用PC R-SSCP方法探讨ras基因、p53基因突变与喉癌的关系
作者：辛露 赵书佑 罗兵
单位：辛露(青岛市立医院耳鼻喉科，266011)；赵书佑(青岛市立医院耳鼻喉科，266011)；罗兵(青岛大学医学院微生物学 教研室)
关键词：基因，RAS；基因，P53；突变；聚合酶链反应；喉肿瘤
山东医大基础医学院学报000403 摘要：目的:研究ras基因、p53基因突变与 喉鳞状细胞癌发病的关系。方法:应用多聚酶链反应-单链构像多态性分 析(PCR-SSCP)方法分析40例喉鳞状细胞癌H-ras,K-ras,和N-ras基因的第12密码子,p53 基因第5,7外显子中点突变的情况。结果:H-ras基因突变9例,突变率为22 .5%(9/40)；K-ras基因突变8例,突变率为20%(8/40)，N-ras基因突变5例,突变率为12.5% (5/40).p53基因第5外显子突变7例,突变率为17.5%(7/40)；第7外显子突变9例,突变率为22 .5%(9/40)。5例发现有两种基因突变,且均表现为ras基因和p53外显子改变。结论 :ras基因,p53基因的改变在喉鳞状细胞癌的发生中共同起作用。
, 百拇医药
中图分类号：R 739.65 文献标识码：A
文章编号:1008-8202(2000)04-0198-02
The point mutation of ras and p53 genes in laryngeal squam ous cell carcinomas
Xin Lu Zhao Shuyou
(1Qi ngdao Municipal Hospital,266011)
Luo Bing
(The Medical College of Qingdao University)
Abstract：Objective:To evaluate the role of oncogene ras and suppressor gene p53 in laryngeal squamous cell carcinoma.Method:The point mutations of the 12th coden of ras gene and p53 E5 and E7 gene were studied in 40 cases w ith laryngeal squamous cell carcinomas by PCR-SSCP(polymerase chain reaction-s ingle stranded conformational polymorphism).Result:22 out of 40(55%) primary tumors were detected the point mutations in the coden 12th of k-ras an d n-ras,h-ras.The point mutations of p53 E5 and E7 were found in 16 laryng eal tumors (16/40,40%).Conclusion:The point mutations of ras a nd p53 genes are both the i mportant mechanisms of the occasion in laryngeal squamous cell carcinoma.
, 百拇医药
Key words：Genes,RAS；Genes,P53；Mutation；Polymerase chain rea ction；Laryngeal neoplasms
从分子生物学角度看抑癌基因失 活是 肿瘤发生、发展的重要因素。ras基因,p53基因是目前发现分布最广,与肿瘤相关性较高的几 种癌基因、抑癌基因之一,它们与喉癌的相关性[1，3]虽有报道,但结论不一,且 多为单因素分析。我们采用PCR-SSCP技术对喉癌组织中ras基因,p53基因的变异及意义进行 了探讨。
1 资料与方法
1.1 临床资料 40例喉癌组织标本均来 源于临床手术患者,均经病检确诊为鳞状细胞癌,其中高分化18例,中分化14例,低分化8例,年 龄为36～74岁,男37例,女3例。标本取自青岛大学医学院附属医院和青岛市立医院。
, 百拇医药
1. 2 方法
1.2.1 常规酚氯仿-异戊醇法提取组织DNA。
1.2.2 PCR引物设计 ras基 因突变热点集中在第12/13/61密码子,p53基因异常改变多位于第5～8外显子,结合头颈部肿 瘤突变热点选取含有H-ras,K-ras,和N-ras基因的第12密码子,p53基因第5,7外显子的基 因片段为研究对象。引物设计[2，12]见表1。
1.2.3 PCR反应体系 反应总体积25μl.反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μl,dNTP终浓 度0.2mmol/L(0.2μl),MgCl2终浓度1.5mmol/L(1.5μl),T aqDNA聚合酶1U(0.2μl),引物终浓度均为0.6μmol/L(1.5μl),模板4μl,加入去离子水至 终体积25μl。混匀后离心,加无菌石蜡油覆盖液面，置DNA扩增仪。反应条件:94℃变性30s, 56℃复性30s,72℃延伸45s,共35个循环,最后72℃延伸5min。取PCR产物8μl,以PCR-Maker 作为扩增片段长度标准,于含溴化乙锭(0.5μl/ml)的1.5琼脂糖凝胶电泳(80V，1h)。由紫 外光透射仪观察结果确定有特异性的扩增条带。
