2型糖尿病患者胰升糖素受体基因的PCR-DGGE扫查
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中国糖尿病杂志 2000年第4期第8卷 论著
昆明医学院第一附属医院内分泌科 邮政编码 650032 宋滇平 王玉明 段勇 杨慧英 赵 淮 刘 华 杨绍稳 谷燕珊
关键词：2型糖尿病；胰升糖素受体基因；聚合酶链反应-变性梯度；凝胶电泳
摘要：
中国糖尿病杂志000401 摘要 目的 探讨胰升糖素受体(GCG-R)基因在中国人2 型糖尿病遗传背景中的地位。方法 运用聚合酶链反应-变性梯度 凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对200例无亲缘关系之中国云南昆明地区汉族人(2型糖尿病患者12 0例，健康对照者80例)的GCG-R基因编码区进行了分子扫查。结果 仅发现2例2型糖尿病患者及1例健康对照者的GCG-R基因第7外显子存在多态变异带型，这 一杂合子多态变异基因型在2型糖尿病组和对照组中的发生频率分别为0.017和0.013，两 者之间无显著性差异。此外，研究对象GCG-R基因其它编码区的PCR-DGGE扫查均未发现异 常泳动片段。结论 GCG-R基因可能不是中国昆明地区汉族人2型糖 尿病的主要致病基因。
, 百拇医药
PCR-DGGE scanning of the glucagon receptor gene in Chinese pat ients
with type 2 diabetes mellitus
Song Dianping,Wang Yuming,Duan Yong,et al
(The First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650 032)
Abstract Objective To probe the role of the glucagon rec eptor (GCG-R) gene in the background of type 2 diabetes mellitus in Chinese.Methods A total of 200 unrelated Chinese subjects (120 patie nts with type 2 diabetes and 80 nondiabetic control individuals without family h istory of diabetes) from Kunming were screened for the presence of the polymorph i c variants in codon domains of the GCG-R gene by use of polymerase chain reacti on-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE).Results Only a heterozygous polymorphic band was observed in exon 7 in 2 diabetic s and 1 control person and no differences in the frequencies of this abnormal co nformer were found between diabetic patients and control group.No other abnormal band patterns in codon regions of the GCG-R gene were showed in all of the sub jects investigated,including type 2 diabetics and controls.Conclusion The results suggested that the GCG-R gene is not the causative gen e responsible for the occurrence of type 2 diabetes mellitus in Chinese and indi cated the genetic heterogeneity of type 2 diabetes mellitus in different ethnic populations.
, 百拇医药
Key words Type 2 diabetes mellitus Glucagon receptor gen e Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis
2型糖尿病的确切病因和发病机制迄今尚未完全明了，目前普遍认为它是一种 具有多基因遗传背景的多因子疾病。国内外大量研究发现有多个基因或基因位点的变异与2 型糖尿病相关，但不同地区和不同人种之间却存在着明显差异，这就表明2型糖尿病不仅具 有强烈的遗传倾向，而且有着明显的遗传异质性。最近国外有人在不同地区和不同人种中就 胰升糖素受体(GCG-R)基因与2型糖尿病的关系进行了研究，所得结论却不尽相同。我们运 用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对2型糖尿病患者的GCG-R基因编码区进行分子扫查和比较分析，意在探讨GCG-R基因在中国人2型糖尿病遗传背景中的地位。
对象和方法
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一、对象
200例无亲缘关系之中国云南昆明地区汉族人。其中根据WHO诊断标准确诊为2型糖尿病的患 者120例，男47例，女73例，年龄38～77岁，平均56.26±9.33岁，BMI 23.09±3.18； 无糖尿病家族史的健康对照者80例，男32例，女48例，年龄34～75岁，平均55.48±11.21 岁，BMI 22.92±2.81。
二、方法
