HIV-1感染无进展与进展者HIV DNA存在状态的研究
作者：徐小元 陈力 王勤环 斯崇文 Jean-Claude Chermann
单位：徐小元 陈力 王勤环 斯崇文(北京医科大学第一临床医学院感染疾病科 北京 100034)；Jean-Claude Chermann(法国INSERM U322)
关键词：HIV；DNA；基因；结构
中华实验和临床病毒学杂志000408 【摘要】 目的 研究人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染无进展与进展者HIV DNA存在状态的特点。方法 选用位于HIV-1 DNA链两端的LTR(U5)、LTR(R)等其他部位的不同引物，应用国际上新颖的长片段聚合酶链反应(LD-PCR)及逆转录PCR(RT-PCR)，普通PCR(Taq-PCR)、免疫转印、分子杂交等技术，对HIV-1感染者血清HIV RNA、外周血单个核细胞(PBMC) HIV DNA进行检测。结果 9.1 kb为全长HIV DNA基因片段，12例进展者全部存在全长HIV基因片段，其中，9例存在不完整缺损的HIV DNA；在18例无进展者中，5例既存在完整又存在不完整的HIV DNA，其余13例只存在不完整、缺损的HIV DNA。结论 完整和缺损HIV DNA与临床表现类型有密切关系。
, 百拇医药
Research of status of provirus HIV DNA in non-progressor and progressor of HIV-1 infected persons
XU Xiaoyuan,CHEN Li,WANG Qinhuan
(Department of Infectious Diseases,the First Clinic Hospital, Beijing Medical University, 100034 Beijing, China)
【Abstract】 Objective This study was designed to investigate the different status of provirus HIV DNA in non-progressor and progressor of HIV-1 infected persons.Methods HIV RNA, HIV DNA were detected with long-distance PCR (LD-PCR),reverse-transcription PCR (RT-PCR),Southern blot and molecular hybridization from plasma and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), using primers locating between long terminal repeats LTR(U5)-LTR(R) and so on. Results 9.1 kb band is full-length HIV DNA genome which was presentin all templates of 12 progressors. Deleted HIV DNA was observed in 9 of 12 progressors. Both the full-length and defective. provirus HIV DNA was detected in 5 of the 18 non-progressors. Defective HIV DNA was only detected in the other non-progressors. Conclusion Clinical stages are closely related with both the full-length and the defective HIV DNA.
, 百拇医药
【Key words】 HIV; DNA; Genome stractural
HIV是一种变异非常活跃的病毒，这种变异既有可能增强病毒在宿主体内的适应性和生存，又有可能使病毒复制受到阻碍，影响病毒在宿主体内的生存，为了更进一步掌握HIV变异规律，阐明HIV致病机理，我们用逆转录PCR(RT-PCR)、长片段PCR(LD-PCR)、Southern转印、分子杂交等对HIV感染无进展者和进展者HIV RNA、CD4细胞、HIV DNA及存在状态进行了研究。
1 材料和方法
1.1 标本来源及细胞计数 30例HIV-1血清学阳性研究对象均为法国马赛市ST。MARQUETITE住院或随访对象，年龄22～69岁，女性13例，男性17例，最长生存者达14年，无进展者18例，进展者12例，3个月之内未进行抗病毒治疗。每3周抽取血液20 ml，分离外周血单个核细胞(PBMC)，PBMC分为两份，每份细胞数在5×106以上，一份-70℃保存备用，一份立即检测，每份标本均检测3次。用免疫流式细胞仪计数CD4细胞。
, 百拇医药
1.2 RT-PCR HIV RNA试剂盒由Branchburg公司供给。250 μl血清40 000 r/min超速离心，经异硫氰酸哌抽提，异丙醇纯化，酒精洗涤，抽提RNA，-4℃保存，先用加有RNA和标准对照容积为20 μl含有25 μmol/L MgCl2、NTPS各250 μmol/L、下行引物30 μmol/L gag04(表1)、逆向扩增酶MLVRT 1.75U，逆转录，变性分别为42℃ 17 min、99℃和4℃各5 min，逆转录PCR反应获得样本cDNA，然后加入80 μl含有上行引物30 μmol/L gag06、25 ml MgCl2、H2O/DEPC Taq酶变性94℃ 1 min，退火50℃ 2 min，延长72℃ 1 min，产物在4% Nusieve琼脂电泳，杂交，gag探针杂交，大于3 000拷贝/ml为阳性。
