作者：陈光辉 祝善俊 刘莉 刘玲玲 刘鹏
单位：陈光辉 刘莉 刘玲玲 刘鹏(解放军总医院老年心血管病研究所，北京 100853)；祝善俊(解放军第三军医大学新桥医院心内科，重庆 400037)
关键词：血管紧张素Ⅱ；细胞活力；甲基噻唑基四唑
军医进修学院学报000409 [摘要] 目的：旨在观察血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)对心肌细胞活力的影响。方法：本研究利用培养的乳鼠心肌细胞，根据活细胞线粒体在能量代谢过程中可作用于MTT产生蓝紫色结晶产物formazan这一原理，应用MTT法测定ANGⅡ对培养心肌细活力的影响。结果：发现ANGⅡ在 12 h 之内使formazan产物的OD值逐渐上升，12 h达到高峰，此后开始下降，至 24 h已低于正常水平，它们的OD值之间均有显著的统计学差异(P<0.05或0.01)。结论：该结果提示ANGⅡ在早期具有提高心肌细胞活力的效应。这一发现对了解ANGⅡ在心功能不全代偿和心衰发生中的作用地位具有重要意义。
中图号：R329.2 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)04-0267-03
The effects of angiotensin Ⅱ on the viability of cardiac myocyte
CHEN Guang-hui, ZHU Shan-Jun, LIU Li, LIU Ling-ling, LIU Peng
(Institute of Geriatric Cardiology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
[Abstract] Objective:Our study is to investigate the effects of Angiotensin Ⅱ (ANGⅡ) on the myocyte viability and the cellular basis of myocardiocyte dysfunction, in order to provide the evidences for better management of heart failure.Methods:Based on that the mitochondria of viable cells can act on MTT to produce formazan with light purple, we investigate the effect of ANGⅡ on the cultured myocyte viability by means of colorimetric method.Results:Our results showed that ANGⅡ caused the gradual increase of formazan optical density (OD) in 12 hours, and the formazan OD reached the peak at 12 hour, thereafter decreased, even lower than the normal at 24 hour. CV11974 did successfully and significantly antagornized the effect of AngⅡ on the cardiac myocyte viability (P<0.05 or 0.01). Conclusion:Our results indicated that AngⅡ could improve the myocytes viability at the early stage. It has important meanings for the correct use of ANGⅡ and the efficient management of heart failure in the future.
Key words：angiotensin Ⅱ; cell viability; MTT
肾素-血管紧张素系统(RAS)在心衰中的重要作用已在动物实验和临床研究中得到证实
[1，2]。RAS中主要的生物活性物质为血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)。以往在器官与组织水平上的研究表明ANGⅡ通过引起心肌细胞肥大与间质成纤维细胞增生引起心肌重构，并最终引起心脏收缩与舒张功能的异常而导致心力衰竭
