动态比浊法在细菌内毒素检查的应用
作者：黎旸 林宣伟 陈巨
单位：(广东省药品检验所 广州 510180)
关键词：
广东药学000407 摘要 采用动态比浊定量法检测注射用头孢呋辛钠细菌内毒素含量，减少由于供试品本身含有细菌内毒素对检查法研究的影响。结果表明，注射用头孢呋辛钠浓度为1.25mg/ml时可排除干扰因素，以标示灵敏度为0.125Eu/ml的鲎试剂可用于本品细菌内毒素检测。
关键词 注射用头孢呋辛钠 动态比浊法 细菌内毒素检查法
头孢呋辛钠为第二代头孢菌素，临床已广泛应用。注射用头孢呋辛钠(Cefuroxime Sodium for Injection)为部标准[1]所载品种，热原检查采用家兔法。本文参照本品美国药典[2]规定，应用中国药典1995年版二部[3]细菌内毒素检查法，探讨注射用头孢呋辛钠细菌内毒素检查的可行性。一般检测方法均把供试品假定为不含细菌内毒素，因而影响实验结果的准确性，采用动态比浊定量法预先检测供试品内毒素含量，可以提高结果的可靠性。
, http://www.100md.com
1 实验材料
1.1 细菌内毒素工作标准品 规格10Eu/支，批号9606，中国药品生物制品检定所制。
1.2 鲎试剂 灵敏度0.5Eu/ml，批号981111；灵敏度0.25Eu/ml，批号990208；灵敏度0.125Eu/ml，批号980105；灵敏度0.06Eu/ml，批号980318；均为湛江海洋生物制品厂生产，使用同厂生产的细菌内毒素检查用水。
1.3 注射用头孢呋辛钠原料 批号4409102538，意大利艾西氏多布法有限公司。
1.4 细菌内毒素测定仪BET-16，天津大学无线电厂。
1.5 电热恒温水浴箱19A，德国Julabo。旋涡混合器MSI(德国)。实验所用器皿经250℃干烤1小时除去外源性内毒素。
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2 方法与结果
2.1 细菌内毒素限值(L)的确定
据文献记载[4]药品细菌内毒素限值L=K/M,本品L值为0.1Eu/mg，此值与USP(XXⅢ)规定相同。
2.2 供试品的最大有效稀释倍数和供试品浓度
供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算[3]：
MVD=CL/λ
式中C=50mg/ml,L=0.1Eu/ml。当采用λ为0.5、0.25、0.125、0.06Eu/ml的鲎试剂，MVD为10、20、40、80，其相应的供试品浓度为5、2.5、1.25、0.6mg/ml。
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2.3 鲎试剂灵敏度复核
按中国药典1995年版二部附录细菌内毒素检查法进行复核，结果显示，实验所用鲎试剂灵敏度均符合规定。结果见干扰实验。
2.4 供试品内毒素含量测定
2.4.1 标准曲线的制备 采用动态浊度定量法，用细菌内毒素测定仪检测一系列连续浓度的细菌内毒素标准品稀释液，并以细菌内毒素检查用水做阴性对照，制备标准曲线(检测时间：8400秒)。结果见图1。
图1 动态-浊度定量法标准曲线(T50归-化法)
标准曲线：LgT=2.7799+(-0.2293LgC)
相关系数：r=0.9994
, 百拇医药
浓度范围：0.03-0.5Eu/ml
鲎试剂灵敏度：0.125
2.4.2 供试品内毒素的含量 用细菌内毒素测定仪定量检测浓度为1.25mg/ml的供试品溶液(检测时间：8400秒)。结果表明本品含细菌内毒素<0.01 Eu/mg。很微量的细菌内毒素对实验结果不产生影响。
2.5 干扰试验
根据所用鲎试剂的标示灵敏度(λb)的配制供试品的相应浓度，用各个浓度的供试品溶液将细菌内毒素标准品制成不同浓度细菌内毒素溶液，按鲎试剂灵敏度复核方法检测，并用细菌内毒素检查用水做阴性对照，当Et值在0.5Es～2.0Es(包括0.5Es和2.0Es)时，则认为供试品在该浓度时对鲎试验不存在干扰作用[3]。结果见表1。
表1 注射用头孢呋辛钠干扰实验结果(n=3) 标示λbEu/ml
, 百拇医药
供试品
浓度
细菌内毒素浓度(Eu/ml)
阴性
对照
Es
Et
1
0.5
0.25
0.125
0.06
0.03
, 百拇医药
0.015
0.5
无热原水
+
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0.25
10
(5mg/ml)
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, 百拇医药
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0.21
0.25
无热原水
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0.125
, 百拇医药
20
(2.5mg/ml)
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+
+
