副粘病毒融合蛋白分子上特异性细胞融合作用位点的初步确定
作者：王志玉
单位：250012 济南，山东医科大学病毒学研究室
关键词：副粘病毒；融合蛋白；细胞融合；基因
中华微生物学和免疫学杂志000402 【 摘要 】 目的 找到副粘病毒融合蛋白(F)分子上与血凝素-神经氨酸酶(HN)相互作用的特异性区域，弄清F融合细胞的分子机理。 方法 采用基因定点突变法，创造一个酶切位点，得到突变株，然后用基因重组的方法得到各种重组株，并于真核细胞内进行表达，Gimsa染色和指示基因法检测细胞融合功能，荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况。 结果 在将各有关F基因片段进行交换之前，创造一个酶切位点时所得突变株的细胞融合功能与野毒株相同；将新城疫病毒(NDV) F和副流感病毒(PIV) F在膜穿入部分和躯干部分交接处交换时，不影响细胞融合功能；进一步将F2进行交换时，也不影响细胞融合功能；而将F的头部进行交换时，则检测不到细胞融合作用，FACS分析表明，F没有达到细胞表面。 结论 F分子上与HN相互作用的特异性区域位于膜穿入部分和躯干部分交接处与F1和F2交接处之间，即F1除去膜穿入部分和尾部的剩余部分。
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Preliminary identification of an active domain on fusion protein of paramyxoviruses
WANG Zhiyu
(Department of Virology, Shandong Medical University, Ji′nan 250012, P.R.China)
【 Abstract 】 Objective To identify an active domain that interacts with homologous hemagglutinin-neuraminidase(HN) on fusion protein (F) of paramyxoviruses and to find the molecular mechanism of cell fusion. Methods Site-directed mutagenesis was used to get mutants by creating a new enzyme site and gene recombination was used to get chimeric F proteins. All the wild type, mutant and chimeric F proteins were expressed in eukaryocytes and their fusion functions were assayed by Gimsa staining and fluorescence-activated cell sorter (FACS) analysis. Results All the mutants with a new enzyme site have the same functions as wild type. When the two F genes were recombined at the site between transmembrane and stalk parts, the fusion functions of the chimeric proteins were not affected. Also, this function was not affected when the F′s were exchanged with F2. But fusion activity disappeared when the F′s were exchanged with head parts and F molecules did not reach cell surface as shown by FACS analysis. Conclusion The specific interaction domain with HN on F protein is in the whole stalk and part of head, i. e. in F1 except transmembrane and tail parts.
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【 Subject words 】 Paramyxovirus; Fusion protein; Cell fusion; Gene
副粘病毒感染细胞的一个重要步骤是病毒包膜与靶细胞膜发生融合〔1〕。细胞融合同时也是副粘病毒感染细胞后产生的典型病理特征〔2〕。这一过程由病毒包膜中的两种糖蛋白共同来完成，即血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase, HN)和融合蛋白(Fusion, F)来完成的〔3,4〕。HN能吸附于靶细胞，具有血吸附、神经氨酸酶(NA)活性和促进细胞融合作用；而F能破坏靶细胞膜，并引起融合。但F单独表达并不能完成这一过程，需要和同源性HN共同表达才能显示出融合细胞的活性，而和异源性HN共同表达时也不能引起细胞融合，说明F和HN的相互作用具有极强的特异性，它们之间存在着一种相互联系的区域，以产生信息的传递〔5，6〕。
, http://www.100md.com 本工作以新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和副流感病毒(Parainfluenza virus, PIV) 为模型来研究F分子上与HN相互作用的活性位点，因NDV F 和PIV F的同源性高达39%，采用基因定点突变和基因重组的方法，寻找F分子上与HN相互作用的位点，既科学又快速。
材料与方法
材料
(1)病毒：痘苗病毒野毒株和重组株vTF7-3由Moss教授提供，滴度分别为107 PFU/ml和109 PFU/ml，在BHK21细胞上培养传代。
(2)细胞：BHK21细胞由美国AFCC公司提供，用Dubecco Eagle培养液培养传代。实验时每孔接种4×105，16h后使用。
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(3)工具酶：各种内切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等均由美国New England生物合成公司提供。