采用酚/氯仿法自人血白细胞提取基因组DNA为模板[1]，根据文献[2]设计 富含GC碱基(GC-clamp)之GCG-R基因各个外显子的引物序列(附表)，参照文献[ 3]的方法应用PCR扩增出含有GC-clamp之GCG-R基因的各个外显子片段，并以PCR扩增产 物10μl与等量的载样缓冲液混合后进行DGGE扫查。电泳结束后用50μg/ml溴乙锭/1×TAE染 色10分钟，再用1×TAE缓冲液浸泡5分钟退去部分杂色后，使用Gel Doc 1000紫外检测系统 观察电泳结果。
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附表 GCG-R基因各个外显子的引物序列 外显子
上游引物
下游引物
片段长度(bp)
1
5’GTACACACACACACGGACTG3’
5’TCAGTGTGCAGTCCTCACAG3’
196
2
5’TGTCTGGTTGCTTGTGCATG3’
5’GAAGAGAACTCAGGAAGTGC3’
, 百拇医药
196
3
5’CTCAGGCTTCCAGAGAGAGG3’
5’CACAGTTCCTCCCCTCTATG3’
227
4
5’CATAGAGGGGAGGAACTGTG3’
5’GAGTTACAGTGGCCTGTGAG3’
280
5，6
5’CTCACAGGCCACTGTAACTC3’
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5’TGGTACAGGTGCAGTGTGAG3’
455
7
5’TCACACTGCACCTGTACCAG3’
5’CTTGGTCAGCCTGCCTTAAC3’
224
8
5’GTTAAGGCAGGCTGACCAAG3’
5’GGGAGAAGGTCACAAATGAC3’
240
9
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5’TGTGCCCCAGTATGTGAGTG3’
5’AGACAGGATGCTGCTGTCTC3’
191
10
5’CCAAGGGCACAGAGCTGTTC3’
5’CACCATCCACGTGGAGCTTG3’
246
11，12
5’AAGCTCCACGTGGATGGTGC3’
5’GTGCTGATGGTCTCAGATGC3’
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351
13
5’AGGCCCTAGGACTGGCCTGC3’
5’CAGAGTCCAGCCCTAGCTGG3’
277
GC-clamp CGCCGCCGCCGCCCGCGCCGCCGCCGCCCGCGCCGCCGCC 加在上游引物的5’端
附图 GCG-R基因Exon 7的PCR-DGGE
P为2型糖尿病患者；C为健康对照者
三、试剂和仪器
, 百拇医药
寡核苷酸引物(上海生工生物工程公司)，Taq酶(华美生物工程公司)，dNTP(Promega,USA)， 丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、甲酰胺和尿素(BIO-RAD，USA)，PE9600基因扩增仪(USA)，BI O-RAD Power Pac 3000型电泳仪(USA)，D GENE SYSTEM和Gel DOC1000紫外检测系统 (USA)。
四、数据处理
读取并比较各个体样本的电泳图型，计算多态变异带型的发生频率。组间计数资料比较采用 χ2检验。
结 果
2例2型糖尿病患者及1例健康对照者其GCG-R基因第7外显子存在有杂合子多态变异带型(附 图)，这一杂合子多态变异基因型在2型糖尿病组和对照组中的发生频率分别为0.017和0.0 13，两者之间无显著性差异(χ2=0.056,P>0.1)。除此之外，在对研究对象GCG-R 基因其它编码区的PCR-DGGE扫查中均未发现异常泳动片段。
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讨 论
2型糖尿病是一种由各种遗传及环境因素共同作用引起的以血糖增高为主要特征的复杂病(co mplex disease)。其发病涉及胰岛素作用不足、胰岛素抵抗、胰岛邻分泌失调等多个环节， 且具显著的种族异质性。由于胰升糖素与其特异性受体结合后在控制肝糖输出方面具有重要 作用并参与调节胰岛素分泌[4～6]，因此将GCG-R基因视为2型糖尿病多基因遗传 背景中的一个候选基因加以研究，理论上有其一定的合理性。1995年Hager等[2]首 先报道了应用PCR-SSCP和DNA测序技术对法兰西人和撒丁岛人常见型2型糖尿病患者GCG-R 基因的研究结果，发现80例2型糖尿病患者中20%其第五外显子上存在有一无意义突变，6.3 %其第二外显子40号密码子存在有一错义突变(Gly40Ser)，而159例无糖尿病家族史的中年对 照者和15例MODY患者中却无一例有此错义突变。针对这一发现，Hager等又应用PCR-RFLP技 术扩大样本进行研究，证实GCG-R基因Gly40Ser突变与法兰西人和撒丁岛人常见型2型糖尿 病显著相关，引起了人们的关注。近年来，东西方为数不多的学者先后在不同地区的不同人 种中就此突变与2型糖尿病的关系进行了研究，所得结论却不尽一致。我们应用PCR-DGGE技 术对中国人GCG-R基因编码区进行扫查，结果仅发现2例2型糖尿病患者及1例健康对照者其G CG-R基因第7外显子存在有杂合子多态变异带型，且这一杂合子多态变异基因型在2型糖尿 病组和对照组中的发生频率并无显著性差异。此外，在对所有研究对象GCG-R基因其它编码 区的PCR-DGGE扫查中均未发现异常泳动片段。初步表明，GCG-R基因可能不是中国昆明汉 族人2型糖尿病的主要致病基因。由此看来，GCG-R基因在2型糖尿病遗传因素中的地位尚难 以确定，其参与2型糖尿病发病可能存在种族或地域异质性。
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本课题由云南省应用基础研究基金和人事部非教育系统留学回国人员科教 活动择优资助经费资助
参 考 文 献
1，段 勇，王玉明，赵 淮，等.从血细胞快速抽提DNA的方法探讨.昆明医学院学 报，1998，19：28.
