MCAO后鼠脑的病理演变及其治疗窗数学模拟研究
作者：何明利 陈曼娥 王景周
单位：何明利(四川省达川地区人民医院 635000)；陈曼娥 王景周(第三军医大学大坪医院野战外科研究所 400042)
关键词：脑缺血；病理学；治疗窗
中国现代医学杂志000403 目的：探讨MCAO缺血侧不同部位缺血组织的病理演变特征，阐明缺血时间与神经元损伤程度的关系。方法：利用线栓法MCAO模型，采取TTC和HE染色，光镜电镜观察MCAO不同时相点缺血侧基底节区、皮层和海马的损伤特征，并直接对坏死和暗神经元计数，运用对数方程作出缺血时间-脑损伤程度关系曲线，运算ET50值。结果：缺血30 min，坏死神经元首先大量出现在缺血侧基底节区，以后逐渐扩展到皮层，至缺血24 h后，缺血中心逐步出现凝固性坏死，缺血时间依赖性病理变化完全符合剂量反应曲线的S-形分布。结论：MCAO后，MCA分布脑区的病理变化可分为组织水肿期、神经元急剧损伤期和凝固性坏死期三个阶段。治疗窗因阻塞血管和缺血部位及组织可逆的期望值不同而异。主张治疗窗应“个体化”。
, http://www.100md.com
分类号 R311
PATHOLOGIC PROGRESSES IN RATS AFTER
MIDDLE CEREBRAL ARTERY OCCLUSION AND
MATHEMATICS STUDY ON THE THERAPEUTIC WINDOW
He Mingli
(Da Chuan Prefectual Hospital, Si Chuan 635000)
Chen Mane Wang Jingzhou
(Department of Neurology, DaPing Hospital, Third Military Medical University, Chong qing 40004)
, http://www.100md.com
Objective: The objective of this experiment was to chart the time course and the topographic distribution of the neuronal necrosis that follows the middle cerebral artery occlusion, to clarify relationship between ischemic time and extent of cerebral injury. Methods: Using a model which middle cerebral artery occlusion (MCAO) by line in rats, processing the brains for histology, a meticulous structural evaluation of each specimen, including quantitation of necrotic neurons, was followed by a detailed statistical analysis of the neutonal counts. Using a logistic equation to calculate the relationship between the duration of ischemia and the extent of injury. Results: 30 minutes after cerebral ischemia onset, necrosis neurons a great deal appeared in caudoputamen, and then progressively developed to cortex. Pannecrosis was observed after 24 hours. Ischemia-dependenced pathologic change completely fits sigmoidal (S-shaped) dose-response curves. Conclusions: This experiments confirm that pathologic change induced by MCA occlusion are of three periods: acute edema period, soaring injury period and pannecrosis period. Different vessel occlusion, different brain areas have different therapeutic window. This paper stress “individuation”of therapeutic window.
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Key words: Cerebral ischemia, Pathology, Therapeutic window.
本实验采用线栓法MCAO模型[1]，从组织学角度，探讨大鼠MCAO后不同时相缺血侧基底节区、皮层和海马的损伤特征，并应用对数方程[2]探索缺血时间与神经元损伤程度的关系。
1 材料与方法
1.1 动物来源与分组
Wistar大鼠75只(中国军事医学科学院提供)，雌雄不拘，体重200～250 g，随机分为正常对照组(5只)，假手术组(20只)和MCAO组(50只)3组。假手术组再分设术后1，6，12，24 h 4个时相点(每组5只)。MCAO组再分设术后0.5，1，1.5，2，3，4，6，12，24和48 h 10个时相点(每组5只)。
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1.2 模型制备
按照我们已报道的方法进行[3]。假手术组为插入栓线后1 min将栓线拔出。
1.3 组织处理
于各时相点以0.5%戊巴妥钠(30 mg/kg ip)麻醉动物，用4%甲醛磷酸缓冲液100 ml灌注。用于盐酸2，3，5，-Tripheryltetrazolium hydrochloride,TTC)染色[4]的脑片，自前至后行全脑连续冠状切片(片厚约2 mm)，置于2%TTC染液中染色30 min。用于光镜检查的标本切成5 μm厚，行苏木精-伊红染色，用于光镜检查的标本切成1 mm3的组织块，置于3%戊二醛室温过液，再经一系列组织处理和染色，H-300透射电镜观察并照相。