(4)质粒DNA及基因克隆：pBSK+质粒DNA和NDV、PIV基因克隆由Iorio博士惠赠。
方法
(1)质粒DNA转染：感染病毒：选生长良好的细胞孔，每孔接种痘苗病毒野毒株25μl，用DMEM培养液稀释，每孔接种0.3ml；另一系列感染痘苗病毒重组株，每6孔板接种量为25μl，即取原液25μl，用DMEM稀释成1.8ml，每孔接种0.3ml。37℃吸附1h后，用DMEM培养液洗涤1次。转染：取待转染的质粒DNA 1μg，与12μl Dope混合，再加入88μl OptiMEM，混匀后加入100μl OptiMEM,室温反应10min。置入相应已感染病毒的细胞孔内，37℃ 5h后，加入BHK21细胞培养液1ml。16h后检测细胞融合情况。
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(2)基因定点突变：引物设计：实验用引物由美国Biosynthesis公司合成。引物 1: 5′AATGTCAAACTGGCTAGCACATCTGC 3′; 引物 2: 5′ATTGGCATCAAGCTAGCACCACA 3′; 引物 3: 5′
AAGGAGACAGAAGCGCTTTATAGGTGC 3′; 引物 4: 5′CCCCAGAACAAAGCGCTTCTTTGGAGG 3′; 引物 5: 5′CAGACCCCCATGGTATCATAT 3′; 引物 6: 5′ATGTACATGCAACGGTATCCATGGTAGAATCAATCAACCACCT 3′。各引物中新增加一个酶切位点，用于酶切反应挑选突变株和基因重组。突变反应：以单链含有F基因的质粒DNA为模板，加入上述已磷酸化的引物，加入T4 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶，37℃反应2h后终止反应。
(3)细胞转化：用CaCl2法将反应物转化大肠杆菌MV1190。
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(4)挑选突变株：从转化的细菌菌落中随机挑选若干进一步扩增，提取质粒DNA，酶切反应初步鉴别突变株，然后进行DNA序列分析，进一步确定突变株。
(5)DNA序列分析：采用双脱氧末端法，按照BioRAD公司手册提供的方法进行。
(6)基因重组：NDV F和PIV F由4个部分组成，即头部、躯干部、膜穿入部分和尾部(图1)。按从两端开始交换重组，逐步向内深入的思路，将NDV F 和PIV F需要交换的部分，用双酶切反应法切下，然后进行相互交换(图1)，用连接酶连接，转化细胞后，挑选重组株。
图1 F蛋白嵌合体构建策略
Fig 1. Strategy for the construction of F chimeras
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The division of the F proteins of NDV and hPIV3 into cytoplasmic tail, transmembrane anchor, and putative stalk and globular domains is shown with the amino acid residues that constitute each domain listed. Unique, homologous restriction sites were introduced into the NDV and hPIV3 F genes to make possible the construction of chimeras in which the cytoplasmic tails and transmembrane anchors(NheⅠ), F2(Eco47Ⅲ)or globular domains(NcoⅠ) were exchanged between the two proteins.
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(7)DNA表达效率分析：转染后的细胞用间接免疫荧光法检测细胞表面F分子的表达量。第一抗体为F McAb 1a、2b、3c的混合物；第二抗体为羊抗鼠荧光标IgG，用Becton Dickinson流式细胞仪分析细胞表面荧光强度(FACS)。
(8)Gimsa染色：将待测细胞孔的液体吸干，每孔加入1ml甲醇，室温固定3～5min。吸干，干燥后加入1∶20的Gimsa染液，染色15～20min。吸去染液，用蒸馏水洗涤后，于镜下观察、拍照记录细胞融合情况。
(9)细胞融合定量分析：采用指示基因法。第一系列：感染vTF7-3重组痘苗病毒株于BHK21细胞，然后共转染HN和F基因；第二系列：感染痘苗病毒野毒株于BHK21细胞，转染pG1NT7-gal质粒DNA。16h后，用胰酶消化各孔细胞，离心洗涤后，悬浮于0.8ml BHK21细胞培养液。将两系列细胞各0.1ml(105)，混匀后加入96孔平底培养板。37℃培养5h后，每孔加入10μl 10% NP-40，室温摇摆震荡30min。取50μl上清与等量的浓度为16mmol/L的氯酚红-D-半乳糖吡喃糖苷(CPRG)混合，室温反应20min后用Softmax软件支持下的ELISA检测仪，于570nm波长下自动读数。以载体质粒DNA为背景作为阴性对照。
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结果
1.NDV F T496A和PIV F S490A突变株的建立及其功能：以引物1和引物2进行定点突变反应，转化MV1190后得到NDV F T496A和PIV F S490A两种突变株，经细胞融合功能观察，与野毒株无差别(图2)。可用于酶切反应，进行基因重组。
图2 各种突变株的建立和功能测定
Fig 2. Construction and functional assay of F mutants
The mutants have the same functions as wild type, so they can be used for gene recombination
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wt: wild type; mt: mutant type
2.将NDV F和PIV F在膜穿入部分和躯干部分交接处交换后对F功能的影响：将上述两种突变株用NheⅠ和NotⅠ进行双酶切反应，将膜穿入部分和尾部切下，然后进行基因重组，得两种嵌合蛋白(chimeric protein)(图3)。表达后检测各自功能表明，交换后并不影响各自的细胞融合功能(图3、4)。
