ⅰ型胶原相同(图4、5)。
图1 collagenⅠ免疫组化结果分析(灰度值，
±s)图2 伤后6小时距伤道0.5cmⅠ型胶
原阳性炎细胞(ABC 10×3.3)
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图3 伤后6小时距伤道1.5cm肌束间及部分肌纤维间、成纤维细胞Ⅰ型胶原阳性(ABC 4×3.3)
图4 collagenⅢ免疫组化结果分析(灰度值，
±s)图5 伤后6小时距伤道2.5cm肌间质Ⅲ型胶
原强阳性(↑↑)(ABC 10×3.3)
图6 FN免疫组化结果分析(灰度值，
±s), http://www.100md.com
图7 伤后6小时距伤道0.5cm肌层炎细胞胞浆
FN强阳性(↑↑)(ABC 40×3.3)
3 FN在损伤组织中的表达
正常肌组织中FN表达较低，肌束间可见弱阳性。伤后6天,FN的表达即明显升高，并且在伤后早期表达最明显，至伤后7天时仍有较高的表达，而且累及各个不同的损伤区。表达细胞除了炎性细胞和成纤维细胞外，血管内皮细胞阳性率和程度均较高(图6、7)。
讨 论
创伤组织愈合过程中发生实质细胞再生和细胞外基质的产生，后者具有修补组织损伤和诱导实质细胞再生的功能，对调节创伤组织微环境状态是必要的，尤其是各种细胞因子生物活性和调节作用的发挥受到细胞外基质的很大影响。本实验对Ⅰ型和Ⅲ型胶原，以及纤维粘连蛋白(FN)在颌面部火器伤中的产生和分布作了动态观察，以探讨它们在颌面部火器伤愈合过程中的作用。
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本实验发现，正常情况下Ⅰ型胶原有一定的表达，损伤后，距伤道0.5cm肌层Ⅰ型胶原一直处于较高水平。距伤道0.5cm范围肌层受投射物直接致伤，损伤程度严重,破坏的细胞外基质能显著刺激多种细胞因子分泌参与炎症反应，使更多的炎性细胞聚集至损伤区[2]。细胞因子通过对相关细胞的趋化、分化、增殖对基质的形成发挥作用，并具有促进细胞移动、有丝分裂和胶原形成的作用[3]，同时,成纤维细胞也受到不同程度的刺激，其活化和合成Ⅰ型胶原作用表现也较为明显，因此伤后Ⅰ型胶原一直处于高表达状态。这提示，创伤组织Ⅰ型胶原的表达不仅与组织损伤程度呈现一致性，更为重要的是它与炎细胞聚集和活化反应有很大的关系，是局部损伤组织中各种细胞和细胞因子参与创伤反应的重要媒介和场所。本实验还观察到，伤后1天，距伤道1.5cm肌层Ⅰ型胶原的表达下降明显，分析可能与投射物的间接致伤效应有关。这部分肌组织受到投射物压力波的影响，在伤后1天时，一方面Ⅰ型胶原的降解加速，另一方面，炎性细胞聚集与活化能力受到抑制，以及细胞因子分泌减少，导致Ⅰ型胶原产生环节障碍。此外，直接损伤区所产生的大量细胞因子对间接损伤区炎性细胞、成纤维细胞发挥趋化作用，使其向直接损伤区迁移也有一定的关系[2～3]，从而造成间接损伤区Ⅰ型胶原表达的“一过性”下降，至伤后3天时，上述情况有所改善,故Ⅰ型胶原的表达又明显升高。对于以上结果发生的确切机制还有待进一步研究。本研究资料发现，Ⅲ型胶原的表达主要局限于距伤道0.5cm和1.5cm肌层，并且与Ⅰ型胶原类似，但距伤道1.5cm肌层在伤后7天时显著下降(P<0.01),而距伤道2.5cm肌层仅在伤后6小时有所升高,此后一直处于低水平。这说明Ⅲ型胶原尽管与Ⅰ型胶原的分布相似，但Ⅲ型胶原与损伤反应的时期有很大关系，其表达主要局限于创伤反应早期，并且在表达程度和范围上均不及Ⅰ型胶原。
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FN是构成间充质组织的主要糖蛋白，其含量和分布的变化与细胞增殖、分化和细胞凋亡有密切关系。本实验中发现，伤后6小时，FN的表达即明显升高，而且愈是早期，FN表达愈明显，至伤后7天时仍有较高的表达，呈持续性和广泛性，这与创伤早期损伤和炎症反应较强有很大关系。FN不仅是炎细胞聚集和活化的重要介质，也是组织修复中成纤维细胞活化和作用过程中所必需的调节因子，FN在创伤炎症、免疫和修复中均起重要的作用。FN在血管内皮细胞中表达阳性率和程度均较高，这与Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原有所不同。这提示FN在内皮细胞激活，在各种血细胞与内皮细胞相互作用过程中起关键作用。内皮细胞能感受血管中压力的变化，并将其转化为生化信号引起内皮细胞的一系列信号转导和基因活化[4]。颌面部火器伤中投射物与组织相作用过程中可产生局部压力的剧烈变化，必然导致毛细血管内压力的改变，从而激活内皮细胞，使其合成FN的能力增强，FN产生增多，并分泌至细胞外间质中，发挥一系列调节作用。
参考文献：
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[1]Juliano RL,Haskill S.Signal transduction from the extracellular matrix[J].J Cell Biol，1993，120(3):577-585.
[2]Gorski A.The role of cell adhesion molecules in immunopathology[J].Immunol Today，1994，15(6)：251-225.
[3]王正国.创伤病理学研究进展[J]. 中华创伤杂志，1997，13(5):266-269.
[4]Daives PF,Tripathi SC. Mechanical stress mechanisms and the cell:an endothelial paradigm.Circ Res，1993，73:239-245.
收稿日期：2000-04-24；修回日期：2000-05-29, 百拇医药