1.4 坏死神经元的确定
, 百拇医药
参照Farber等的标准确定[5]。光镜下见神经元固缩、核分裂、核溶解、胞浆伊红染色增多，甚至苏木精染色消失，呈红色神经元(鬼影神经元)改变者均确定为坏死神经元。暗神经元均视为不可逆神经元，亦列为计数范围。
1.5 组织损伤程度的定量
1.5.1 TTC染色 苍白区为缺血损伤区，按公式：V＝(S1+S2+…+Sn)×0.5计算缺血损伤体积(式中V为缺血损伤体积，S1～Sn为各切片椭圆面积，0.5为常数)。
1.5.2 光镜观察 放大400倍观察，每组每时相点每部位计数20个互不重叠的显微视野，准确计数出完整，坯死和暗神经元数量。
1.6 缺血时间与脑损伤程度的关系研究
, 百拇医药
因为本实验结果为一自变量(缺血时间)连续变化的结果，完全适用于对数方程所得出的S-形剂量反应曲线[2]。其运算公式为：Y＝a-d/1+(X/c)+d或d logit{(y-d)/(a-d)}/d ln(X)＝±b。式中Y为组织损伤量，用TTC染色的苍白区体积或不可逆神经元(坏死和暗神经元)数量均可代表不可逆组织损伤量。X为缺血时间，a为X＝0的Y值，d为无限时间的组织损伤量。c为ET50，即a-d之间一半的组织损伤量，b为斜率。遵照对数公式，便可作出缺血时间-脑损伤程度关系曲线，在此曲线上可查出任意缺血时间的不可逆组织损伤量，明确缺血治疗窗。
1.7 统计学处理
采用第四军医大学SPLM统计软件。全部数据以均数±标准差(
±s)表示。采用t检验等。
, 百拇医药
2 结果
2.1 TTC染色脑梗死容积的变化
正常对组和假手术组各时相点均未见苍白区，MCAO组0.5 h亦然。MCAO后，随着缺血时间的延长，苍白区体积迅速增加，其快速增长期位于MCAO后1～6 h，至12 h达峰值，以后增加甚微。
2.2 脑组织病理学变化
2.2.1 光镜观察 正常对照组和假手术组各时相点双侧大脑半球均可见散在的暗神经元和坏死神经元，但20个高倍视野的总数不超过10个。MCAO 0.5 h，暗神经元和坏死神经元首先大量出现在缺血侧基底结区，并见完整神经元周围间歇增大、白质水肿、中性粒细胞和淋巴细胞浸润。至MCAO 1 h，这些改变才逐步扩展到皮层。基底结区的细胞损伤高峰期位于MCAO 0.5～2 h，皮层为MCAO 1～6 h，而双侧海马MCAO 24 h内仅见散在极少量的暗神经元和坏死神经元分布，但病侧海马组织水肿持续存在，重于健侧。MCAO 24 h后，海马暗神经元和坏死神经元迅速增加,基底结区和皮层MCAO 24 h后缓渐固性坏死,而海马始终未见凝固性坏死。
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2.2.2 电镜观察 神经元胞浆破粹、线粒体肿胀或空泡化，胞核缩小变形、核膜电密集物沉积、染色质聚集、髓鞘水肿，其板层松散分离。
2.3 缺血时间与脑损伤程度的关系
将MCAO组各时相点的相应数据转换为占该时相点的百分比，再代入对数方程Y＝a-d/1+(X/c)+d或d logit{(y-d)/(a-d)}/d ln(X)＝±b，即可绘出缺血时间-脑损伤程度关系曲线。并在此曲线上直接查出附表数据。
附表 Wistar大鼠MCA分布区治疗窗数 染色
部位
CR
(min)
, 百拇医药
ET50
(min)
NR
(min)
HE染色
基底结区
17±8
63±38
203±117
皮层
35±12
125±56
356±154
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海马
530±214
1 025±368
2 278±876
TTC染色
MCA区
26±11
104±92
226±168
3 讨论
分析本实验所见，持续MCA阻塞，其供血区脑组织出现依赖性病理变化，这些变化可归纳为三个阶段，即组织水肿期、神经元急剧损伤期和凝固性坏死期。组织水肿期神经元水肿、变形、其周围间隙增大，间质水肿，其超微结构改变为染色质聚集、内质网扩张、线粒体肿胀等。这些改变多发生于MCAO数分钟，最长不超过2 h。本实验海马在MCAO 24 h内均为此改变，可能与海马主要由大脑前动脉供血并受脑组织释放的高浓度活性介质或递质作用和应激性损伤有关。业已证明，如果此是迅速恢复组织灌注，这些改变可以逆转。神经元急剧损伤期：如果组织持续缺血、坏死和暗神经元将在组织水肿期后急剧增多，其超微结构改变为神经元胞核缩小变形、核膜电子密集物沉积、染色质边聚、髓鞘水肿、板层松散分离等。此期因部位不同其发生的时间变化甚大，短者数十分钟，长者数十小时甚至数天，故名迟发性组织神经元坏死。这些改变并不因组织灌注的恢复而逆转。凝固性坏死期为大块组织细胞(包括神经间质、血管和神经元)崩解、凝固性坏死，间有小胶质细胞的增生。本期是脑缺血性损伤的最坏的结果。
, 百拇医药
上述讨论可见，治疗窗是缺血发作后缺血脑组织存在有不同数量因复流而逆转的神经元的时间。本文应用对数方程研究发现，大鼠的脑缺血时间依赖性病理变化完全符合剂量反应曲线的S-形分布，可以认为CR点以短的时间段是最理想的治疗窗，CR至ET50之间的时间段是较理想的治疗窗，但位居ET50至NR之间的时间非无治疗意义。可见，治疗窗是对组织可逆性大小而言。本实验还发现，同一只大鼠，MCA分部各区的组织损伤程度各不相同，即各部位的治疗窗不一致，说明治疗窗绝非是一个固定的参数，它将因动物种类、阻塞血管和缺血部位及组织可逆的期望值不同而异。因此，为了最大限度地挽救缺血损伤组织，避免漏治过治病例，我们强调，临床中治疗窗应根据具体病人的阻塞血管和缺血部位等因素的不同而行“个体化”判定。
参 考 文 献
1，Koizumi J,Yoshida Y,Nakazwa F,et al.Exerimental studies of ischemic grain edema:A new experimental mode of cerebral embolism in rats in wife recirculation can be introduced in the ischemic area.Stroke,1986；8:1～8