图3 F蛋白分子上与HN相互作用位点的定位
Fig 3. Mapping the specific domains interacted with HN on F proteins
CH1 carries cytoplasmic tail and transmembrane anchor of hPIV3 and putative stalk and head of NDV; CH2 carries cytoplasmic tail and transmembrane anchor of NDV and putative stalk and head of hPIV3; CH3 carries cytoplasmic tail, transmembrane anchor and F2 of hPIV3 and the rest from NDV; CH4 carries cytoplasmic tail, transmembrane anchor and F2 of NDV and the rest from hPIV3; CH5 carries cytoplasmic tail, transmembrane anchor and globular head of hPIV3 and NDV putative stalk; CH6 carries cytoplasmic tail, transmembrane anchor and globular head of NDV and hPIV3 putative stalk.
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3.NDV F K115K(AAA-AAG)和PIV F K118K(AAA-AAG)、R119R(CGA-CGC)突变株的建立及其功能：引物3和引物4中虽有一个或二个核苷酸发生变化，但三联密码产物没有改变，属于静默突变，经检测突变株功能，未见发生变化(图2)，可供基因重组之用。
图4 NDV F和hPIV3 F嵌合蛋白CH1和CH2引起细胞融合的能力(箭头指示合胞体)
Fig 4. The ability of chimeric F proteins of NDV and hPIV3, CH1 and CH2, to induce cell fusion (Arrows indicate syncytia)(×40)
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4.将NDV F和PIV F的F1和F2进行交换后对F功能的影响：经Eco47Ⅲ和NotⅠ双酶切反应，并进行片段交换后，产生2种嵌合蛋白(NDV F1+PIV F2和NDV F2+PIV F1)，经细胞融合功能检测，其功能未发生变化(图3、5)。
5.NDV F P405H和PIV F G398H、 N399G突变株的建立及其功能：以引物5和引物6进行突变反应后得到NDV F P405H和PIV F G398H、N399G两种突变株，突变后对F的功能没有影响(图2)。因此，可以用于基因重组。
图5 NDV F和hPIV F嵌合蛋白CH3和CH4引起细胞融合的能力(箭头指示合胞体)
Fig 5. The ability of chimeric F proteins of NDV and hPIV3, CH3 and CH4, to induce cell fusion (Arrows indicate syncytia)(×40)
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6.将NDV F 和PIV F于头部进行交换对F功能的影响：将NDV F P405H和PIV F G398H、N399G两种突变株经NcoⅠ和KPNⅠ双酶切反应，并进行基因重组后，F融合细胞的功能消失(图3)。
7.各突变株及重组株表达效率分析：各突变株及重组株表达效率经FACS分析，表明将NDV F和PIV F的头部进行交换后，转染的细胞表面并无蛋白表达。说明重组蛋白没有到达细胞表面。因此，也就无细胞融合的功能。其它突变株及重组株表达效率正常(图2、3)。
讨论
副粘病毒属于有膜病毒。其所致细胞病变的重要特征之一是细胞融合，而细胞融合又是病毒致病力或毒力的象征〔7，8〕。因此，对细胞融合发生机理的研究具有极其重要的理论意义和实际意义。
笔者曾对多种副粘病毒F和HN相互作用的特异性进行过研究，证明NDV F 或PIV F 的细胞融合时需要同源性 HN即NDV HN 或PIV HN的辅助才能完成；而异源性的HN无此作用〔6〕。本文结果图4、5中亦可见此现象。说明F和HN在完成细胞融合这一过程时，具有极强的特异性。这种特异性反应在F分子上存在一个与HN分子相互作用的位点。因为HN有受体识别活性，HN与受体结合启动了细胞融合过程，提示F在接受到来自HN的某种信息后发生了某种构型上的改变，活化位点暴露，发生细胞融合。因此，要阐明细胞融合的发生机理，必须确定F分子上与HN相互作用的特异性位点。
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研究表明，当将NDV F 和PIV F在膜穿入部分与躯干部分交接处进行交换时，不影响F的细胞融合功能。说明膜穿入部分和尾部不涉及这一特异性位点。而后将两种F的F2进行交换，也不影响细胞融合的发生，说明特异性位点不在F2上。但将两种F的头部进行交换，则未见细胞融合现象。FACS分析表明，这种重组后的F未达到细胞表面，其原因尚需要进一步研究。虽然如此，F分子上与HN特异性作用的位点大体位置位于躯干的全部和头部的一部分，即F1除去膜穿入部分和尾部的剩余部分。
该研究为继续对F的研究，奠定了坚实的基础。
志谢：对Moss教授和Iorio博士的支持表示感谢。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570032)
参考文献
1，Wild TF, Malvoisin E, Buckland R. Measles virus: Both the haemagglutinin and fusion glycoproteins are required for fusion. J Gen Virol, 1991, 72:439-442.