1.3 LD-PCR 50 μl容积中含有50 ml Tris-HCl(pH9.2)，14 mmol/L(NH4)2 SO4，17.5 mmol/L MgCL2，NTPS各350 μmol/L，7.5 pmol/L引物LTR(U5)/LTR(R)(引物、探针序列与Bukrinsky等的HIV-LAT序列一致〔1〕，加酶1.75U(由Boehringer Mannheim公司提供)，人基因DNA载体100 ng，变性94℃ 15 s,退火55℃ 30 s，延长68℃ 8 min,共40个循环，每个循环不延长时间，最后为68℃ 7 min。
, 百拇医药
1.4 普通PCR 1.5U Taq酶，10 mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，50 mmol/L KCl,15 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100,0.2 mg/ml BSA,200 μmol/L A、T、C、G，25 pmol/L引物gagA1/gagA2,100 ng人基因DNA载体；变性94℃ 1 min,退火55℃1.5 min，延长72℃ 2 min,30个循环，最后为68℃ 8 min。PCR产物行水平电泳；1.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L NaOH变性；1.5 mol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,0.5 mol/L Tris(pH7.2)中和；Southern转印到聚酰胺纤维膜上，紫外光照射7 min；预杂交，杂交，32P标记杂交探针(表2)，探针gag DTRA、NDK-1、polA1、tatA2、nef、env、LTR(U3)等在HIV-1相应基因片段有杂交位点。
表1 PCR引物序列
, 百拇医药
Tab.1 Sequences of primers used in PCR 引物Primer
序列(5′-3′)
Sequence(5′-3′)
在HIV-LAI基因中的定位
Location in gene of HIV LAI
Gag06
GCTTTCAGCCCAGAAGTA
ATACCCATG
+ nt 821-848
Gag04
, 百拇医药
TTTGTTCCTGAAGGGTAC
TAGTAGTTCCTGCT
- nt 1043-1075
LTR(U5)
GTCTGTTGTGACTCTGGT
+ nt 112-131
LTR(R)
GAGGCTTAAGCAGTGGGT
TC
- nt 9185-9204
GagA1
, 百拇医药
GATTTAAACACCATGCTA
AACACAGTGG
+ nt 882-909
GagA2
TTTGGTCCCTGTCTTATG
TCCAAATGC
- nt 1117-1204
注：+ 示顺向，- 示逆向
note:+ as sense,- as antisense
2 结果
18例无进展者CD4细胞直接计数在422-1037之间，血清HIV RNA在103～105拷贝/ml，以103、104为主，PBMC中HIV DNA 拷贝在30左右，但有一例无进展者病毒拷贝较高，达120拷贝/ml，其CD4细胞为1 037，12例进展患者CD4细胞计数在2～392之间，血清HIV RNA拷贝均较高，以106、105为主，HIV DNA拷贝数无明显特征分布(表3)，这类病人均有不同的临床症状，如反复发烧，腹泻、皮疹、消瘦和咳嗽等。
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表2 32P标记的探针序列
Tab.2 Sequences of 32P-labeled probes 探针
Probe
序列(5′-3′)
Sequence(5′-3′)
在HIV-LAI基因中的定位
Location in gene of HIV LAI
GagDTRA
TTTGTTCCTGAAGGGT
ACTAGTAGTTCC
, 百拇医药
- nt 1047-1074
Pol
TGCCCACACTAATGAT
GTAAAACAATTA
+ nt 3208-3235
Tat
TTGGGTGTCGACATAG
CAGAATAGGCGT
+ nt 5361-5388
Nef
TTTCCAGGTCTCGAGA
, 百拇医药
TACTGCTCC
- nt 8420-8504
NDK-1
TTGCTGAAGCGCGCAC
GGCAA
+ nt 249-269
Env
ATCCTCAGGAGGGGAC
CCAGAAATT
+ nt 6906-6930
LTR(U3)
, 百拇医药
CTACAAGGGACTTTCC
GCTGG
+ nt 9022-9042
注同表1
See table 1
应用引物LTR(U5)/LTR(R)，LD-PCR扩增含有全长HIV-1 DNA片段的大肠杆菌质粒PNL4-3，经32P gag DTRA探针杂交，9.1 kb为全长产物(图1)，在12例进展者PBMC中全部存在9.1 kb全长HIV DNA片段，在9例标本中还同时存在2～6条从0.6～7 kb大小不完整的HIV DNA，经用nef,pol等7种不同基因探针重复杂交，9.1 kb全长条带在不同探针中位置可不同，主要是基因片段重复或重组的原因，而不完整的条带、杂交后位置可见明显变化，这主要是由于缺损的部位不同，或多片段缺损所致。在18例无进展患者中，5例标本既存在完整HIV DNA又存在不完整HIV DNA，其余13例标本只有不完整的HIV DNA。