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1.2.4 SSCP检测 取2μlPCR产物与等 体积的变性缓冲液(95%甲酰胺,10mmol/L NaOH,0.05%溴芬蓝，0.05%二甲苯青)混合,置于95 ℃水浴5min,取出立即置于冰水中骤冷10min,快速上样于预电泳过的8%非变性聚丙烯酰胺凝 胶 中
表1 P53基因第5,7外显子的引物设计 H-ras
N-ras
K-ras
p53.E7
p53.E5
5′
5′
5′
, 百拇医药
5′
5′
5′
5′
5′
5′
5′
CAGGGCCCTCCTTGGCAGG3′
GTCGT ATTCGTCCACAAAATGG3′
AACTGGTGGTGGTTGGACCA3′
CTCTATGGTGGGATCATATTC3′
, http://www.100md.com ACTGAAT ATAAACTTGTGGT
AGTTGGACTT3′
TCAAAGAATGGTCCTGGACC3′
CCCAAGGCGCACT GACCTCA3′
GCTCCTGACCTGGAGTCTTC3′
TTCCTCTTCCTGCAGTACTCC3′
GACGCGGGTCCCGGGCG G3′
以上各对引物扩增片段长度分 别为170bp,98bp,157bp,164bp和110bp
(49:1)电泳,(4℃,200V,1h)结束后在固定液 (10%乙醇、0.5%冰醋酸)中固定5min,双蒸水漂洗两次；0.2%硝酸银染5min,双蒸水漂洗两次 ；用显色液(0.75%NaOH、0.2甲醛)显色10min,双蒸水漂洗两次。
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2 结 果
40例喉癌经PCR扩增发现ras基因中H-ras,K-ras,N-ras的第12密码子,p53 基因的第5、7外显子,产物变性后并经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色可见野生型的 单链DNA位于同一水平上,而突变型的单链DNA低于或高于野生型单链DNA水平,以此来确定突 变的例数和突变率,见表2。本组40例中发现5例有两种基因的突变,且均表现为ras基因和p53 外显子改变。
3 讨 论
肿瘤的发生可能涉及多个癌基因和抑癌 基因的失活。ras 基因是人类肿瘤发生中较活跃的癌基因,其中第12/13/6 1密码子为突变热点,其突变率在各种肿瘤中明 显 不同[4，6]。在喉癌中的表达率各家报道不一,Anwar等[5]的研究 结果为42例喉癌标本中22例发生N-ras第12密码子突变。Sem[8]采用核酸杂交法 研究发现，喉癌ras基因第12/13/61密码子的突变率为60%。而Fraochiolla等[9] 采用PCR-SSCP方法和DNA测序法分析N/H/K-ras基因在45例喉癌中的突变情况,结果无一例 突变。Pathede等[10]研究认为,K-ras基因第12/13密码子的突变在头颈部肿 瘤中为罕发事件。而本结果ras基因中总的突变率为55%,Stem的研究结果与本结果一致,证明 在喉癌中,ras第12密码子为突变热点。表2 喉癌中ras基因、p53基因点突变的 检测
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点突变(n)
合计(n)
突变率(%)
H-ras
K-ras
B-ras
p53E5
p53E7
9
8
5
7
, 百拇医药 9
40
40
40
40
40
22.5
20.0
12.5
17.5
22.5
研究表明,p53基因缺失和突变与多种肿瘤的发 生密切相关,其中突变热点为第5～8外显子[11]。引起肿瘤形成细胞转化的P53蛋 白是p53基因突变后编码的产物,它是一种肿瘤促进因子,能显著抑制正常p53的功能[ 1，11]。本实验中p53总的突变率为40%,其中第5外显子为17.5%,第7外显子为22.5%, 两者差异无显著性(P>0.05)。
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另外,本组实验结果提示:ras基因 、p53基因均为喉癌发生的相关因素,两者为平行作用,两者突变率无显著性差异。
作者简介：辛露(1971—)女,山东青岛人,青岛市立医院医师,主要从事喉肿瘤诊治的研究。
参考文献
1，Maerstro R et al.High frequ e ncy of p53 gene alteration associated with protein overexpression in human squam ous cell carcinoma of the larynx [J] .Oncogene,1992,7(6):1159-1166
2，罗元辉,等.采用PCR-RFLP技术分析石蜡包埋胃癌组织ras和p53基因点突变[J].肿瘤防治研究,1995,22(2):68-71
, http://www.100md.com
3，杨强.喉癌ras基因产物p21及H-ras 基因点突变的研究[J].中华耳鼻喉科学杂志,1993,(4):209-212
4，Bos JL,et al. Ras oncogene in human cancer:A review[J].Cancer Res,1989,49:4682
5，Anwar K,Nakakuki K,et al.Ras gene mutation and HPV infection are common in hum an laryngeal carcinoma[J].Int J Cancer,1993,53(1):22-28