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2，Horvath CM, Paterson RG, Shaughnessy MA, et al. Biological activity of paramyxovirus fusion proteins: Factors influencing formation of syncytia. J Virol, 1992, 66:4564-4569.
3，Lamb RA. Paramyxovirus fusion: A hypothesis for changes. Virology, 1993, 197:1-11.
4，Stone-hulslander J, Morrison TG. Detection of an interaction HN and F proteins in Newcastle disease virus-infected cells. J Virol, 1997, 71:6287-6295.
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5，Hu X, Ray R, Compans RW. Functional interactions between the fusion protein and hemagglutinin-neuraminidase of human parainfluenza viruses. J Virol, 1992, 66:1528-1534.
6，王志玉. 副粘病毒膜糖蛋白的基因表达及其相互作用的研究. 山东医科大学学报, 1999, 37(2):28-30.
7，Choppin PV, Scheid A. The role of viral glycoproteins in adsorption, penetration and pathogenicity of viruses. Rev Infect Dis, 1980, 2:40-61.
8，Heckstra D, Lima MCP. Molecular mechanisms of enveloped viruses entry into host cells: Protein dynamics and membrane fusion. Adv Membr Fluid, 1992, 6:71-97.
(收稿日期：1999-02-10), 百拇医药
单位：250012 济南，山东医科大学病毒学研究室
关键词：副粘病毒；融合蛋白；细胞融合；基因
中华微生物学和免疫学杂志000402 【 摘要 】 目的 找到副粘病毒融合蛋白(F)分子上与血凝素-神经氨酸酶(HN)相互作用的特异性区域，弄清F融合细胞的分子机理。 方法 采用基因定点突变法，创造一个酶切位点，得到突变株，然后用基因重组的方法得到各种重组株，并于真核细胞内进行表达，Gimsa染色和指示基因法检测细胞融合功能，荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况。 结果 在将各有关F基因片段进行交换之前，创造一个酶切位点时所得突变株的细胞融合功能与野毒株相同；将新城疫病毒(NDV) F和副流感病毒(PIV) F在膜穿入部分和躯干部分交接处交换时，不影响细胞融合功能；进一步将F2进行交换时，也不影响细胞融合功能；而将F的头部进行交换时，则检测不到细胞融合作用，FACS分析表明，F没有达到细胞表面。 结论 F分子上与HN相互作用的特异性区域位于膜穿入部分和躯干部分交接处与F1和F2交接处之间，即F1除去膜穿入部分和尾部的剩余部分。
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Preliminary identification of an active domain on fusion protein of paramyxoviruses
WANG Zhiyu
(Department of Virology, Shandong Medical University, Ji′nan 250012, P.R.China)
【 Abstract 】 Objective To identify an active domain that interacts with homologous hemagglutinin-neuraminidase(HN) on fusion protein (F) of paramyxoviruses and to find the molecular mechanism of cell fusion. Methods Site-directed mutagenesis was used to get mutants by creating a new enzyme site and gene recombination was used to get chimeric F proteins. All the wild type, mutant and chimeric F proteins were expressed in eukaryocytes and their fusion functions were assayed by Gimsa staining and fluorescence-activated cell sorter (FACS) analysis. Results All the mutants with a new enzyme site have the same functions as wild type. When the two F genes were recombined at the site between transmembrane and stalk parts, the fusion functions of the chimeric proteins were not affected. Also, this function was not affected when the F′s were exchanged with F2. But fusion activity disappeared when the F′s were exchanged with head parts and F molecules did not reach cell surface as shown by FACS analysis. Conclusion The specific interaction domain with HN on F protein is in the whole stalk and part of head, i. e. in F1 except transmembrane and tail parts.