, 百拇医药
在PBMC中完整和缺损HIV DNA的存在与CD4细胞计数无明显关系，但是，血清HIV RNA拷贝越高，PBMC中越易查到完整HIV DNA，血清HIV RNA拷贝越低则以缺损HIV DNA为主。PBMC中HIV DNA/gag拷贝的高低与HIV DNA存在状态无明显相互关系，经用统计学处理无显著差异，但从绝对数字看，HIV进展者HIV DNA拷贝数高于无进展者。在缺损的HIV DNA中经用gat、nef、pol、env等片段探针重复杂交，发现基因片段缺损存在一定的规律，缺失部位与靠近HIV-1基因中心部位，围绕tat基因对称分布，在大多数情况下，缺损序列是相互毗邻的，这种现象提示：多数缺失片段是由单一缺损因素引起，病毒在体内通过选择拷贝机理复制。见表3。
1 为完整HIV-1 DNA；2～6 为完整和缺损HIV-1 DNA；7～11 为缺损HIV DNA； 12 为PNL4-3，不完整条带杂交后位置可见明显变化
, 百拇医药
图1 同一纤维膜用七种不同探针杂交
Fig.1 Hybridization with seven different probes on a same membrane
1：Full-length HIV-1 DNA. 2-6:Both full-length and deleted HIV-1 DNA.7-11:Deleted HIV DNA.
12:PNL 4-3.Deleted bands moved clearly after it was rehybridized
表3 30例HIV感染者检测结果
Tab.3 Result of detecting 30 HIV-1 infected persons 编号No.
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年龄
Age
性别
Sex
诊断
Diagnosis
HIV RNA拷贝/ml
RNA copy/ml
CD4细胞计数
No. of CD4
PBMC中HIV
DNA copy/ml
, http://www.100md.com
(gag)
BPMC中全长
Full HIV
DNA
PBMC中缺损
Defective HIV
DNA
1
25
F
NP
103
790
, http://www.100md.com
<1
-
+
2
34
M
NP
103
815
60
-
+
3
, 百拇医药 43
M
NP
103
427
<1
-
+
4
45
F
NP
103
, http://www.100md.com
433
30
-
+
5
23
M
NP
103
449
3
-
+
, 百拇医药 6
32
F
NP
103
610
<1
-
+
7
43
F
NP
103
, http://www.100md.com
422
20
-
+
8
31
M
NP
103
510
21
-
+
, 百拇医药 9
27
F
NP
104
470
11
-
+
10
41
M
NP
104
, http://www.100md.com
1037
120
-
+
11
49
M
NP
104
572
30
-
+
, 百拇医药
12
29
F
NP
104
671
<1
-
+
13
24
F
NP
, 百拇医药 106
496
50
-
+
14
30
M
NP
104
503
1
+
, 百拇医药
+
15
37
F
NP
105
557
20
+
+
16
37
M
, http://www.100md.com NP
105
620
20
+
+
17
26
M
NP
105
492
15
, http://www.100md.com
+
+
18
36
M
NP
106
465
21
+
+
19
54
, 百拇医药 M
P
106
354
17
+
+
20
66
M
P
106
245
, http://www.100md.com
50
+
+
21
31
F
P
106
2
50
+
+
22
30
, 百拇医药
F
P
105
166
32
+
+
23
37
M
P
105
326
, http://www.100md.com
63
+
+
24
25
M
P
105
392
<1
+
+
25
, 百拇医药 38
F
P
105
302
300
+
+
26
33
M
P
104
, 百拇医药
70
3
+
+
27
22
F
P
104
304
10
+
+
, 百拇医药 28
49
M
P
104
127
20
+
-
29
69
M
P
103
, 百拇医药
288
<1
+
-
30
36
F
P
106
179
57
+
-
, 百拇医药 NP：无进展者；P：进展者
NP:Non-progressor. P:Progressor
3 讨论