, 百拇医药
2，Aroowski J,Ostrow P,Samwas E,et al.Graded bilassay for demonstratiom if vroom rescie from experimental acute ischemia in rats，1994；25:2235～2240
3，何明利，陈曼娥，王景周，等.急性脑缺血鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的活动特征.中华神经科杂志，1998；31：364～643
4，Garcia JH,Liu KF.Hw KL.Neuromal necrosis after middle cerebral atrery occlision in Wixtar ratsprogresses at different time intrvals in the caudoputaman and the cortex.Stroke,1995；20:636～643
5，Farber JL,Biology of disease:membrane injury and calcium homeostasis in the pathogenesis of coagulation mecrosis.Lab Invest，1982；47:114～123
收稿1999-06-21, 百拇医药
单位：何明利(四川省达川地区人民医院 635000)；陈曼娥 王景周(第三军医大学大坪医院野战外科研究所 400042)
关键词：脑缺血；病理学；治疗窗
中国现代医学杂志000403 目的：探讨MCAO缺血侧不同部位缺血组织的病理演变特征，阐明缺血时间与神经元损伤程度的关系。方法：利用线栓法MCAO模型，采取TTC和HE染色，光镜电镜观察MCAO不同时相点缺血侧基底节区、皮层和海马的损伤特征，并直接对坏死和暗神经元计数，运用对数方程作出缺血时间-脑损伤程度关系曲线，运算ET50值。结果：缺血30 min，坏死神经元首先大量出现在缺血侧基底节区，以后逐渐扩展到皮层，至缺血24 h后，缺血中心逐步出现凝固性坏死，缺血时间依赖性病理变化完全符合剂量反应曲线的S-形分布。结论：MCAO后，MCA分布脑区的病理变化可分为组织水肿期、神经元急剧损伤期和凝固性坏死期三个阶段。治疗窗因阻塞血管和缺血部位及组织可逆的期望值不同而异。主张治疗窗应“个体化”。
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分类号 R311
PATHOLOGIC PROGRESSES IN RATS AFTER
MIDDLE CEREBRAL ARTERY OCCLUSION AND
MATHEMATICS STUDY ON THE THERAPEUTIC WINDOW
He Mingli
(Da Chuan Prefectual Hospital, Si Chuan 635000)
Chen Mane Wang Jingzhou
(Department of Neurology, DaPing Hospital, Third Military Medical University, Chong qing 40004)
, http://www.100md.com
Objective: The objective of this experiment was to chart the time course and the topographic distribution of the neuronal necrosis that follows the middle cerebral artery occlusion, to clarify relationship between ischemic time and extent of cerebral injury. Methods: Using a model which middle cerebral artery occlusion (MCAO) by line in rats, processing the brains for histology, a meticulous structural evaluation of each specimen, including quantitation of necrotic neurons, was followed by a detailed statistical analysis of the neutonal counts. Using a logistic equation to calculate the relationship between the duration of ischemia and the extent of injury. Results: 30 minutes after cerebral ischemia onset, necrosis neurons a great deal appeared in caudoputamen, and then progressively developed to cortex. Pannecrosis was observed after 24 hours. Ischemia-dependenced pathologic change completely fits sigmoidal (S-shaped) dose-response curves. Conclusions: This experiments confirm that pathologic change induced by MCA occlusion are of three periods: acute edema period, soaring injury period and pannecrosis period. Different vessel occlusion, different brain areas have different therapeutic window. This paper stress “individuation”of therapeutic window.