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【 Subject words 】 Paramyxovirus; Fusion protein; Cell fusion; Gene
副粘病毒感染细胞的一个重要步骤是病毒包膜与靶细胞膜发生融合〔1〕。细胞融合同时也是副粘病毒感染细胞后产生的典型病理特征〔2〕。这一过程由病毒包膜中的两种糖蛋白共同来完成，即血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase, HN)和融合蛋白(Fusion, F)来完成的〔3,4〕。HN能吸附于靶细胞，具有血吸附、神经氨酸酶(NA)活性和促进细胞融合作用；而F能破坏靶细胞膜，并引起融合。但F单独表达并不能完成这一过程，需要和同源性HN共同表达才能显示出融合细胞的活性，而和异源性HN共同表达时也不能引起细胞融合，说明F和HN的相互作用具有极强的特异性，它们之间存在着一种相互联系的区域，以产生信息的传递〔5，6〕。
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材料与方法
材料
(1)病毒：痘苗病毒野毒株和重组株vTF7-3由Moss教授提供，滴度分别为107 PFU/ml和109 PFU/ml，在BHK21细胞上培养传代。
(2)细胞：BHK21细胞由美国AFCC公司提供，用Dubecco Eagle培养液培养传代。实验时每孔接种4×105，16h后使用。
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(3)工具酶：各种内切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等均由美国New England生物合成公司提供。
(4)质粒DNA及基因克隆：pBSK+质粒DNA和NDV、PIV基因克隆由Iorio博士惠赠。
方法
(1)质粒DNA转染：感染病毒：选生长良好的细胞孔，每孔接种痘苗病毒野毒株25μl，用DMEM培养液稀释，每孔接种0.3ml；另一系列感染痘苗病毒重组株，每6孔板接种量为25μl，即取原液25μl，用DMEM稀释成1.8ml，每孔接种0.3ml。37℃吸附1h后，用DMEM培养液洗涤1次。转染：取待转染的质粒DNA 1μg，与12μl Dope混合，再加入88μl OptiMEM，混匀后加入100μl OptiMEM,室温反应10min。置入相应已感染病毒的细胞孔内，37℃ 5h后，加入BHK21细胞培养液1ml。16h后检测细胞融合情况。
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(2)基因定点突变：引物设计：实验用引物由美国Biosynthesis公司合成。引物 1: 5′AATGTCAAACTGGCTAGCACATCTGC 3′; 引物 2: 5′ATTGGCATCAAGCTAGCACCACA 3′; 引物 3: 5′
AAGGAGACAGAAGCGCTTTATAGGTGC 3′; 引物 4: 5′CCCCAGAACAAAGCGCTTCTTTGGAGG 3′; 引物 5: 5′CAGACCCCCATGGTATCATAT 3′; 引物 6: 5′ATGTACATGCAACGGTATCCATGGTAGAATCAATCAACCACCT 3′。各引物中新增加一个酶切位点，用于酶切反应挑选突变株和基因重组。突变反应：以单链含有F基因的质粒DNA为模板，加入上述已磷酸化的引物，加入T4 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶，37℃反应2h后终止反应。
(3)细胞转化：用CaCl2法将反应物转化大肠杆菌MV1190。
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(4)挑选突变株：从转化的细菌菌落中随机挑选若干进一步扩增，提取质粒DNA，酶切反应初步鉴别突变株，然后进行DNA序列分析，进一步确定突变株。
(5)DNA序列分析：采用双脱氧末端法，按照BioRAD公司手册提供的方法进行。
(6)基因重组：NDV F和PIV F由4个部分组成，即头部、躯干部、膜穿入部分和尾部(图1)。按从两端开始交换重组，逐步向内深入的思路，将NDV F 和PIV F需要交换的部分，用双酶切反应法切下，然后进行相互交换(图1)，用连接酶连接，转化细胞后，挑选重组株。
图1 F蛋白嵌合体构建策略
Fig 1. Strategy for the construction of F chimeras
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The division of the F proteins of NDV and hPIV3 into cytoplasmic tail, transmembrane anchor, and putative stalk and globular domains is shown with the amino acid residues that constitute each domain listed. Unique, homologous restriction sites were introduced into the NDV and hPIV3 F genes to make possible the construction of chimeras in which the cytoplasmic tails and transmembrane anchors(NheⅠ), F2(Eco47Ⅲ)or globular domains(NcoⅠ) were exchanged between the two proteins.