对HIV-1感染无进展与进展者的研究，以往主要集中在HIV DNA、HIV RNA含量和CD4细胞计数方面。而体内HIV DNA、HIV RNA及CD4细胞水平高低与HIV感染方式，病毒变异、体内抗体、细胞毒T细胞反应性密切相关〔2-4〕。一般认为长期无症状的HIV感染者，PBMC中HIV DNA和血浆HIV RNA的量比较稳定，如含量逐渐增高提示疾病快速进展和恶化。本试验发现HIV-1感染进展者血清HIV RNA含量较高，PBMC中HIV DNA主要以完整HIV DNA形式存在，同时可见不完整的HIV DNA条带，而在HIV感染无进展者中，血清HIV RNA含量相对较低，PBMC中HIV DNA主要以缺损的形式存在，缺损的部位以tat区最常见，tat基因具有正向调节的作用，tat区的缺损使病毒处于低复制或静止状态。基因缺损很可能是激活的PBMC和机体的免疫功能对病毒有较强的毒性作用，翻译过早终止，聚合酶按不成熟的线状链移到其他位点重新翻译，也可能是HIV DNA以低整合方式整合到宿主基因中〔5〕，当免疫功能下降时，缺损病毒基因依靠他们的互补关系重新组合而恢复正常。
, 百拇医药
基因片段缺损是病毒变异的一种方式，HIV的一个最显著特点是它的变异性，包括基因水平上和表达蛋白质的氨基酸序列上的变异，进而引起病毒某些生物学性状的改变和致病力的改变，机体的免疫功能不能清除无表达功能的缺损了某些基因片段的HIV和含有这些缺损病毒的细胞。有研究表明〔6〕HIV感染后长期无进展者的免疫功能始终保持正常，病毒为了逃避机体的免疫功能杀伤，不断进行基因变异，包括基因片段重组，缺失、重复和倒置。HIV是一种RNA逆转录病毒，其基因组由RNA向DNA反向转录，再由DNA向RNA正向转录的过程均是由病毒本身逆转录酶所催化，该酶无核酸外切酶活性，不能把错配的核苷酸从已生成的核苷酸链上切除，也不能修补为逃避免疫攻击适合生存环境而缺损部分片段的核苷酸链；同时，也不排除HIV感染量少，病毒潜伏或整合在一些敏感细胞内，如PBMC、NK细胞、神经细胞内，暂时不被激活而逃逸了机体免疫监视。本研究中，HIV感染进展者血清HIV RNA含量较高，大部分均在105～106拷贝/ml水平，CD4细胞较低，而无进展者则相反，其HIV DNA均存在不同程度的缺损。宿主CD4分子，融合素分子和CCCKR-5等分子是HIV侵入免疫细胞的门户〔7〕，它们的变异频率较低，当HIV、env、pol、gag等基因片段缺损变异时，引起HIV包膜蛋白和gp120等序列发生变异或缺失，病毒与细胞CD4分子或辅助分子的结合受到影响，病毒的感染力下降，复制受阻，减弱对宿主免疫细胞的破环，使免疫细胞发挥正常功能，体内处于动态平衡状态。
, 百拇医药
宿主遗传素质、免疫功能、HIV生物学特性及变异性是决定HIV感染者是否易于发展为艾滋病的重要因素，四种因素相互联系，相互影响，其中HIV变异性和宿主免疫功能之间的关系最为复杂，HIV基因变异是由其本身的生物学特性所决定的，但是，这种变异性又受到宿主免疫反应和药物的影响。HIV感染者体内大量不完整病毒基因的存在，为今后研究提出了一些问题，即缺损基因在HIV感染过程中的动态变化及作用，它对抗病毒药治疗的影响及与其它耐药毒株的关系，对HIV疫苗研究的影响等，这是一个很值得探讨的问题。
参 考 文 献
1，Bukringsky MI,Sharova N,McDonald TL,et al.Association of integrase,matrix, and reverse transcriptase antigens of human immunodeficiency virus type Ⅰ with viral nulceic acids following acute infection. Porc Natl Acad Sci USA,1993,90：6125-6129.
, 百拇医药
2，Sanchez G,Xu XY,Chermann JC,et al.Accumulation of defective viral genomes in peripheral blood mononuclear of human immunodeficiency virus type Ⅰ infected individuals. J Virol, 1997,71：2233-2240.
3，Sanchez G,Gautheret D,Xu X,et al.Relative amplification efficiency of differently sized templates by long-distance PCR.Biotechniques,1998,24：400-402.
4，Peckham C,GIbb D.Mother to child transmission of the human immunodeficiency virus. N Engl J Med,1995,333：298-302.
, 百拇医药
5，Daar ES,Chernyavskiy T,Zhao JQ,et al.Sequential determination of viral load and phenotype in human immunodeficency virus type 1 infection. AIDS Res Hum Retroviruses,1995,11：3-9.
6，Cao Y,Qin L,Zhang L,et al.Virologic and immunologic characterization of long-term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection. N Engl J Med,1995 332：201-208.
7，Coffin JM.HIV population dynamics in vivo:implications for genetic variation,pathogenesis,and therapy.Science,1995,267：483-489.