2，Hager J,Hansen L,Vaisse C,et al.A missense mutation in the glucagon receptor g ene is associated with non-insulin-dependent diabetes mellitus.Nature Genetics ,1995,9:299.
3，段 勇，王玉明，宋滇平，等.应用PCR扩增GRG受体基因第二外显子的实验条件研究.陕西 医学检验，1998，13：24.
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4，Levebre P,Paolisso G,Scheen A.The role of glucagon in non-insulin-dependent (type 2) diabetes mellitus.In:Sakamoto N,et al.(eds).New directions in research and clinical works for obesity and diabetes mellitus.1st ed.Elsevier:Science Pub lishers BV.1991:25～29.
5，Baron AD,Schaeffer L,Shragg P,et al.Role of hyperglucagonemia in maintenance o f increased rates of hepatic glucose output in type 2 diabetics.Diabetes,1987,36 :274.
, 百拇医药 6，Segre GV,Goldring SR.Receptors for secretin,calcitonin,parathyroid hormone (PT H)/PTH-related peptide,vasoactive intestinal peptide,glucagonlike peptide 1,gro wth hormone-releasing hormone and glucagon belong to a newly discovered G-prot ein-linked receptor fa-mily.TEM,1993,4:309.
收稿：1999-07-13
修回：2000-01-18, http://www.100md.com
关键词：2型糖尿病；胰升糖素受体基因；聚合酶链反应-变性梯度；凝胶电泳
摘要：
中国糖尿病杂志000401 摘要 目的 探讨胰升糖素受体(GCG-R)基因在中国人2 型糖尿病遗传背景中的地位。方法 运用聚合酶链反应-变性梯度 凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对200例无亲缘关系之中国云南昆明地区汉族人(2型糖尿病患者12 0例，健康对照者80例)的GCG-R基因编码区进行了分子扫查。结果 仅发现2例2型糖尿病患者及1例健康对照者的GCG-R基因第7外显子存在多态变异带型，这 一杂合子多态变异基因型在2型糖尿病组和对照组中的发生频率分别为0.017和0.013，两 者之间无显著性差异。此外，研究对象GCG-R基因其它编码区的PCR-DGGE扫查均未发现异 常泳动片段。结论 GCG-R基因可能不是中国昆明地区汉族人2型糖 尿病的主要致病基因。
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PCR-DGGE scanning of the glucagon receptor gene in Chinese pat ients
with type 2 diabetes mellitus
Song Dianping,Wang Yuming,Duan Yong,et al
(The First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650 032)
Abstract Objective To probe the role of the glucagon rec eptor (GCG-R) gene in the background of type 2 diabetes mellitus in Chinese.Methods A total of 200 unrelated Chinese subjects (120 patie nts with type 2 diabetes and 80 nondiabetic control individuals without family h istory of diabetes) from Kunming were screened for the presence of the polymorph i c variants in codon domains of the GCG-R gene by use of polymerase chain reacti on-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE).Results Only a heterozygous polymorphic band was observed in exon 7 in 2 diabetic s and 1 control person and no differences in the frequencies of this abnormal co nformer were found between diabetic patients and control group.No other abnormal band patterns in codon regions of the GCG-R gene were showed in all of the sub jects investigated,including type 2 diabetics and controls.Conclusion The results suggested that the GCG-R gene is not the causative gen e responsible for the occurrence of type 2 diabetes mellitus in Chinese and indi cated the genetic heterogeneity of type 2 diabetes mellitus in different ethnic populations.