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Key words: Cerebral ischemia, Pathology, Therapeutic window.
本实验采用线栓法MCAO模型[1]，从组织学角度，探讨大鼠MCAO后不同时相缺血侧基底节区、皮层和海马的损伤特征，并应用对数方程[2]探索缺血时间与神经元损伤程度的关系。
1 材料与方法
1.1 动物来源与分组
Wistar大鼠75只(中国军事医学科学院提供)，雌雄不拘，体重200～250 g，随机分为正常对照组(5只)，假手术组(20只)和MCAO组(50只)3组。假手术组再分设术后1，6，12，24 h 4个时相点(每组5只)。MCAO组再分设术后0.5，1，1.5，2，3，4，6，12，24和48 h 10个时相点(每组5只)。
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1.2 模型制备
按照我们已报道的方法进行[3]。假手术组为插入栓线后1 min将栓线拔出。
1.3 组织处理
于各时相点以0.5%戊巴妥钠(30 mg/kg ip)麻醉动物，用4%甲醛磷酸缓冲液100 ml灌注。用于盐酸2，3，5，-Tripheryltetrazolium hydrochloride,TTC)染色[4]的脑片，自前至后行全脑连续冠状切片(片厚约2 mm)，置于2%TTC染液中染色30 min。用于光镜检查的标本切成5 μm厚，行苏木精-伊红染色，用于光镜检查的标本切成1 mm3的组织块，置于3%戊二醛室温过液，再经一系列组织处理和染色，H-300透射电镜观察并照相。
1.4 坏死神经元的确定
, 百拇医药
参照Farber等的标准确定[5]。光镜下见神经元固缩、核分裂、核溶解、胞浆伊红染色增多，甚至苏木精染色消失，呈红色神经元(鬼影神经元)改变者均确定为坏死神经元。暗神经元均视为不可逆神经元，亦列为计数范围。
1.5 组织损伤程度的定量
1.5.1 TTC染色 苍白区为缺血损伤区，按公式：V＝(S1+S2+…+Sn)×0.5计算缺血损伤体积(式中V为缺血损伤体积，S1～Sn为各切片椭圆面积，0.5为常数)。
1.5.2 光镜观察 放大400倍观察，每组每时相点每部位计数20个互不重叠的显微视野，准确计数出完整，坯死和暗神经元数量。
1.6 缺血时间与脑损伤程度的关系研究
, 百拇医药
因为本实验结果为一自变量(缺血时间)连续变化的结果，完全适用于对数方程所得出的S-形剂量反应曲线[2]。其运算公式为：Y＝a-d/1+(X/c)+d或d logit{(y-d)/(a-d)}/d ln(X)＝±b。式中Y为组织损伤量，用TTC染色的苍白区体积或不可逆神经元(坏死和暗神经元)数量均可代表不可逆组织损伤量。X为缺血时间，a为X＝0的Y值，d为无限时间的组织损伤量。c为ET50，即a-d之间一半的组织损伤量，b为斜率。遵照对数公式，便可作出缺血时间-脑损伤程度关系曲线，在此曲线上可查出任意缺血时间的不可逆组织损伤量，明确缺血治疗窗。
1.7 统计学处理
采用第四军医大学SPLM统计软件。全部数据以均数±标准差(
±s)表示。采用t检验等。, 百拇医药
2 结果
2.1 TTC染色脑梗死容积的变化
正常对组和假手术组各时相点均未见苍白区，MCAO组0.5 h亦然。MCAO后，随着缺血时间的延长，苍白区体积迅速增加，其快速增长期位于MCAO后1～6 h，至12 h达峰值，以后增加甚微。
2.2 脑组织病理学变化
2.2.1 光镜观察 正常对照组和假手术组各时相点双侧大脑半球均可见散在的暗神经元和坏死神经元，但20个高倍视野的总数不超过10个。MCAO 0.5 h，暗神经元和坏死神经元首先大量出现在缺血侧基底结区，并见完整神经元周围间歇增大、白质水肿、中性粒细胞和淋巴细胞浸润。至MCAO 1 h，这些改变才逐步扩展到皮层。基底结区的细胞损伤高峰期位于MCAO 0.5～2 h，皮层为MCAO 1～6 h，而双侧海马MCAO 24 h内仅见散在极少量的暗神经元和坏死神经元分布，但病侧海马组织水肿持续存在，重于健侧。MCAO 24 h后，海马暗神经元和坏死神经元迅速增加,基底结区和皮层MCAO 24 h后缓渐固性坏死,而海马始终未见凝固性坏死。
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2.2.2 电镜观察 神经元胞浆破粹、线粒体肿胀或空泡化，胞核缩小变形、核膜电密集物沉积、染色质聚集、髓鞘水肿，其板层松散分离。
2.3 缺血时间与脑损伤程度的关系