(收稿日期：1999-12-22)
, 百拇医药
单位：徐小元 陈力 王勤环 斯崇文(北京医科大学第一临床医学院感染疾病科 北京 100034)；Jean-Claude Chermann(法国INSERM U322)
关键词：HIV；DNA；基因；结构
中华实验和临床病毒学杂志000408 【摘要】 目的 研究人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染无进展与进展者HIV DNA存在状态的特点。方法 选用位于HIV-1 DNA链两端的LTR(U5)、LTR(R)等其他部位的不同引物，应用国际上新颖的长片段聚合酶链反应(LD-PCR)及逆转录PCR(RT-PCR)，普通PCR(Taq-PCR)、免疫转印、分子杂交等技术，对HIV-1感染者血清HIV RNA、外周血单个核细胞(PBMC) HIV DNA进行检测。结果 9.1 kb为全长HIV DNA基因片段，12例进展者全部存在全长HIV基因片段，其中，9例存在不完整缺损的HIV DNA；在18例无进展者中，5例既存在完整又存在不完整的HIV DNA，其余13例只存在不完整、缺损的HIV DNA。结论 完整和缺损HIV DNA与临床表现类型有密切关系。
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Research of status of provirus HIV DNA in non-progressor and progressor of HIV-1 infected persons
XU Xiaoyuan,CHEN Li,WANG Qinhuan
(Department of Infectious Diseases,the First Clinic Hospital, Beijing Medical University, 100034 Beijing, China)
【Abstract】 Objective This study was designed to investigate the different status of provirus HIV DNA in non-progressor and progressor of HIV-1 infected persons.Methods HIV RNA, HIV DNA were detected with long-distance PCR (LD-PCR),reverse-transcription PCR (RT-PCR),Southern blot and molecular hybridization from plasma and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), using primers locating between long terminal repeats LTR(U5)-LTR(R) and so on. Results 9.1 kb band is full-length HIV DNA genome which was presentin all templates of 12 progressors. Deleted HIV DNA was observed in 9 of 12 progressors. Both the full-length and defective. provirus HIV DNA was detected in 5 of the 18 non-progressors. Defective HIV DNA was only detected in the other non-progressors. Conclusion Clinical stages are closely related with both the full-length and the defective HIV DNA.
, 百拇医药
【Key words】 HIV; DNA; Genome stractural
HIV是一种变异非常活跃的病毒，这种变异既有可能增强病毒在宿主体内的适应性和生存，又有可能使病毒复制受到阻碍，影响病毒在宿主体内的生存，为了更进一步掌握HIV变异规律，阐明HIV致病机理，我们用逆转录PCR(RT-PCR)、长片段PCR(LD-PCR)、Southern转印、分子杂交等对HIV感染无进展者和进展者HIV RNA、CD4细胞、HIV DNA及存在状态进行了研究。
1 材料和方法
1.1 标本来源及细胞计数 30例HIV-1血清学阳性研究对象均为法国马赛市ST。MARQUETITE住院或随访对象，年龄22～69岁，女性13例，男性17例，最长生存者达14年，无进展者18例，进展者12例，3个月之内未进行抗病毒治疗。每3周抽取血液20 ml，分离外周血单个核细胞(PBMC)，PBMC分为两份，每份细胞数在5×106以上，一份-70℃保存备用，一份立即检测，每份标本均检测3次。用免疫流式细胞仪计数CD4细胞。
, 百拇医药
1.2 RT-PCR HIV RNA试剂盒由Branchburg公司供给。250 μl血清40 000 r/min超速离心，经异硫氰酸哌抽提，异丙醇纯化，酒精洗涤，抽提RNA，-4℃保存，先用加有RNA和标准对照容积为20 μl含有25 μmol/L MgCl2、NTPS各250 μmol/L、下行引物30 μmol/L gag04(表1)、逆向扩增酶MLVRT 1.75U，逆转录，变性分别为42℃ 17 min、99℃和4℃各5 min，逆转录PCR反应获得样本cDNA，然后加入80 μl含有上行引物30 μmol/L gag06、25 ml MgCl2、H2O/DEPC Taq酶变性94℃ 1 min，退火50℃ 2 min，延长72℃ 1 min，产物在4% Nusieve琼脂电泳，杂交，gag探针杂交，大于3 000拷贝/ml为阳性。