6，Liu S,Lin D,et al.Analysis of x-Ha-ras amplification and mutation in human lary ngeal carcinoma[J].Chin Med Sci J,1995,10(1):59
, 百拇医药
7，Fracch iolla NS,Pignataro L,et al.Multiple genetic lesion in laryngeal squamous cell ca rcinoma [J] .Cancer,1995,75(6):1292-1301
8，Stem SJ,Degawa M,et al.Metabolic activation,DNA adducts,and h-ras mutations in human neoplastic and non-neoplastic laryngeal tissue [J] .J Cell Biochem Suppl,1993,17F:129-137
9，Shidara K,Suxuk T,et al.Lack of synergistic association betw een human papiloma carcinoma [J] .Laryngoscope,1994,104(8):1008-1012
, http://www.100md.com
10，Pathcke IO,Gottschlich SS,et al.Incidence of point mutations in ki -ras cod en 12 and 132 in squamous epithelial carcinoma of the head-neck region [J] .L aryngorhinologic,1996,75(8):465-470
11，Zhang L,et al.p53 mutatio n in larynx cancer [J] .Carcinogenesis,1994,15(12):294
12，Baker SJ,Fear an ER,Nigro JM,et al.Chromosome 17 deletion and p53 gene mutations in colotectel carcinomas[J].Science,1989,244(4):217
收稿日期：2000-02-06, 百拇医药
单位：辛露(青岛市立医院耳鼻喉科，266011)；赵书佑(青岛市立医院耳鼻喉科，266011)；罗兵(青岛大学医学院微生物学 教研室)
关键词：基因，RAS；基因，P53；突变；聚合酶链反应；喉肿瘤
山东医大基础医学院学报000403 摘要：目的:研究ras基因、p53基因突变与 喉鳞状细胞癌发病的关系。方法:应用多聚酶链反应-单链构像多态性分 析(PCR-SSCP)方法分析40例喉鳞状细胞癌H-ras,K-ras,和N-ras基因的第12密码子,p53 基因第5,7外显子中点突变的情况。结果:H-ras基因突变9例,突变率为22 .5%(9/40)；K-ras基因突变8例,突变率为20%(8/40)，N-ras基因突变5例,突变率为12.5% (5/40).p53基因第5外显子突变7例,突变率为17.5%(7/40)；第7外显子突变9例,突变率为22 .5%(9/40)。5例发现有两种基因突变,且均表现为ras基因和p53外显子改变。结论 :ras基因,p53基因的改变在喉鳞状细胞癌的发生中共同起作用。
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中图分类号：R 739.65 文献标识码：A
文章编号:1008-8202(2000)04-0198-02
The point mutation of ras and p53 genes in laryngeal squam ous cell carcinomas
Xin Lu Zhao Shuyou
(1Qi ngdao Municipal Hospital,266011)
Luo Bing
(The Medical College of Qingdao University)
Abstract：Objective:To evaluate the role of oncogene ras and suppressor gene p53 in laryngeal squamous cell carcinoma.Method:The point mutations of the 12th coden of ras gene and p53 E5 and E7 gene were studied in 40 cases w ith laryngeal squamous cell carcinomas by PCR-SSCP(polymerase chain reaction-s ingle stranded conformational polymorphism).Result:22 out of 40(55%) primary tumors were detected the point mutations in the coden 12th of k-ras an d n-ras,h-ras.The point mutations of p53 E5 and E7 were found in 16 laryng eal tumors (16/40,40%).Conclusion:The point mutations of ras a nd p53 genes are both the i mportant mechanisms of the occasion in laryngeal squamous cell carcinoma.