[3,4]。本研究利用培养的乳鼠心肌细胞，根据活细胞在能量代谢过程中由MTT[3(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]产生formazan这一原理
[5]，应用MTT法测定ANGⅡ对培养心肌细胞活力的影响，旨在进一步说明ANGⅡ在心功能不全代偿和心衰发生中的地位。
1 材料和方法
1.1 培养液的配制 M19911.67 g(GIBCOBRL, LIFE TECHNOLOGYIES)，含L-谷氨酰胺 0.2292 g，胰岛素 6 U，青霉素 10 万 U，磷酸链酶素 10 万 U，HEPES 3.0 g，用去离子水稀释至 1 000 ml，用NaHCO
3调 pH 在 7.0～7.2。使用时加入灭活的小牛血清(三军医大分子生物学教研室)至浓度为 15%。
1.2 试剂 MTT(FLUKA)，溶于 PBS，浓度为 5 mg/ml，过滤除菌，置于棕色瓶中，4℃避光保存；二甲基亚砜(DMSO)；ANGⅡ(sigma)用无菌双蒸水配制为 10
-4mol/L储存液，-20℃冰箱保存，用前解冻，用无血清培养液稀释为 10
-7mol/L备用。
1.3 心肌细胞的分离、培养与纯化 根据文献
[6]并作改良，即取 3～5 d龄Wistar大鼠(不分雌雄)，心前区碘酒、酒精分别消毒，活取胎心置无菌生理盐水(含肝素 50 U/ml)漂洗，小心剔除心底血管，心房组织，在培养皿上用眼科剪将心肌剪碎，经 0.02% 胰酶室温下分次消化(每次不超过去 10 min)，120 目钢网过滤，1 000 r/min离心 5～10 min。沉淀中如红细胞较多可先用 0.36%的低渗盐水溶破红细胞，再用 3%的盐水平衡渗透压再次离心。最后收集细胞接种于 25 ml塑料培养瓶(CORNING)，用含 15% 小牛血清 M199于 37℃ 5% CO
2预贴壁 90 min，未贴壁细胞分离后收集，同样条件培养 6 d，中途换液一次。
1.4 心肌细胞的鉴定 用免疫细胞化学方法鉴定心肌细胞。一抗为小鼠抗α-肌原节肌动蛋白单克隆抗体(福州迈新，即用型)，DAB显色。本抗体对α-骨骼肌和α-心肌的肌动蛋白具有特异性。
1.5 ANGⅡ对培养心肌细胞活力的影响 培养 6d的心肌细胞弃培养液，用 0.04% 的 EDTA 和 0.5%胰酶各一吸管)消化约 5 min，用含 15 % 小牛血清的 M199 终止胰酶的消化，1 000 r/min离心 15 min，收集细胞，调整细胞数为 2.5×10
5/ml，将细胞接种于 96 孔培养板(CORNING)、每孔 150 μl，37℃ 5% CO
2 培养 12 h，无血清培养 24 h，按 0、1 h、12 h和 24 h四个时相点加入ANGⅡ(10
-7M/L，每个时相点重复做 5 孔。
1.6 MTT法测定 弃培养液，每孔加 MTT(5 mg/ml)20 μl，37℃ 5% CO
2继续培养 6 h，弃MTT液每孔加二甲基亚砜 100 μl，振荡 10 min、混匀，自动酶联仪(Bio-Rad)490 nm测 OD 值。每孔 OD 值减去空白孔 OD 值为测试孔 OD 真值。
1.7 统计学处理 数值以x±s表示，进行单因素方差分析，P<0.05为具有显著意义，P<0.01为具有非常显著意义。
2 结 果
心脏成纤维细胞及内皮细胞在 90 min内已基本贴壁。未贴壁细胞在培养的第 2 天开始伸展，细胞形态不规则，部分细胞聚集成团生长，第 3 天开始出现有节律的收缩运动，收缩形式多种多样，收缩次数差异很大，每分钟 30 余次至 180 次不等。成团细胞收缩略快也较明显。细胞免疫化学证实 99% 以上的细胞为阳性染色细胞，只有极个别细胞不着色。这证实我们进行MTT法测定的原代培养细胞纯度极高，99% 以上为心肌细胞。本方法为国外报道方法的改良，它省时，更经济，而且培养细胞的纯度极高，重复性也好。
结果显示未经ANGⅡ处理的心肌细胞MTT产物的OD值为 0.2785±0.0912，ANGⅡ作用 1 h 和 12 h MTT产物的OD值分别为 0.3570±0.0440和 0.3643±0.0241，与 0 时相点相比P均<0.01，相差非常显著。但ANGⅡ作用 1 h 和 12 h 的MTT产物的OD值相比P>0.05，不具有统计学意义。ANGⅡ作用 24 h的MTT的OD值为 0.2216±0.0139，已低于正常水平，但与 0 时相点比较无统计学意义，而与 12 h时相点相比P<0.05，相差十分显著(附图)。可见ANGⅡ在 12 h内可以使培养心肌细胞的线粒体脱氢酶活性上升，12 h达最高峰，之后线粒体脱氢酶活性开始下降，至 24 h已开始低于正常水平。
附图 ANGⅡ对培养心肌细胞活力的影响
3 讨 论