1.3 LD-PCR 50 μl容积中含有50 ml Tris-HCl(pH9.2)，14 mmol/L(NH4)2 SO4，17.5 mmol/L MgCL2，NTPS各350 μmol/L，7.5 pmol/L引物LTR(U5)/LTR(R)(引物、探针序列与Bukrinsky等的HIV-LAT序列一致〔1〕，加酶1.75U(由Boehringer Mannheim公司提供)，人基因DNA载体100 ng，变性94℃ 15 s,退火55℃ 30 s，延长68℃ 8 min,共40个循环，每个循环不延长时间，最后为68℃ 7 min。
, 百拇医药
1.4 普通PCR 1.5U Taq酶，10 mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，50 mmol/L KCl,15 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100,0.2 mg/ml BSA,200 μmol/L A、T、C、G，25 pmol/L引物gagA1/gagA2,100 ng人基因DNA载体；变性94℃ 1 min,退火55℃1.5 min，延长72℃ 2 min,30个循环，最后为68℃ 8 min。PCR产物行水平电泳；1.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L NaOH变性；1.5 mol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,0.5 mol/L Tris(pH7.2)中和；Southern转印到聚酰胺纤维膜上，紫外光照射7 min；预杂交，杂交，32P标记杂交探针(表2)，探针gag DTRA、NDK-1、polA1、tatA2、nef、env、LTR(U3)等在HIV-1相应基因片段有杂交位点。
表1 PCR引物序列
, 百拇医药
Tab.1 Sequences of primers used in PCR 引物Primer
序列(5′-3′)
Sequence(5′-3′)
在HIV-LAI基因中的定位
Location in gene of HIV LAI
Gag06
GCTTTCAGCCCAGAAGTA
ATACCCATG
+ nt 821-848
Gag04
, 百拇医药
TTTGTTCCTGAAGGGTAC
TAGTAGTTCCTGCT
- nt 1043-1075
LTR(U5)
GTCTGTTGTGACTCTGGT
+ nt 112-131
LTR(R)
GAGGCTTAAGCAGTGGGT
TC
- nt 9185-9204
GagA1
, 百拇医药
GATTTAAACACCATGCTA
AACACAGTGG
+ nt 882-909
GagA2
TTTGGTCCCTGTCTTATG
TCCAAATGC
- nt 1117-1204
注：+ 示顺向，- 示逆向
note:+ as sense,- as antisense
2 结果
18例无进展者CD4细胞直接计数在422-1037之间，血清HIV RNA在103～105拷贝/ml，以103、104为主，PBMC中HIV DNA 拷贝在30左右，但有一例无进展者病毒拷贝较高，达120拷贝/ml，其CD4细胞为1 037，12例进展患者CD4细胞计数在2～392之间，血清HIV RNA拷贝均较高，以106、105为主，HIV DNA拷贝数无明显特征分布(表3)，这类病人均有不同的临床症状，如反复发烧，腹泻、皮疹、消瘦和咳嗽等。
, http://www.100md.com
表2 32P标记的探针序列
Tab.2 Sequences of 32P-labeled probes 探针
Probe
序列(5′-3′)
Sequence(5′-3′)
在HIV-LAI基因中的定位
Location in gene of HIV LAI
GagDTRA
TTTGTTCCTGAAGGGT
ACTAGTAGTTCC
, 百拇医药
- nt 1047-1074
Pol
TGCCCACACTAATGAT
GTAAAACAATTA
+ nt 3208-3235
Tat
TTGGGTGTCGACATAG
CAGAATAGGCGT
+ nt 5361-5388
Nef
TTTCCAGGTCTCGAGA
, 百拇医药
TACTGCTCC
- nt 8420-8504
NDK-1
TTGCTGAAGCGCGCAC
GGCAA
+ nt 249-269
Env
ATCCTCAGGAGGGGAC
CCAGAAATT
+ nt 6906-6930
LTR(U3)
, 百拇医药
CTACAAGGGACTTTCC
GCTGG
+ nt 9022-9042
注同表1
See table 1
应用引物LTR(U5)/LTR(R)，LD-PCR扩增含有全长HIV-1 DNA片段的大肠杆菌质粒PNL4-3，经32P gag DTRA探针杂交，9.1 kb为全长产物(图1)，在12例进展者PBMC中全部存在9.1 kb全长HIV DNA片段，在9例标本中还同时存在2～6条从0.6～7 kb大小不完整的HIV DNA，经用nef,pol等7种不同基因探针重复杂交，9.1 kb全长条带在不同探针中位置可不同，主要是基因片段重复或重组的原因，而不完整的条带、杂交后位置可见明显变化，这主要是由于缺损的部位不同，或多片段缺损所致。在18例无进展患者中，5例标本既存在完整HIV DNA又存在不完整HIV DNA，其余13例标本只有不完整的HIV DNA。
