一氧化氮合酶抑制剂对深低温停循环后脑再灌注损伤的保护作用
作者：管玉龙 杜月河 何美玲 杨璟 万彩红 杜顺平 董培青
单位：管玉龙 何美玲 杨璟 董培青(100029 北京市，首都医科大学附属北京安贞医院 体外循环科)；杜月河 杜顺平(100029 北京市，首都医科大学附属北京安贞医院 实验外科)；万彩红(太原市山西省人 民医院 病理科)
关键词：一氧化氮；体外循环；再灌注损伤
中国循环杂志000428 摘要 目的：研究一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)对深低温停循环(DHCA)后脑再灌注损伤的保护作用。
方法：8只幼猪随机分为实验组(n＝4)和对照组(n＝4)，建立体外循环(CPB)，行DHCA 90分后恢复灌流120分，实验组动物静脉注射L-NAME 1.5 mg/kg，随后在60分内再给予相同的剂量。
, http://www.100md.com 结果：实验组Na+-K+三磷酸腺苷酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力明显高于对照组，丙二醛含量低于对照组。病理检查及电子显微镜超微结构显示实验组与对照组细胞损伤存在显著性差异(P<0.05)。
结论：L-NAME对DHCA后脑再灌注损伤有保护作用。
中图分类号：R654.1 文献标识码：A
文章编号：1000—3614(2000)04—0244—02
The Effect of Nitric Oxide Synthase Inhibitor on Reperfusion Injury of the Brain under Deep Hypothermic Circulatory Arrest
Guan Yulong Du Yuehe He Meiling et al.
, 百拇医药
(Department of Extracorporeal Circulation,Beijing Anzhen Hospital,Capital Medical University,Beijing 100029)
Abstract Objective:To investigate the protective effects of nitric oxide synthase inhibitor (NG-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride L-NAME) on reperfusion injury of the brain under deep hypothermic circulatory arrest(DHCA).
Methods:After cardiopulmonary bypass was established in 8 piglets,circulatory arrest was performed for 90 minutes followed by reperfusion 120 minutes.In the treatment group,L-NAME was administered with an intravenous injection of 1.5 mg/kg at the onset of the reperfusion followed by a 60-minute continuous venous infusion of 1.5 mg/kg.
, 百拇医药
Results:A significant difference was observed between the groups regarding the concentrations of ATPase,superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-PX)，malondialdehyde (MDA).The morphological change and ultrastructure of neuron all showed milder injury in treatment group than that in control group.
Conclusion:The results suggest that L-NAME protects the brain against reperfusion injury under deep hypothermic circulatory arrest.
, 百拇医药
Key words Nitric oxide;Cardiopulmonary bypass;Reperfusion injury
深低温停循环(DHCA)超过安全时限时，脑组织将发生缺血缺氧损伤。其损伤机制主要与氧债及谷氨酸的兴奋性毒性有关。文献报道一氧化氮参与并介导了谷氨酸的兴奋性毒性。本实验通过对比DHCA后脑组织的各种酶学及组织细胞结构的改变，研究一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)对脑组织损伤的保护作用，为进一步研究DHCA脑组织损伤机制及寻找更好的脑组织保护方法提供依据。
1 材料与方法
研究对象 1998年10月～12月选取8只健康小型幼猪(北京农业大学培育)，体重16～20 kg，随机分为两组：实验组(n＝4)在DHCA 90分恢复体外循环(CPB)后给予L-NAME 1.5 mg/kg，并在60分内再重复相同的剂量1次；对照组(n＝4)在相同时间点给予等量的生理盐水。
, http://www.100md.com
研究方法 对幼猪采取硫喷妥钠30～50 mg/kg腹腔注射，气管切开插管，呼吸机辅助呼吸。正中劈开胸骨建立CPB，转流降温至鼻、咽温达18℃，肛温达20℃，停CPB。90分后恢复CPB并复温，实验组给予L-NAME。120分后鼻、咽温达37℃，肛温达35℃，停CPB。取大脑、小脑皮层组织，采用化学比色法测定Na+-K+三磷酸腺苷酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力及丙二醛含量，并行组织病理和电子显微镜检查。