在细胞水平进行研究经常要了解细胞的存活与增殖情况。心肌细胞活力的下降和能量代谢障碍是心衰发生的重要机制之一。目前主要检测方法为活细胞计数法和同位素掺入法。前者结果易受检测者主观因素影响，后者则要使用放射性同位素，易造成环境污染，因此这两种方法在使用上都存在一定的局限性
[7]。Mosmann
[5]根据活细胞在能量代谢中由MTT产生formazan这一原理首创MTT比色法测定细胞的活力和增殖能力。它简便、迅速、准确、安全、廉价，已有效地应用于生物学和医学的许多研究中，如淋巴细胞转化和补体介导的细胞毒试验，各种因子的生物学测定，抗肿瘤、抗艾滋病病毒的药物筛选等
[7]。
MTT为淡黄色唑氮盐，是线粒体脱氢酶的作用底物。当与活细胞共同孵育时可以被具有活性的线粒体脱氢酶还原为不溶于水的蓝紫色formazan结晶，当将其溶于有机溶剂后可用比色法测定其吸光度(OD)值，OD值越大反应脱氢酶活性越大。有机溶剂常用的有乙醇、酸化异丙醇、10% SDS～0.01 mol/LHCl和DMSO(二甲基亚砜)。本研究选用的是DMSO，其测定波长为 490 nm。Mosmann
[5]对EL
4 3淋巴肉瘤细胞进行MTT法分析证实在培养板上每孔细胞在 50 000～200 之间与MTT产物的OD值呈显著的线性相关性，同时说明该方法可用于检测非常少量的活细胞(如每孔 200 cells)。Mosmann为了证实是否死细胞或静止细胞同样还原MTT，选取了无活性的血红细胞和脾细胞，结果证实二者都不能还原MTT而Con A活化的淋巴细胞则可明显地增加formazan的生成量。国内朱文菁等人用 MTT 法分析成骨细胞的存活和增殖能力，结果发现细胞数在 3×10
4～1×10
6范围细胞数与MTT OD值呈正相关，线性良好，能准确、灵敏地反映对数生长期细胞增殖情况。因此，MTT法可用于反应培养细胞的活力和增殖能力。本方法可以直接在培养板上完成，使之更简捷，稳定，系统误差小，值得推广。
本研究利用MTT法观察ANGⅡ对培养乳鼠心肌细胞活力的影响，结果发现ANGⅡ作用 1 h 和 12 h与未经ANGⅡ处理比较，细胞活力明显上升(P<0.05)，至 12 h时达最高峰，此后出现下降，至 24 h已开始明显低于正常水平。Mosmann为了证实是否死细胞或静止细胞同样能还原MTT，选取了无活性的血红细胞和脾细胞，结果证实二者都不能还原MTT而Con A活化的淋巴细胞则可明显地增加formazan的生成量。国内朱文菁等人用MTT法分析成骨细胞的存活和增殖能力，结果发现细胞数在 3×10
4～1×10
6范围细胞数与MTT OD值呈正相关，线性良好，能准确、灵敏地反映对数生长期细胞增殖情况。因此，MTT法可用于反应培养细胞的活力和增殖能力。本方法可以直接在培养板上完成，使之更简捷，稳定，系统误差小，值得推广。
本研究利用MTT法观察ANGⅡ对培养乳鼠心肌细胞活力的影响，结果发现ANGⅡ作用 1 h 和 12 h 与未经ANGⅡ处理比较，细胞活力明显上升(P<0.05)，至 12 h时达最高峰，此后出现下降，至 24 h已开始低于正常水平，但MTT产物OD值与未经ANGⅡ处理组相比尚无统计学差异(P>0.05)，但却明显底于 1 h 和 12 h组(P<0.05)。结果提示在 12 h内ANGⅡ可以提高培养乳鼠心肌细胞的活力，12 h以后则可使其下降，24 已开始低于正常水平。
以往研究说明心功能不全经历了由代偿向失代偿的转变过程。以往研究结果提示心功能由代偿向失代偿转变的过程中RAS的激活特别是局部RAS的激活起了重要的作用，而其中主要的生物学活性物质为ANGⅡ，ANGⅡ在心功能不全的发生发展中扮演了十分重要的角色。心肌能量代谢是保证心脏功能正常进行和组织结构不断更新的物质基础，故心肌能量代谢的障碍是引起心力衰竭发生发展的重要因素
[8,9]。我们以往研究发现心力衰竭时心肌细胞能量产生及利用均出现障碍
[10]，但未阐明心功能不全早期心肌是如何进行代偿的。本研究通过观察ANGⅡ对心肌细胞活力的影响说明早期ANGⅡ(12 h内)通过提高心肌细胞的活力起心功能代偿作用，而晚期则降低心肌细胞的活力导致心肌收缩力的下降，最终发生心力衰竭。本研究结果提示早期ACEI或ANGⅡ受体拮抗剂干预可能对心功能不全的纠正不利，这方面研究的深入对ACEI或ANGⅡ受体拮抗剂在临床上的正确应用有重要的参考价值。
作者简介：陈光辉(1964-)，男，山西省宁武县人，1999 年第三军医大学博士毕业，解放军总医院老年心血管病研究所99届博士后，主治医师；发表论文30余篇。电话：(010)66936567
[参考文献]
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收稿日期：2000-04-26； 修回日期：2000-05-15
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