, 百拇医药
在PBMC中完整和缺损HIV DNA的存在与CD4细胞计数无明显关系，但是，血清HIV RNA拷贝越高，PBMC中越易查到完整HIV DNA，血清HIV RNA拷贝越低则以缺损HIV DNA为主。PBMC中HIV DNA/gag拷贝的高低与HIV DNA存在状态无明显相互关系，经用统计学处理无显著差异，但从绝对数字看，HIV进展者HIV DNA拷贝数高于无进展者。在缺损的HIV DNA中经用gat、nef、pol、env等片段探针重复杂交，发现基因片段缺损存在一定的规律，缺失部位与靠近HIV-1基因中心部位，围绕tat基因对称分布，在大多数情况下，缺损序列是相互毗邻的，这种现象提示：多数缺失片段是由单一缺损因素引起，病毒在体内通过选择拷贝机理复制。见表3。
1 为完整HIV-1 DNA；2～6 为完整和缺损HIV-1 DNA；7～11 为缺损HIV DNA； 12 为PNL4-3，不完整条带杂交后位置可见明显变化
, 百拇医药
图1 同一纤维膜用七种不同探针杂交
Fig.1 Hybridization with seven different probes on a same membrane
1：Full-length HIV-1 DNA. 2-6:Both full-length and deleted HIV-1 DNA.7-11:Deleted HIV DNA.
12:PNL 4-3.Deleted bands moved clearly after it was rehybridized
表3 30例HIV感染者检测结果
Tab.3 Result of detecting 30 HIV-1 infected persons 编号No.
, http://www.100md.com
年龄
Age
性别
Sex
诊断
Diagnosis
HIV RNA拷贝/ml
RNA copy/ml
CD4细胞计数
No. of CD4
PBMC中HIV
DNA copy/ml
, http://www.100md.com
(gag)
BPMC中全长
Full HIV
DNA
PBMC中缺损
Defective HIV
DNA
1
25
F
NP
103
790
, http://www.100md.com
<1
-
+
2
34
M
NP
103
815
60
-
+
3
, 百拇医药 43
M
NP
103
427
<1
-
+
4
45
F
NP
103
, http://www.100md.com
433
30
-
+
5
23
M
NP
103
449
3
-
+
, 百拇医药 6
32
F
NP
103
610
<1
-
+
7
43
F
NP
103
, http://www.100md.com
422
20
-
+
8
31
M
NP
103
510
21
-
+
, 百拇医药 9
27
F
NP
104
470
11
-
+
10
41
M
NP
104
, http://www.100md.com
1037
120
-
+
11
49
M
NP
104
572
30
-
+
, 百拇医药
12
29
F
NP
104
671
<1
-
+
13
24
F
NP
, 百拇医药 106
496
50
-
+
14
30
M
NP
104
503
1
+
, 百拇医药
+
15
37
F
NP
105
557
20
+
+
16
37
M
, http://www.100md.com NP
105
620
20
+
+
17
26
M
NP
105
492
15
, http://www.100md.com
+
+
18
36
M
NP
106
465
21
+
+
19
54
, 百拇医药 M
P
106
354
17
+
+
20
66
M
P
106
245
, http://www.100md.com
50
+
+
21
31
F
P
106
2
50
+
+
22
30
, 百拇医药
F
P
105
166
32
+
+
23
37
M
P
105
326
, http://www.100md.com
63
+
+
24
25
M
P
105
392
<1
+
+
25
, 百拇医药 38
F
P
105
302
300
+
+
26
33
M
P
104
, 百拇医药
70
3
+
+
27
22
F
P
104
304
10
+
+
, 百拇医药 28
49
M
P
104
127
20
+
-
29
69
M
P
103
, 百拇医药
288
<1
+
-
30
36
F
P
106
179
57
+
-
, 百拇医药 NP：无进展者；P：进展者
NP:Non-progressor. P:Progressor
3 讨论
对HIV-1感染无进展与进展者的研究，以往主要集中在HIV DNA、HIV RNA含量和CD4细胞计数方面。而体内HIV DNA、HIV RNA及CD4细胞水平高低与HIV感染方式，病毒变异、体内抗体、细胞毒T细胞反应性密切相关〔2-4〕。一般认为长期无症状的HIV感染者，PBMC中HIV DNA和血浆HIV RNA的量比较稳定，如含量逐渐增高提示疾病快速进展和恶化。本试验发现HIV-1感染进展者血清HIV RNA含量较高，PBMC中HIV DNA主要以完整HIV DNA形式存在，同时可见不完整的HIV DNA条带，而在HIV感染无进展者中，血清HIV RNA含量相对较低，PBMC中HIV DNA主要以缺损的形式存在，缺损的部位以tat区最常见，tat基因具有正向调节的作用，tat区的缺损使病毒处于低复制或静止状态。基因缺损很可能是激活的PBMC和机体的免疫功能对病毒有较强的毒性作用，翻译过早终止，聚合酶按不成熟的线状链移到其他位点重新翻译，也可能是HIV DNA以低整合方式整合到宿主基因中〔5〕，当免疫功能下降时，缺损病毒基因依靠他们的互补关系重新组合而恢复正常。