将MCAO组各时相点的相应数据转换为占该时相点的百分比，再代入对数方程Y＝a-d/1+(X/c)+d或d logit{(y-d)/(a-d)}/d ln(X)＝±b，即可绘出缺血时间-脑损伤程度关系曲线。并在此曲线上直接查出附表数据。
附表 Wistar大鼠MCA分布区治疗窗数 染色
部位
CR
(min)
, 百拇医药
ET50
(min)
NR
(min)
HE染色
基底结区
17±8
63±38
203±117
皮层
35±12
125±56
356±154
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海马
530±214
1 025±368
2 278±876
TTC染色
MCA区
26±11
104±92
226±168
3 讨论
分析本实验所见，持续MCA阻塞，其供血区脑组织出现依赖性病理变化，这些变化可归纳为三个阶段，即组织水肿期、神经元急剧损伤期和凝固性坏死期。组织水肿期神经元水肿、变形、其周围间隙增大，间质水肿，其超微结构改变为染色质聚集、内质网扩张、线粒体肿胀等。这些改变多发生于MCAO数分钟，最长不超过2 h。本实验海马在MCAO 24 h内均为此改变，可能与海马主要由大脑前动脉供血并受脑组织释放的高浓度活性介质或递质作用和应激性损伤有关。业已证明，如果此是迅速恢复组织灌注，这些改变可以逆转。神经元急剧损伤期：如果组织持续缺血、坏死和暗神经元将在组织水肿期后急剧增多，其超微结构改变为神经元胞核缩小变形、核膜电子密集物沉积、染色质边聚、髓鞘水肿、板层松散分离等。此期因部位不同其发生的时间变化甚大，短者数十分钟，长者数十小时甚至数天，故名迟发性组织神经元坏死。这些改变并不因组织灌注的恢复而逆转。凝固性坏死期为大块组织细胞(包括神经间质、血管和神经元)崩解、凝固性坏死，间有小胶质细胞的增生。本期是脑缺血性损伤的最坏的结果。
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上述讨论可见，治疗窗是缺血发作后缺血脑组织存在有不同数量因复流而逆转的神经元的时间。本文应用对数方程研究发现，大鼠的脑缺血时间依赖性病理变化完全符合剂量反应曲线的S-形分布，可以认为CR点以短的时间段是最理想的治疗窗，CR至ET50之间的时间段是较理想的治疗窗，但位居ET50至NR之间的时间非无治疗意义。可见，治疗窗是对组织可逆性大小而言。本实验还发现，同一只大鼠，MCA分部各区的组织损伤程度各不相同，即各部位的治疗窗不一致，说明治疗窗绝非是一个固定的参数，它将因动物种类、阻塞血管和缺血部位及组织可逆的期望值不同而异。因此，为了最大限度地挽救缺血损伤组织，避免漏治过治病例，我们强调，临床中治疗窗应根据具体病人的阻塞血管和缺血部位等因素的不同而行“个体化”判定。
参 考 文 献
1，Koizumi J,Yoshida Y,Nakazwa F,et al.Exerimental studies of ischemic grain edema:A new experimental mode of cerebral embolism in rats in wife recirculation can be introduced in the ischemic area.Stroke,1986；8:1～8
, 百拇医药
2，Aroowski J,Ostrow P,Samwas E,et al.Graded bilassay for demonstratiom if vroom rescie from experimental acute ischemia in rats，1994；25:2235～2240
3，何明利，陈曼娥，王景周，等.急性脑缺血鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的活动特征.中华神经科杂志，1998；31：364～643
4，Garcia JH,Liu KF.Hw KL.Neuromal necrosis after middle cerebral atrery occlision in Wixtar ratsprogresses at different time intrvals in the caudoputaman and the cortex.Stroke,1995；20:636～643
5，Farber JL,Biology of disease:membrane injury and calcium homeostasis in the pathogenesis of coagulation mecrosis.Lab Invest，1982；47:114～123
收稿1999-06-21, 百拇医药