统计学处理 数据用
±s表示，用SPSS 7.0软件处理，采用t检验进行组间对照分析。
2 结果
2.1 酶活力检测
实验组大脑、小脑皮层组织Na+-K+三磷酸腺苷酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力明显高于对照组，丙二醛含量低于对照组(表1)。
, http://www.100md.com
表1 大脑、小脑皮层组织在实验组与对照组中各项酶学活力及丙二醛含量的测定(±s)
Na+-K+三磷酸腺苷酶活力
(μmol/mgprot)
超氧化物歧化酶活力
(NU/mgprot)
谷胱甘肽过氧化物酶活力
(NU/mgprot)
丙二醛含量
(nmol/mgprot)
, 百拇医药
大脑
实验组
2.42±0.11*
318.37±4.99**
20.17±3.42**
5.94±0.36*
对照组
2.12±0.15
259.85±1.86
5.97±1.65
6.53±0.22
, 百拇医药
小脑
实验组
1.12±0.05**
277.79±9.91**
33.94±4.10**
0.72±0.02
对照组
0.50±0.04
223.70±13.81
7.23±1.43
0.75±0.02
, 百拇医药
注：与对照组相比*P<0.05 **P<0.01
2.2 组织病理检查
DHCA后脑组织病理改变程度不等，部分细胞可见缺血性改变。对光学显微镜下视野的病变神经细胞进行定量分析(病变细胞占细胞总数的百分比)，发现实验组大脑及小脑皮层组织病变神经细胞嗜酸性变性明显少于对照组，尤其小脑皮层组织差异更具显著性(表2)。
表2 大脑、小脑皮层组织病变神经细胞定量分析值(%，±s)
空泡变性
轻度嗜酸性变性
中度嗜酸性变性
, 百拇医药
重度嗜酸性变性
大脑
实验组
0±0*
9.37±13.84*
15.57±18.04
23.86±18.06
对照组
0.83±3.57
14.06±10.95
18.23±13.59
, http://www.100md.com 26.98±16.98
小脑
实验组
3.54±14.05
9.75±24.47**
19.78±21.08**
10.69±23.64**
对照组
2.42±7.57
20.60±25.08
30.63±26.05
, 百拇医药
31.82±18.35
注：与对照组相比*P<0.05 **P<0.01
2.3 电子显微镜检查大脑、小脑皮层组织及小脑超微结构实验组末梢网基本正常，粗面内质网及线粒体轻度肿胀；对照组粗面内质网明显肿胀，广泛脱颗粒，线粒体明显肿胀，中间变空，线粒体嵴变短或减少、消失。
3 讨论
近几年的研究发现一氧化氮参与了DHCA后脑再灌注损伤。Brock等[1]证实DHCA后一氧化氮合酶活性增加。Anderson等[2]应用小剂量的L-NAME可以明显减轻反复局部脑组织缺血造成的酸中毒。Kenneth等[3]认为Ca2+是脑组织缺血损伤的起始信使，最终是一氧化氮导致神经元的坏死，介导了谷氨酸的兴奋性毒性过程。Segawa等[4]证实1.5 mg/kg的L-NAME可以明显抑制DHCA后120分脑内一氧化氮的产生，促进体感诱发电位的恢复。实验组给予L-NAME后，保持了脑组织内较高的Na+-K+三磷酸腺苷酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力，减少了丙二醛的产生，同时病理显示实验组嗜酸性变性明显少于对照组，细胞结构基本正常，证实DHCA后一氧化氮使超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力下降，丙二醛产生增加，并通过多种机制使三磷酸腺苷的产生减少，Na+-K+三磷酸腺苷酶活力下降，而小剂量(1.5 mg/kg)的L-NAME则通过抑制一氧化氮的产生，对DHCA后脑组织具有保护作用。本实验在DHCA后使用L-NAME，剂量仅为1.5 mg/kg，这样既抑制了一氧化氮的毒性作用，又不明显影响血压及血管阻力，而且对肺血管阻力不会产生大的影响。
, 百拇医药
本实验通过酶学及组织细胞学的检测，阐明了L-NAME的脑保护机制。研究证明小剂量的L-NAME对DHCA后的脑组织具有明显的保护作用。
作者简介：管玉龙(1972—) 男 住院医师 硕士研究生 主要从事体外循环脑保护 的研究
参考文献
1，Brock MV,Blue ME,Lowenstein CJ,et al.Induction of neuronal nitric oxide after hypothermic circulatory arrest.Ann Thorac Surg,1996,62:1313—1320.
2，Anderson RE,Meyer FB,Saudt Jr TM，et al.Nitric oxide synthase inhibition by L-NAME during repetitive focal cerebral ischemia in rabbits.Am J Physiol,1996,271:H588—H594.
, 百拇医药
3，Kenneth M,John W,Lauraine B.Nitric oxide:a downstream mediator of calcium toxicity in the ischemic cascade.Neurosci Lett,1994,166:43—47.
4，Segawa D,Hatori N,Yoshizu H,et al.The effect of Nitric Oxide Synthase inhibitor on reperfusion injury of the bbrainn under hypothermic circulatory arrest.J Thorac Cardiovasc Surg,1998,115:925—930.