, 百拇医药
基因片段缺损是病毒变异的一种方式，HIV的一个最显著特点是它的变异性，包括基因水平上和表达蛋白质的氨基酸序列上的变异，进而引起病毒某些生物学性状的改变和致病力的改变，机体的免疫功能不能清除无表达功能的缺损了某些基因片段的HIV和含有这些缺损病毒的细胞。有研究表明〔6〕HIV感染后长期无进展者的免疫功能始终保持正常，病毒为了逃避机体的免疫功能杀伤，不断进行基因变异，包括基因片段重组，缺失、重复和倒置。HIV是一种RNA逆转录病毒，其基因组由RNA向DNA反向转录，再由DNA向RNA正向转录的过程均是由病毒本身逆转录酶所催化，该酶无核酸外切酶活性，不能把错配的核苷酸从已生成的核苷酸链上切除，也不能修补为逃避免疫攻击适合生存环境而缺损部分片段的核苷酸链；同时，也不排除HIV感染量少，病毒潜伏或整合在一些敏感细胞内，如PBMC、NK细胞、神经细胞内，暂时不被激活而逃逸了机体免疫监视。本研究中，HIV感染进展者血清HIV RNA含量较高，大部分均在105～106拷贝/ml水平，CD4细胞较低，而无进展者则相反，其HIV DNA均存在不同程度的缺损。宿主CD4分子，融合素分子和CCCKR-5等分子是HIV侵入免疫细胞的门户〔7〕，它们的变异频率较低，当HIV、env、pol、gag等基因片段缺损变异时，引起HIV包膜蛋白和gp120等序列发生变异或缺失，病毒与细胞CD4分子或辅助分子的结合受到影响，病毒的感染力下降，复制受阻，减弱对宿主免疫细胞的破环，使免疫细胞发挥正常功能，体内处于动态平衡状态。
, 百拇医药
宿主遗传素质、免疫功能、HIV生物学特性及变异性是决定HIV感染者是否易于发展为艾滋病的重要因素，四种因素相互联系，相互影响，其中HIV变异性和宿主免疫功能之间的关系最为复杂，HIV基因变异是由其本身的生物学特性所决定的，但是，这种变异性又受到宿主免疫反应和药物的影响。HIV感染者体内大量不完整病毒基因的存在，为今后研究提出了一些问题，即缺损基因在HIV感染过程中的动态变化及作用，它对抗病毒药治疗的影响及与其它耐药毒株的关系，对HIV疫苗研究的影响等，这是一个很值得探讨的问题。
参 考 文 献
1，Bukringsky MI,Sharova N,McDonald TL,et al.Association of integrase,matrix, and reverse transcriptase antigens of human immunodeficiency virus type Ⅰ with viral nulceic acids following acute infection. Porc Natl Acad Sci USA,1993,90：6125-6129.
, 百拇医药
2，Sanchez G,Xu XY,Chermann JC,et al.Accumulation of defective viral genomes in peripheral blood mononuclear of human immunodeficiency virus type Ⅰ infected individuals. J Virol, 1997,71：2233-2240.
3，Sanchez G,Gautheret D,Xu X,et al.Relative amplification efficiency of differently sized templates by long-distance PCR.Biotechniques,1998,24：400-402.
4，Peckham C,GIbb D.Mother to child transmission of the human immunodeficiency virus. N Engl J Med,1995,333：298-302.
, 百拇医药
5，Daar ES,Chernyavskiy T,Zhao JQ,et al.Sequential determination of viral load and phenotype in human immunodeficency virus type 1 infection. AIDS Res Hum Retroviruses,1995,11：3-9.
6，Cao Y,Qin L,Zhang L,et al.Virologic and immunologic characterization of long-term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection. N Engl J Med,1995 332：201-208.
7，Coffin JM.HIV population dynamics in vivo:implications for genetic variation,pathogenesis,and therapy.Science,1995,267：483-489.
(收稿日期：1999-12-22)
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