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(7)DNA表达效率分析：转染后的细胞用间接免疫荧光法检测细胞表面F分子的表达量。第一抗体为F McAb 1a、2b、3c的混合物；第二抗体为羊抗鼠荧光标IgG，用Becton Dickinson流式细胞仪分析细胞表面荧光强度(FACS)。
(8)Gimsa染色：将待测细胞孔的液体吸干，每孔加入1ml甲醇，室温固定3～5min。吸干，干燥后加入1∶20的Gimsa染液，染色15～20min。吸去染液，用蒸馏水洗涤后，于镜下观察、拍照记录细胞融合情况。
(9)细胞融合定量分析：采用指示基因法。第一系列：感染vTF7-3重组痘苗病毒株于BHK21细胞，然后共转染HN和F基因；第二系列：感染痘苗病毒野毒株于BHK21细胞，转染pG1NT7-gal质粒DNA。16h后，用胰酶消化各孔细胞，离心洗涤后，悬浮于0.8ml BHK21细胞培养液。将两系列细胞各0.1ml(105)，混匀后加入96孔平底培养板。37℃培养5h后，每孔加入10μl 10% NP-40，室温摇摆震荡30min。取50μl上清与等量的浓度为16mmol/L的氯酚红-D-半乳糖吡喃糖苷(CPRG)混合，室温反应20min后用Softmax软件支持下的ELISA检测仪，于570nm波长下自动读数。以载体质粒DNA为背景作为阴性对照。
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结果
1.NDV F T496A和PIV F S490A突变株的建立及其功能：以引物1和引物2进行定点突变反应，转化MV1190后得到NDV F T496A和PIV F S490A两种突变株，经细胞融合功能观察，与野毒株无差别(图2)。可用于酶切反应，进行基因重组。
图2 各种突变株的建立和功能测定
Fig 2. Construction and functional assay of F mutants
The mutants have the same functions as wild type, so they can be used for gene recombination
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wt: wild type; mt: mutant type
2.将NDV F和PIV F在膜穿入部分和躯干部分交接处交换后对F功能的影响：将上述两种突变株用NheⅠ和NotⅠ进行双酶切反应，将膜穿入部分和尾部切下，然后进行基因重组，得两种嵌合蛋白(chimeric protein)(图3)。表达后检测各自功能表明，交换后并不影响各自的细胞融合功能(图3、4)。
图3 F蛋白分子上与HN相互作用位点的定位
Fig 3. Mapping the specific domains interacted with HN on F proteins
CH1 carries cytoplasmic tail and transmembrane anchor of hPIV3 and putative stalk and head of NDV; CH2 carries cytoplasmic tail and transmembrane anchor of NDV and putative stalk and head of hPIV3; CH3 carries cytoplasmic tail, transmembrane anchor and F2 of hPIV3 and the rest from NDV; CH4 carries cytoplasmic tail, transmembrane anchor and F2 of NDV and the rest from hPIV3; CH5 carries cytoplasmic tail, transmembrane anchor and globular head of hPIV3 and NDV putative stalk; CH6 carries cytoplasmic tail, transmembrane anchor and globular head of NDV and hPIV3 putative stalk.