收稿：1999-11-10
修稿：2000-05-17, http://www.100md.com
单位：管玉龙 何美玲 杨璟 董培青(100029 北京市，首都医科大学附属北京安贞医院 体外循环科)；杜月河 杜顺平(100029 北京市，首都医科大学附属北京安贞医院 实验外科)；万彩红(太原市山西省人 民医院 病理科)
关键词：一氧化氮；体外循环；再灌注损伤
中国循环杂志000428 摘要 目的：研究一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)对深低温停循环(DHCA)后脑再灌注损伤的保护作用。
方法：8只幼猪随机分为实验组(n＝4)和对照组(n＝4)，建立体外循环(CPB)，行DHCA 90分后恢复灌流120分，实验组动物静脉注射L-NAME 1.5 mg/kg，随后在60分内再给予相同的剂量。
, http://www.100md.com 结果：实验组Na+-K+三磷酸腺苷酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力明显高于对照组，丙二醛含量低于对照组。病理检查及电子显微镜超微结构显示实验组与对照组细胞损伤存在显著性差异(P<0.05)。
结论：L-NAME对DHCA后脑再灌注损伤有保护作用。
中图分类号：R654.1 文献标识码：A
文章编号：1000—3614(2000)04—0244—02
The Effect of Nitric Oxide Synthase Inhibitor on Reperfusion Injury of the Brain under Deep Hypothermic Circulatory Arrest
Guan Yulong Du Yuehe He Meiling et al.
, 百拇医药
(Department of Extracorporeal Circulation,Beijing Anzhen Hospital,Capital Medical University,Beijing 100029)
Abstract Objective:To investigate the protective effects of nitric oxide synthase inhibitor (NG-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride L-NAME) on reperfusion injury of the brain under deep hypothermic circulatory arrest(DHCA).
Methods:After cardiopulmonary bypass was established in 8 piglets,circulatory arrest was performed for 90 minutes followed by reperfusion 120 minutes.In the treatment group,L-NAME was administered with an intravenous injection of 1.5 mg/kg at the onset of the reperfusion followed by a 60-minute continuous venous infusion of 1.5 mg/kg.
, 百拇医药
Results:A significant difference was observed between the groups regarding the concentrations of ATPase,superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-PX)，malondialdehyde (MDA).The morphological change and ultrastructure of neuron all showed milder injury in treatment group than that in control group.
Conclusion:The results suggest that L-NAME protects the brain against reperfusion injury under deep hypothermic circulatory arrest.
, 百拇医药
Key words Nitric oxide;Cardiopulmonary bypass;Reperfusion injury
深低温停循环(DHCA)超过安全时限时，脑组织将发生缺血缺氧损伤。其损伤机制主要与氧债及谷氨酸的兴奋性毒性有关。文献报道一氧化氮参与并介导了谷氨酸的兴奋性毒性。本实验通过对比DHCA后脑组织的各种酶学及组织细胞结构的改变，研究一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)对脑组织损伤的保护作用，为进一步研究DHCA脑组织损伤机制及寻找更好的脑组织保护方法提供依据。
1 材料与方法
研究对象 1998年10月～12月选取8只健康小型幼猪(北京农业大学培育)，体重16～20 kg，随机分为两组：实验组(n＝4)在DHCA 90分恢复体外循环(CPB)后给予L-NAME 1.5 mg/kg，并在60分内再重复相同的剂量1次；对照组(n＝4)在相同时间点给予等量的生理盐水。
, http://www.100md.com
研究方法 对幼猪采取硫喷妥钠30～50 mg/kg腹腔注射，气管切开插管，呼吸机辅助呼吸。正中劈开胸骨建立CPB，转流降温至鼻、咽温达18℃，肛温达20℃，停CPB。90分后恢复CPB并复温，实验组给予L-NAME。120分后鼻、咽温达37℃，肛温达35℃，停CPB。取大脑、小脑皮层组织，采用化学比色法测定Na+-K+三磷酸腺苷酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力及丙二醛含量，并行组织病理和电子显微镜检查。