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+
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-
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0.06
0.125
无热原水
+
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, http://www.100md.com
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, 百拇医药
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0.125
40
(1.25mg/ml)
+
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+
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, 百拇医药
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0.07
0.06
, http://www.100md.com
无热原水
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, 百拇医药
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0.087
80
(0.6mg/ml)
+
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, 百拇医药
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-
0.05
从表1看出，供试品的浓度为5mg/ml(MVD=10)和2.5mg/ml(MVD=20)时有干扰作用。最高无抑制浓度为1.25mg/ml，最大有效稀释倍数为40。结果和USP(XXⅢ)收载标准相同。
3 讨论
3.1 本文采用动态浊度定量法检测注射用头孢呋辛钠的细菌内毒素，可以减少供试品本身含有细菌内毒素对实验结果的影响。
3.2 本品对细菌内毒素检查有一定干扰作用，但供试品浓度为1.25mg/ml时可排除干扰因素。以标示灵敏度为0.125Eu/ml或更高灵敏度的鲎试剂可用于样品的细菌内毒素检测，此法与USP(XXⅢ)收载方法一致，细菌内毒素限值相同。
参考文献
1.中华人民共和国卫生部部标准WS-007(X-006)-96
2.USPXXⅢ，1995：317，1696
3.中国药典1995版二部.附录76
4.夏振民.药品细菌内毒素检查的限值.药物分析杂志.1995，15(3)：54
(收稿：2000-02-17), 百拇医药
单位：(广东省药品检验所 广州 510180)
关键词：
广东药学000407 摘要 采用动态比浊定量法检测注射用头孢呋辛钠细菌内毒素含量，减少由于供试品本身含有细菌内毒素对检查法研究的影响。结果表明，注射用头孢呋辛钠浓度为1.25mg/ml时可排除干扰因素，以标示灵敏度为0.125Eu/ml的鲎试剂可用于本品细菌内毒素检测。
关键词 注射用头孢呋辛钠 动态比浊法 细菌内毒素检查法
头孢呋辛钠为第二代头孢菌素，临床已广泛应用。注射用头孢呋辛钠(Cefuroxime Sodium for Injection)为部标准[1]所载品种，热原检查采用家兔法。本文参照本品美国药典[2]规定，应用中国药典1995年版二部[3]细菌内毒素检查法，探讨注射用头孢呋辛钠细菌内毒素检查的可行性。一般检测方法均把供试品假定为不含细菌内毒素，因而影响实验结果的准确性，采用动态比浊定量法预先检测供试品内毒素含量，可以提高结果的可靠性。
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1 实验材料
1.1 细菌内毒素工作标准品 规格10Eu/支，批号9606，中国药品生物制品检定所制。
1.2 鲎试剂 灵敏度0.5Eu/ml，批号981111；灵敏度0.25Eu/ml，批号990208；灵敏度0.125Eu/ml，批号980105；灵敏度0.06Eu/ml，批号980318；均为湛江海洋生物制品厂生产，使用同厂生产的细菌内毒素检查用水。
1.3 注射用头孢呋辛钠原料 批号4409102538，意大利艾西氏多布法有限公司。
1.4 细菌内毒素测定仪BET-16，天津大学无线电厂。
1.5 电热恒温水浴箱19A，德国Julabo。旋涡混合器MSI(德国)。实验所用器皿经250℃干烤1小时除去外源性内毒素。
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2 方法与结果
2.1 细菌内毒素限值(L)的确定
据文献记载[4]药品细菌内毒素限值L=K/M,本品L值为0.1Eu/mg，此值与USP(XXⅢ)规定相同。