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Key words：Genes,RAS；Genes,P53；Mutation；Polymerase chain rea ction；Laryngeal neoplasms
从分子生物学角度看抑癌基因失 活是 肿瘤发生、发展的重要因素。ras基因,p53基因是目前发现分布最广,与肿瘤相关性较高的几 种癌基因、抑癌基因之一,它们与喉癌的相关性[1，3]虽有报道,但结论不一,且 多为单因素分析。我们采用PCR-SSCP技术对喉癌组织中ras基因,p53基因的变异及意义进行 了探讨。
1 资料与方法
1.1 临床资料 40例喉癌组织标本均来 源于临床手术患者,均经病检确诊为鳞状细胞癌,其中高分化18例,中分化14例,低分化8例,年 龄为36～74岁,男37例,女3例。标本取自青岛大学医学院附属医院和青岛市立医院。
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1. 2 方法
1.2.1 常规酚氯仿-异戊醇法提取组织DNA。
1.2.2 PCR引物设计 ras基 因突变热点集中在第12/13/61密码子,p53基因异常改变多位于第5～8外显子,结合头颈部肿 瘤突变热点选取含有H-ras,K-ras,和N-ras基因的第12密码子,p53基因第5,7外显子的基 因片段为研究对象。引物设计[2，12]见表1。
1.2.3 PCR反应体系 反应总体积25μl.反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μl,dNTP终浓 度0.2mmol/L(0.2μl),MgCl2终浓度1.5mmol/L(1.5μl),T aqDNA聚合酶1U(0.2μl),引物终浓度均为0.6μmol/L(1.5μl),模板4μl,加入去离子水至 终体积25μl。混匀后离心,加无菌石蜡油覆盖液面，置DNA扩增仪。反应条件:94℃变性30s, 56℃复性30s,72℃延伸45s,共35个循环,最后72℃延伸5min。取PCR产物8μl,以PCR-Maker 作为扩增片段长度标准,于含溴化乙锭(0.5μl/ml)的1.5琼脂糖凝胶电泳(80V，1h)。由紫 外光透射仪观察结果确定有特异性的扩增条带。
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1.2.4 SSCP检测 取2μlPCR产物与等 体积的变性缓冲液(95%甲酰胺,10mmol/L NaOH,0.05%溴芬蓝，0.05%二甲苯青)混合,置于95 ℃水浴5min,取出立即置于冰水中骤冷10min,快速上样于预电泳过的8%非变性聚丙烯酰胺凝 胶 中
表1 P53基因第5,7外显子的引物设计 H-ras
N-ras
K-ras
p53.E7
p53.E5
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GTCGT ATTCGTCCACAAAATGG3′
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GCTCCTGACCTGGAGTCTTC3′
TTCCTCTTCCTGCAGTACTCC3′
GACGCGGGTCCCGGGCG G3′
以上各对引物扩增片段长度分 别为170bp,98bp,157bp,164bp和110bp
(49:1)电泳,(4℃,200V,1h)结束后在固定液 (10%乙醇、0.5%冰醋酸)中固定5min,双蒸水漂洗两次；0.2%硝酸银染5min,双蒸水漂洗两次 ；用显色液(0.75%NaOH、0.2甲醛)显色10min,双蒸水漂洗两次。
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2 结 果
40例喉癌经PCR扩增发现ras基因中H-ras,K-ras,N-ras的第12密码子,p53 基因的第5、7外显子,产物变性后并经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色可见野生型的 单链DNA位于同一水平上,而突变型的单链DNA低于或高于野生型单链DNA水平,以此来确定突 变的例数和突变率,见表2。本组40例中发现5例有两种基因的突变,且均表现为ras基因和p53 外显子改变。
3 讨 论
肿瘤的发生可能涉及多个癌基因和抑癌 基因的失活。ras 基因是人类肿瘤发生中较活跃的癌基因,其中第12/13/6 1密码子为突变热点,其突变率在各种肿瘤中明 显 不同[4，6]。在喉癌中的表达率各家报道不一,Anwar等[5]的研究 结果为42例喉癌标本中22例发生N-ras第12密码子突变。Sem[8]采用核酸杂交法 研究发现，喉癌ras基因第12/13/61密码子的突变率为60%。而Fraochiolla等[9] 采用PCR-SSCP方法和DNA测序法分析N/H/K-ras基因在45例喉癌中的突变情况,结果无一例 突变。Pathede等[10]研究认为,K-ras基因第12/13密码子的突变在头颈部肿 瘤中为罕发事件。而本结果ras基因中总的突变率为55%,Stem的研究结果与本结果一致,证明 在喉癌中,ras第12密码子为突变热点。表2 喉癌中ras基因、p53基因点突变的 检测