统计学处理 数据用
±s表示，用SPSS 7.0软件处理，采用t检验进行组间对照分析。2 结果
2.1 酶活力检测
实验组大脑、小脑皮层组织Na+-K+三磷酸腺苷酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力明显高于对照组，丙二醛含量低于对照组(表1)。
, http://www.100md.com
表1 大脑、小脑皮层组织在实验组与对照组中各项酶学活力及丙二醛含量的测定(
±s)Na+-K+三磷酸腺苷酶活力
(μmol/mgprot)
超氧化物歧化酶活力
(NU/mgprot)
谷胱甘肽过氧化物酶活力
(NU/mgprot)
丙二醛含量
(nmol/mgprot)
, 百拇医药
大脑
实验组
2.42±0.11*
318.37±4.99**
20.17±3.42**
5.94±0.36*
对照组
2.12±0.15
259.85±1.86
5.97±1.65
6.53±0.22
, 百拇医药
小脑
实验组
1.12±0.05**
277.79±9.91**
33.94±4.10**
0.72±0.02
对照组
0.50±0.04
223.70±13.81
7.23±1.43
0.75±0.02
, 百拇医药
注：与对照组相比*P<0.05 **P<0.01
2.2 组织病理检查
DHCA后脑组织病理改变程度不等，部分细胞可见缺血性改变。对光学显微镜下视野的病变神经细胞进行定量分析(病变细胞占细胞总数的百分比)，发现实验组大脑及小脑皮层组织病变神经细胞嗜酸性变性明显少于对照组，尤其小脑皮层组织差异更具显著性(表2)。
表2 大脑、小脑皮层组织病变神经细胞定量分析值(%，
±s)空泡变性
轻度嗜酸性变性
中度嗜酸性变性
, 百拇医药
重度嗜酸性变性
大脑
实验组
0±0*
9.37±13.84*
15.57±18.04
23.86±18.06
对照组
0.83±3.57
14.06±10.95
18.23±13.59
, http://www.100md.com 26.98±16.98
小脑
实验组
3.54±14.05
9.75±24.47**
19.78±21.08**
10.69±23.64**
对照组
2.42±7.57
20.60±25.08
30.63±26.05
, 百拇医药
31.82±18.35
注：与对照组相比*P<0.05 **P<0.01
2.3 电子显微镜检查大脑、小脑皮层组织及小脑超微结构实验组末梢网基本正常，粗面内质网及线粒体轻度肿胀；对照组粗面内质网明显肿胀，广泛脱颗粒，线粒体明显肿胀，中间变空，线粒体嵴变短或减少、消失。
3 讨论
近几年的研究发现一氧化氮参与了DHCA后脑再灌注损伤。Brock等[1]证实DHCA后一氧化氮合酶活性增加。Anderson等[2]应用小剂量的L-NAME可以明显减轻反复局部脑组织缺血造成的酸中毒。Kenneth等[3]认为Ca2+是脑组织缺血损伤的起始信使，最终是一氧化氮导致神经元的坏死，介导了谷氨酸的兴奋性毒性过程。Segawa等[4]证实1.5 mg/kg的L-NAME可以明显抑制DHCA后120分脑内一氧化氮的产生，促进体感诱发电位的恢复。实验组给予L-NAME后，保持了脑组织内较高的Na+-K+三磷酸腺苷酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力，减少了丙二醛的产生，同时病理显示实验组嗜酸性变性明显少于对照组，细胞结构基本正常，证实DHCA后一氧化氮使超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力下降，丙二醛产生增加，并通过多种机制使三磷酸腺苷的产生减少，Na+-K+三磷酸腺苷酶活力下降，而小剂量(1.5 mg/kg)的L-NAME则通过抑制一氧化氮的产生，对DHCA后脑组织具有保护作用。本实验在DHCA后使用L-NAME，剂量仅为1.5 mg/kg，这样既抑制了一氧化氮的毒性作用，又不明显影响血压及血管阻力，而且对肺血管阻力不会产生大的影响。
, 百拇医药
本实验通过酶学及组织细胞学的检测，阐明了L-NAME的脑保护机制。研究证明小剂量的L-NAME对DHCA后的脑组织具有明显的保护作用。
作者简介：管玉龙(1972—) 男 住院医师 硕士研究生 主要从事体外循环脑保护 的研究
参考文献
1，Brock MV,Blue ME,Lowenstein CJ,et al.Induction of neuronal nitric oxide after hypothermic circulatory arrest.Ann Thorac Surg,1996,62:1313—1320.
2，Anderson RE,Meyer FB,Saudt Jr TM，et al.Nitric oxide synthase inhibition by L-NAME during repetitive focal cerebral ischemia in rabbits.Am J Physiol,1996,271:H588—H594.
, 百拇医药
3，Kenneth M,John W,Lauraine B.Nitric oxide:a downstream mediator of calcium toxicity in the ischemic cascade.Neurosci Lett,1994,166:43—47.
4，Segawa D,Hatori N,Yoshizu H,et al.The effect of Nitric Oxide Synthase inhibitor on reperfusion injury of the bbrainn under hypothermic circulatory arrest.J Thorac Cardiovasc Surg,1998,115:925—930.
收稿：1999-11-10
修稿：2000-05-17, http://www.100md.com