人血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和鉴定
作者：马骊 张智清 陈爱君 姚立红 姜忠良 王小宁
单位：马骊 王小宁(中国人民解放军第一军医大学分子免疫学重点实验室 广州 510515)；张智清 陈爱君 姚立红 姜忠良(中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室)
关键词：内皮生长因子；毕赤酵母；基因表达
中华实验和临床病毒学杂志000402 【摘要】 目的 研究人血管内皮生长因子(hVEGF165)基因在Pichia.pastoris酵母中的表达，获得高效表达的具有生物学活性的重组VEGF165。方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增hVEGF165基因，经DNA序列分析后，插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia.pastoris酵母载体中，构建重组表达质粒pPIC9K/hVEGF165，转化酵母宿主菌KM71，筛选多拷贝整合转化子，摇瓶培养，1%甲醇诱导表达。结果 SDS-PAGE分析显示，诱导4 d的培养上清中hVEGF165表达量达上清总蛋白的30%以上。ELISA及Western blot实验表明，表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有刺激HUVEC增殖的功能。结论 在Pichia.pastoris表达系统中实现了hVEGF165的高效分泌性表达。
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Expression and characterization of human vascular endothelial growth factor in Pichia.pastoris
MA Li, ZHANG Zhiqing, CHEN Aijun
(Institute of Molecular Immunology,First Military Medical University,Guangzhou 510515, China)
【Abstract】 Objective To study the expression of human VEGF165 cDNA in Pichia.pastoris and to obtain high-level expression of recombinant human VEGF165 (hVEGF165) with good biological activity. Methods Amplifying hVEGF165 cDNA by PCR,after confirmed by DNA sequence analysis,the gene was inserted into the Pichia.pastoris expression vector pPIC9K containing AOX1 promoter and α secreting signal peptides, the recombinant expression plasmid pPIC9K/VEGF165 was constructed and transformed into KM71. The multiple insert transformants were screened, fermented in flasks and induced by 1% methanol. Results After 4 days of methanol induction, the expressed hVEGF165 came up to 30% of total proteins in supernatant by SDS-PAGE. The expressed hVEGF165 was further proved having good antigenicity and high specificity by ELISA and Western blot assay, and having good biological activity to stimulate HUVEC proliferation. Conclusion High-level expression of secreted hVEGF165 had been successfully achieved in Pichia.pastoris expression system.
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【Key words】 Vascular endothelial growth factors; Pichia.pastoris; Gene expression
人血管内皮生长因子hVEGF165是由165个氨基酸组成的糖蛋白，其分子内有3对二硫键和1个糖基化位点，二硫键对维持其三级结构起重要作用，而糖基化仅与分泌功能有关〔1〕。作为一种高特异性促血管内皮细胞生长因子，VEGF在心血管领域已被用于冠心病防治的实验研究，发现它可促进小冠状血管侧枝循环的建立，恢复心肌血流供应，减少梗塞面积，促进缺血心肌的功能恢复，而且对实验性动脉成形术后再狭窄也具有很好的防治作用，因此，研究开发重组VEGF对于缺血性心脏病及其他
组织缺血性疾病的防治具有重大的应用价值。
VEGF由于天然来源非常有限，产量甚微，远不能满足临床应用的需要，因此利用DNA重组技术大量生产VEGF势在必行。我们在大肠埃希菌中高效表达了hVEGF165，但其以不溶解无活性的包涵体形式存在，其纯化和复性困难。在哺乳动物细胞中表达了hVEGF165，但表达量很低。甲基营养型酵母作为一种新型外源基因表达系统，兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工的双重特点，是外源基因表达的理想宿主〔2〕。我们利用PCR技术，扩增出495 bp的hVEGF165基因片段，并克隆于Pichia.pastoris酵母表达载体pPIC9K，实现了其高效分泌性表达。
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1 材料和方法
1.1 质粒、菌株和细胞株 hVEGF165*SR真核表达质粒由美国波士顿医学中心吴天根博士惠赠。酵母表达载体pPIC9K及宿主菌KM71购自Invitrogen公司。大肠埃希菌DH5α与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)株由本室保存。