2.2 供试品的最大有效稀释倍数和供试品浓度
供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算[3]：
MVD=CL/λ
式中C=50mg/ml,L=0.1Eu/ml。当采用λ为0.5、0.25、0.125、0.06Eu/ml的鲎试剂，MVD为10、20、40、80，其相应的供试品浓度为5、2.5、1.25、0.6mg/ml。
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2.3 鲎试剂灵敏度复核
按中国药典1995年版二部附录细菌内毒素检查法进行复核，结果显示，实验所用鲎试剂灵敏度均符合规定。结果见干扰实验。
2.4 供试品内毒素含量测定
2.4.1 标准曲线的制备 采用动态浊度定量法，用细菌内毒素测定仪检测一系列连续浓度的细菌内毒素标准品稀释液，并以细菌内毒素检查用水做阴性对照，制备标准曲线(检测时间：8400秒)。结果见图1。
图1 动态-浊度定量法标准曲线(T50归-化法)
标准曲线：LgT=2.7799+(-0.2293LgC)
相关系数：r=0.9994
, 百拇医药
浓度范围：0.03-0.5Eu/ml
鲎试剂灵敏度：0.125
2.4.2 供试品内毒素的含量 用细菌内毒素测定仪定量检测浓度为1.25mg/ml的供试品溶液(检测时间：8400秒)。结果表明本品含细菌内毒素<0.01 Eu/mg。很微量的细菌内毒素对实验结果不产生影响。
2.5 干扰试验
根据所用鲎试剂的标示灵敏度(λb)的配制供试品的相应浓度，用各个浓度的供试品溶液将细菌内毒素标准品制成不同浓度细菌内毒素溶液，按鲎试剂灵敏度复核方法检测，并用细菌内毒素检查用水做阴性对照，当Et值在0.5Es～2.0Es(包括0.5Es和2.0Es)时，则认为供试品在该浓度时对鲎试验不存在干扰作用[3]。结果见表1。
表1 注射用头孢呋辛钠干扰实验结果(n=3) 标示λbEu/ml
, 百拇医药
供试品
浓度
细菌内毒素浓度(Eu/ml)
阴性
对照
Es
Et
1
0.5
0.25
0.125
0.06
0.03
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0.015
0.5
无热原水
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0.25
10
(5mg/ml)
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0.21
0.25
无热原水
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0.125
, 百拇医药
20
(2.5mg/ml)
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0.06
0.125
无热原水
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, 百拇医药
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0.125
40
(1.25mg/ml)
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0.07
0.06
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无热原水
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, 百拇医药
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0.087
80
(0.6mg/ml)
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, 百拇医药
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0.05
从表1看出，供试品的浓度为5mg/ml(MVD=10)和2.5mg/ml(MVD=20)时有干扰作用。最高无抑制浓度为1.25mg/ml，最大有效稀释倍数为40。结果和USP(XXⅢ)收载标准相同。
3 讨论
3.1 本文采用动态浊度定量法检测注射用头孢呋辛钠的细菌内毒素，可以减少供试品本身含有细菌内毒素对实验结果的影响。
3.2 本品对细菌内毒素检查有一定干扰作用，但供试品浓度为1.25mg/ml时可排除干扰因素。以标示灵敏度为0.125Eu/ml或更高灵敏度的鲎试剂可用于样品的细菌内毒素检测，此法与USP(XXⅢ)收载方法一致，细菌内毒素限值相同。
参考文献
1.中华人民共和国卫生部部标准WS-007(X-006)-96
2.USPXXⅢ，1995：317，1696
3.中国药典1995版二部.附录76
4.夏振民.药品细菌内毒素检查的限值.药物分析杂志.1995，15(3)：54
(收稿：2000-02-17), 百拇医药