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Key words Type 2 diabetes mellitus Glucagon receptor gen e Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis
2型糖尿病的确切病因和发病机制迄今尚未完全明了，目前普遍认为它是一种 具有多基因遗传背景的多因子疾病。国内外大量研究发现有多个基因或基因位点的变异与2 型糖尿病相关，但不同地区和不同人种之间却存在着明显差异，这就表明2型糖尿病不仅具 有强烈的遗传倾向，而且有着明显的遗传异质性。最近国外有人在不同地区和不同人种中就 胰升糖素受体(GCG-R)基因与2型糖尿病的关系进行了研究，所得结论却不尽相同。我们运 用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对2型糖尿病患者的GCG-R基因编码区进行分子扫查和比较分析，意在探讨GCG-R基因在中国人2型糖尿病遗传背景中的地位。
对象和方法
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一、对象
200例无亲缘关系之中国云南昆明地区汉族人。其中根据WHO诊断标准确诊为2型糖尿病的患 者120例，男47例，女73例，年龄38～77岁，平均56.26±9.33岁，BMI 23.09±3.18； 无糖尿病家族史的健康对照者80例，男32例，女48例，年龄34～75岁，平均55.48±11.21 岁，BMI 22.92±2.81。
二、方法
采用酚/氯仿法自人血白细胞提取基因组DNA为模板[1]，根据文献[2]设计 富含GC碱基(GC-clamp)之GCG-R基因各个外显子的引物序列(附表)，参照文献[ 3]的方法应用PCR扩增出含有GC-clamp之GCG-R基因的各个外显子片段，并以PCR扩增产 物10μl与等量的载样缓冲液混合后进行DGGE扫查。电泳结束后用50μg/ml溴乙锭/1×TAE染 色10分钟，再用1×TAE缓冲液浸泡5分钟退去部分杂色后，使用Gel Doc 1000紫外检测系统 观察电泳结果。
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附表 GCG-R基因各个外显子的引物序列 外显子
上游引物
下游引物
片段长度(bp)
1
5’GTACACACACACACGGACTG3’
5’TCAGTGTGCAGTCCTCACAG3’
196
2
5’TGTCTGGTTGCTTGTGCATG3’
5’GAAGAGAACTCAGGAAGTGC3’
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196
3
5’CTCAGGCTTCCAGAGAGAGG3’
5’CACAGTTCCTCCCCTCTATG3’
227
4
5’CATAGAGGGGAGGAACTGTG3’
5’GAGTTACAGTGGCCTGTGAG3’
280
5，6
5’CTCACAGGCCACTGTAACTC3’
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5’TGGTACAGGTGCAGTGTGAG3’
455
7
5’TCACACTGCACCTGTACCAG3’
5’CTTGGTCAGCCTGCCTTAAC3’
224
8
5’GTTAAGGCAGGCTGACCAAG3’
5’GGGAGAAGGTCACAAATGAC3’
240
9
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5’TGTGCCCCAGTATGTGAGTG3’
5’AGACAGGATGCTGCTGTCTC3’
191
10
5’CCAAGGGCACAGAGCTGTTC3’
5’CACCATCCACGTGGAGCTTG3’
246
11，12
5’AAGCTCCACGTGGATGGTGC3’
5’GTGCTGATGGTCTCAGATGC3’
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13
5’AGGCCCTAGGACTGGCCTGC3’
5’CAGAGTCCAGCCCTAGCTGG3’
277
GC-clamp CGCCGCCGCCGCCCGCGCCGCCGCCGCCCGCGCCGCCGCC 加在上游引物的5’端
附图 GCG-R基因Exon 7的PCR-DGGE
P为2型糖尿病患者；C为健康对照者
三、试剂和仪器
, 百拇医药
寡核苷酸引物(上海生工生物工程公司)，Taq酶(华美生物工程公司)，dNTP(Promega,USA)， 丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、甲酰胺和尿素(BIO-RAD，USA)，PE9600基因扩增仪(USA)，BI O-RAD Power Pac 3000型电泳仪(USA)，D GENE SYSTEM和Gel DOC1000紫外检测系统 (USA)。