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3.NDV F K115K(AAA-AAG)和PIV F K118K(AAA-AAG)、R119R(CGA-CGC)突变株的建立及其功能：引物3和引物4中虽有一个或二个核苷酸发生变化，但三联密码产物没有改变，属于静默突变，经检测突变株功能，未见发生变化(图2)，可供基因重组之用。
图4 NDV F和hPIV3 F嵌合蛋白CH1和CH2引起细胞融合的能力(箭头指示合胞体)
Fig 4. The ability of chimeric F proteins of NDV and hPIV3, CH1 and CH2, to induce cell fusion (Arrows indicate syncytia)(×40)
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4.将NDV F和PIV F的F1和F2进行交换后对F功能的影响：经Eco47Ⅲ和NotⅠ双酶切反应，并进行片段交换后，产生2种嵌合蛋白(NDV F1+PIV F2和NDV F2+PIV F1)，经细胞融合功能检测，其功能未发生变化(图3、5)。
5.NDV F P405H和PIV F G398H、 N399G突变株的建立及其功能：以引物5和引物6进行突变反应后得到NDV F P405H和PIV F G398H、N399G两种突变株，突变后对F的功能没有影响(图2)。因此，可以用于基因重组。
图5 NDV F和hPIV F嵌合蛋白CH3和CH4引起细胞融合的能力(箭头指示合胞体)
Fig 5. The ability of chimeric F proteins of NDV and hPIV3, CH3 and CH4, to induce cell fusion (Arrows indicate syncytia)(×40)
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6.将NDV F 和PIV F于头部进行交换对F功能的影响：将NDV F P405H和PIV F G398H、N399G两种突变株经NcoⅠ和KPNⅠ双酶切反应，并进行基因重组后，F融合细胞的功能消失(图3)。
7.各突变株及重组株表达效率分析：各突变株及重组株表达效率经FACS分析，表明将NDV F和PIV F的头部进行交换后，转染的细胞表面并无蛋白表达。说明重组蛋白没有到达细胞表面。因此，也就无细胞融合的功能。其它突变株及重组株表达效率正常(图2、3)。
讨论
副粘病毒属于有膜病毒。其所致细胞病变的重要特征之一是细胞融合，而细胞融合又是病毒致病力或毒力的象征〔7，8〕。因此，对细胞融合发生机理的研究具有极其重要的理论意义和实际意义。
笔者曾对多种副粘病毒F和HN相互作用的特异性进行过研究，证明NDV F 或PIV F 的细胞融合时需要同源性 HN即NDV HN 或PIV HN的辅助才能完成；而异源性的HN无此作用〔6〕。本文结果图4、5中亦可见此现象。说明F和HN在完成细胞融合这一过程时，具有极强的特异性。这种特异性反应在F分子上存在一个与HN分子相互作用的位点。因为HN有受体识别活性，HN与受体结合启动了细胞融合过程，提示F在接受到来自HN的某种信息后发生了某种构型上的改变，活化位点暴露，发生细胞融合。因此，要阐明细胞融合的发生机理，必须确定F分子上与HN相互作用的特异性位点。
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研究表明，当将NDV F 和PIV F在膜穿入部分与躯干部分交接处进行交换时，不影响F的细胞融合功能。说明膜穿入部分和尾部不涉及这一特异性位点。而后将两种F的F2进行交换，也不影响细胞融合的发生，说明特异性位点不在F2上。但将两种F的头部进行交换，则未见细胞融合现象。FACS分析表明，这种重组后的F未达到细胞表面，其原因尚需要进一步研究。虽然如此，F分子上与HN特异性作用的位点大体位置位于躯干的全部和头部的一部分，即F1除去膜穿入部分和尾部的剩余部分。
该研究为继续对F的研究，奠定了坚实的基础。
志谢：对Moss教授和Iorio博士的支持表示感谢。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570032)
参考文献
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2，Horvath CM, Paterson RG, Shaughnessy MA, et al. Biological activity of paramyxovirus fusion proteins: Factors influencing formation of syncytia. J Virol, 1992, 66:4564-4569.
3，Lamb RA. Paramyxovirus fusion: A hypothesis for changes. Virology, 1993, 197:1-11.
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(收稿日期：1999-02-10), 百拇医药