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点突变(n)
合计(n)
突变率(%)
H-ras
K-ras
B-ras
p53E5
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研究表明,p53基因缺失和突变与多种肿瘤的发 生密切相关,其中突变热点为第5～8外显子[11]。引起肿瘤形成细胞转化的P53蛋 白是p53基因突变后编码的产物,它是一种肿瘤促进因子,能显著抑制正常p53的功能[ 1，11]。本实验中p53总的突变率为40%,其中第5外显子为17.5%,第7外显子为22.5%, 两者差异无显著性(P>0.05)。
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另外,本组实验结果提示:ras基因 、p53基因均为喉癌发生的相关因素,两者为平行作用,两者突变率无显著性差异。
作者简介：辛露(1971—)女,山东青岛人,青岛市立医院医师,主要从事喉肿瘤诊治的研究。
参考文献
1，Maerstro R et al.High frequ e ncy of p53 gene alteration associated with protein overexpression in human squam ous cell carcinoma of the larynx [J] .Oncogene,1992,7(6):1159-1166
2，罗元辉,等.采用PCR-RFLP技术分析石蜡包埋胃癌组织ras和p53基因点突变[J].肿瘤防治研究,1995,22(2):68-71
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3，杨强.喉癌ras基因产物p21及H-ras 基因点突变的研究[J].中华耳鼻喉科学杂志,1993,(4):209-212
4，Bos JL,et al. Ras oncogene in human cancer:A review[J].Cancer Res,1989,49:4682
5，Anwar K,Nakakuki K,et al.Ras gene mutation and HPV infection are common in hum an laryngeal carcinoma[J].Int J Cancer,1993,53(1):22-28
6，Liu S,Lin D,et al.Analysis of x-Ha-ras amplification and mutation in human lary ngeal carcinoma[J].Chin Med Sci J,1995,10(1):59
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7，Fracch iolla NS,Pignataro L,et al.Multiple genetic lesion in laryngeal squamous cell ca rcinoma [J] .Cancer,1995,75(6):1292-1301
8，Stem SJ,Degawa M,et al.Metabolic activation,DNA adducts,and h-ras mutations in human neoplastic and non-neoplastic laryngeal tissue [J] .J Cell Biochem Suppl,1993,17F:129-137
9，Shidara K,Suxuk T,et al.Lack of synergistic association betw een human papiloma carcinoma [J] .Laryngoscope,1994,104(8):1008-1012
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10，Pathcke IO,Gottschlich SS,et al.Incidence of point mutations in ki -ras cod en 12 and 132 in squamous epithelial carcinoma of the head-neck region [J] .L aryngorhinologic,1996,75(8):465-470
11，Zhang L,et al.p53 mutatio n in larynx cancer [J] .Carcinogenesis,1994,15(12):294
12，Baker SJ,Fear an ER,Nigro JM,et al.Chromosome 17 deletion and p53 gene mutations in colotectel carcinomas[J].Science,1989,244(4):217
收稿日期：2000-02-06, 百拇医药