四、数据处理
读取并比较各个体样本的电泳图型，计算多态变异带型的发生频率。组间计数资料比较采用 χ2检验。
结 果
2例2型糖尿病患者及1例健康对照者其GCG-R基因第7外显子存在有杂合子多态变异带型(附 图)，这一杂合子多态变异基因型在2型糖尿病组和对照组中的发生频率分别为0.017和0.0 13，两者之间无显著性差异(χ2=0.056,P>0.1)。除此之外，在对研究对象GCG-R 基因其它编码区的PCR-DGGE扫查中均未发现异常泳动片段。
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2型糖尿病是一种由各种遗传及环境因素共同作用引起的以血糖增高为主要特征的复杂病(co mplex disease)。其发病涉及胰岛素作用不足、胰岛素抵抗、胰岛邻分泌失调等多个环节， 且具显著的种族异质性。由于胰升糖素与其特异性受体结合后在控制肝糖输出方面具有重要 作用并参与调节胰岛素分泌[4～6]，因此将GCG-R基因视为2型糖尿病多基因遗传 背景中的一个候选基因加以研究，理论上有其一定的合理性。1995年Hager等[2]首 先报道了应用PCR-SSCP和DNA测序技术对法兰西人和撒丁岛人常见型2型糖尿病患者GCG-R 基因的研究结果，发现80例2型糖尿病患者中20%其第五外显子上存在有一无意义突变，6.3 %其第二外显子40号密码子存在有一错义突变(Gly40Ser)，而159例无糖尿病家族史的中年对 照者和15例MODY患者中却无一例有此错义突变。针对这一发现，Hager等又应用PCR-RFLP技 术扩大样本进行研究，证实GCG-R基因Gly40Ser突变与法兰西人和撒丁岛人常见型2型糖尿 病显著相关，引起了人们的关注。近年来，东西方为数不多的学者先后在不同地区的不同人 种中就此突变与2型糖尿病的关系进行了研究，所得结论却不尽一致。我们应用PCR-DGGE技 术对中国人GCG-R基因编码区进行扫查，结果仅发现2例2型糖尿病患者及1例健康对照者其G CG-R基因第7外显子存在有杂合子多态变异带型，且这一杂合子多态变异基因型在2型糖尿 病组和对照组中的发生频率并无显著性差异。此外，在对所有研究对象GCG-R基因其它编码 区的PCR-DGGE扫查中均未发现异常泳动片段。初步表明，GCG-R基因可能不是中国昆明汉 族人2型糖尿病的主要致病基因。由此看来，GCG-R基因在2型糖尿病遗传因素中的地位尚难 以确定，其参与2型糖尿病发病可能存在种族或地域异质性。
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本课题由云南省应用基础研究基金和人事部非教育系统留学回国人员科教 活动择优资助经费资助
参 考 文 献
1，段 勇，王玉明，赵 淮，等.从血细胞快速抽提DNA的方法探讨.昆明医学院学 报，1998，19：28.
2，Hager J,Hansen L,Vaisse C,et al.A missense mutation in the glucagon receptor g ene is associated with non-insulin-dependent diabetes mellitus.Nature Genetics ,1995,9:299.
3，段 勇，王玉明，宋滇平，等.应用PCR扩增GRG受体基因第二外显子的实验条件研究.陕西 医学检验，1998，13：24.
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5，Baron AD,Schaeffer L,Shragg P,et al.Role of hyperglucagonemia in maintenance o f increased rates of hepatic glucose output in type 2 diabetics.Diabetes,1987,36 :274.
, 百拇医药 6，Segre GV,Goldring SR.Receptors for secretin,calcitonin,parathyroid hormone (PT H)/PTH-related peptide,vasoactive intestinal peptide,glucagonlike peptide 1,gro wth hormone-releasing hormone and glucagon belong to a newly discovered G-prot ein-linked receptor fa-mily.TEM,1993,4:309.
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