1.2 酶和主要试剂 pGEM-T载体、限制性内切酶、T4连接酶及Taq DNA聚合酶购自Promega公司。酵母培养基Pepton、YNB(W/O)为Difco公司产品。hVEGF165单抗为本室以原核表达纯化的hVEGF165为抗原免疫小鼠制备的。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自晶美生物工程公司。
1.3 目的基因片段的扩增 引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物：5′-TAGAATTCGC
ACCCATGGCAGAAGGAGG-3′引入EcoR Ⅰ位点，下游引物：5′-TAGCGGCCGCTATCACCGCCTCGG
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CTTGTC-3′,引入Not Ⅰ位点。以hVEGF165*SR真核表达质粒为模板，PCR扩增条件为94℃ 45 s，68℃ 45 s，72℃ 60 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。
1.4 重组质粒的构建 将PCR产物插入pGEM-T载体，转化宿主菌DH5α，提取质粒，DNA测序正确后，以EcoR Ⅰ及Not Ⅰ双酶切，回收495 bp片段，插入pPIC9K的相同位点，连接产物转化宿主菌DH5α，提取质粒，酶切鉴定。
1.5 表达质粒转化酵母宿主菌 按文献〔3〕方法将酵母菌KM71制备成感受态，取出80 μl与5～10 μg Sac Ⅰ线性化的重组表达质粒混合，转入0.2 cm电转杯，冰浴5 min，于Bio-Rad Gene Pulser电转仪1 500 V，25 μF，200 条件下电转化，立即加入1 ml冰浴山梨醇，将菌液涂布于MD/-His(1.34%YNB，4×10-5%Biotin,2%Dextrose，1.5%Agar)选择平板上，30℃孵育2～3 d，观察转化子的生长。
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1.6 多拷贝整合转化子的筛选 将His+转化子分别对应地点在逐步增高G418浓度(0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0 mg/ml)的YPD平板上，30℃孵育2～3 d，筛选高G418抗性且生长良好的菌株作为表达株。
1.7 转化子的PCR检测 接种单菌落于10 μl无菌水中，加入5 μl Lyticase(5 U/μl),30℃培养10 min后，将菌液置于液氮中1 min，室温下解冻后用作模板，以α-Factor和3′AOX1引物作PCR检测，扩增条件为：95℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
1.8 表达菌株的诱导表达 接种单菌落于100 ml BMGY培养基(1% Yeast extract,2% Pepton,100% mmol/L Potassium phosphate,pH 6.0,1.34%YNB,4×10-5% Biotin,1% Glycerol)于30℃培养至吸光度A值(600 nm)≈4.0，离心收集菌体，用20 ml BMMY培养基(1% Yeast extract,2% Pepton,100 mmol/L Potassium phosphate,pH6.0，1.34%YNB,4×10-5% Biotin,1% Methanol)重悬培养，每日取样1 ml，并补加100%甲醇于培养基至浓度为1%，诱导表达6 d，样品离心收集上清，-20℃保存。
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1.9 表达产物的免疫学鉴定 Western blot方法参见文献〔4〕。
1.10 生物活性测定 采用HUVEC细胞株MTT测定法。将HUVEC用无血清1640培养基洗3次，用含5%血清的1640培养基调整细胞数为4×104/ml。将rhVEGF165表达上清用无血清1640培养基稀释至浓度为100 μg/ml，并在96孔板上倍比稀释，每孔留50 μl，加入HUVEC 100 μl，于37℃、5%CO2条件下培养36 h，每孔加MTT 20 μl，培养5 h后，加入20%SDS 80 μl裂解细胞，1 h后用酶标仪读取A(570 nm)值，绘制曲线，与对照组曲线比较，观察rhVEGF165的生物学活性。
2 结果
2.1 重组表达质粒的构建和鉴定 重组质粒的构建如图1，PCR扩增的hVEGF165基因片段长度为495 bp，与预计的大小相符，插入pGEM-T载体，转化宿主菌DH5α，提取质粒，DNA序列分析证实与国外文献报道一致。重组质粒pPIC9K/hVEGF165经EcoR Ⅰ+Not Ⅰ双酶切鉴定，得到相应片段。
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2.2 重组蛋白的表达 对G418抗性不同的His+转化子进行表达筛选时发现，多拷贝转化子外源基因表达量明显高于单拷贝转化子，基因拷贝数增加，表达量也随之增加，从占上清的10%增加到30%。提取菌体DNA，用α-Factor和3′AOX1引物作PCR检测，得到812 bp大小的特异片段，表明转化子基因组中确实整合有hVEGF165基因。SDS-PAGE分析甲醇诱导时间对表达量的影响发现，甲醇诱导第1 d，即有表达产物出现，但表达量较低，随着表达时间的延长，表达量也逐步增高，到第4 d达到高峰，经双波长薄层扫描，表达量最高可达上清总蛋白的30%以上。非还原条件下，表达的hVEGF165完全以有活性的同源二聚体形式存在，大小约为48 000；还原条件下，表达的hVEGF165以单体形式存在，大小约为24 000(图2)。
图1 重组质粒pPIC9K/VEGF165的构建
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Fig.1 Construction of recombinant plasmid pPIC9K/VEGF165
1：KM71/pPIC9K/hVEGF165表达上清(非还原型)；2：KM71/pPIC9K/hVEGF165表达上清；3：KM71/pPIC9K/hVEGF165诱导前上清对照；4:KM71/pPIC9K诱导上清对照；5:蛋白质分子量标准
图2 重组蛋白的SDS-PAGE分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein
1：Expressed supernatant of KM71/pPIC9K/hVEGF165(non-reduced).2:Expressed supernatant of KM71/pPIC9K/hVEGF165.3:Non-induced supernatant of KM71/pPIC9K/hVEGF165 as control.4:Induced supernatant of KM71/pPIC9K as control.5:Standard molecular weight marker
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2.3 表达产物的免疫学鉴定 Western blot结果显示，非还原型hVEGF165表达上清在相对分子质量48 000处有一特异性条带；还原型hVEGF165表达上清在相对分子质量24 000处有一特异性条带，而空载体转化菌诱导上清对照未见特异性条带(图3)，证实表达产物具有hVEGF165抗原性。
图3 重组蛋白的Western blot分析
Fig.3 Western blot analysis of recombinant protein
1：Expressed supernatant of KM71/pPIC9K/hVEGF165(non-reduced).2:Expressed supernatant of KM71/pPIC9K/hVEGF165.3:Induced supernatant of KM71/pPIC9K as control
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2.4 生物学活性测定 VEGF的主要生物学活性是刺激血管内皮细胞生长，我们用MTT法在HUVEC细胞株上测定其生物学活性，结果表明,hVEGF165表达上清可呈剂量依赖性地刺激HUVEC的增殖，表达上清稀释210倍至100 ng/ml时仍能刺激HUVEC的增殖，而空载体转化菌诱导上清对照无刺激HUVEC增殖的能力，表明表达的rhVEGF165具有天然VEGF的生物学活性(图4)。
3 讨论
Pichia.pastoris基因表达系统是一种新型外源基因表达系统，兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工，发酵条件简单，表达水平高，适宜高密度培养，并且具有分泌型表达优势，为工业化生产和纯化提供极大的方便。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg〔5〕、TNF〔6〕、EGF〔7〕、破伤风毒素C片段〔8〕、人血清白蛋白〔9〕等多种外源基因。
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外源基因的拷贝数是影响其表达量的一个重要因素。一般来讲，整合的拷贝数越多，表达量越高，但不是绝对的，有时单拷贝和多拷贝对表达量没有影响，甚至多拷贝引起表达量下降〔10〕。我们对大量的不同G418抗性转化子作表达筛选时发现，VEGF165基因多拷贝转化子表达量明显高于单拷贝转化子，随基因拷贝数增加，表达量也随之增加，从占菌体的10%增加到30%。
图4 rhVEGF165生物活性测定结果
Fig.4 Biological activity assay of rhVEGF165
—— ◆ rhVEGF165.…… ■ Induced supernatant of KM71/pPIC9K as control
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表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合〔11〕两种方式。单交换整合时或插入AOX1位点，或插入His4位点。有文献报道以His4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，使lacZ表达盒偶尔丢失，故AOX1位点更好〔12〕。我们采用SacⅠ单酶切使表达载体线性化，转化宿主菌KM71，单交换整合入染色体的AOX1位点，筛选出的表达菌株性质稳定，适合高密度发酵培养。
表达的蛋白在α因子信号肽引导下分泌到培养基中，这样，不仅避免了产物被细胞内蛋白酶降解和因产物在细胞内堆积所造成的毒性作用而影响细胞代谢，而且大大简化了产物的分离纯化过程，为工业化大规模生产提供了便利条件。
我们成功地利用酵母表达载体Pichia.pastoris高效表达了可溶性人血管内皮生长因子hVEGF165，并证实其具有刺激HUVEC增殖的功能，这对开发其在缺血性心脏病及肢体继发性动脉闭塞等疾病的防治应用奠定了基础。
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参 考 文 献
1，Klagsbrun M,Patricia AD.Vascular endothelial growth factor and its receptors.Cytokine & Growth Factor Reviews,1996,7：259-270.
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4，Sambrook J, Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Lab Press,1989,1.21-6.32.
5，Cregg JM,Tschopp JF,Stillman C,et al.High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast Pichia Pastoris. Bio Technol,1987,5：479-485.
6，Sreekrishma K,Nelles L,Potenz R,et al.High-level expression,purification, and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized in the methylotrophic yeast Pichia Pastoris.Biochemistry,1989,28：4117-4125.
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7，Siegel RS,Buckholz RG,Thill GP,et al. Production of epidermal growth factor in methylotrophic yeast cells.International Patent Application,1990,Publication No.WO90/10697.
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9，Barr KA,Hopkins SA,Sreekrishma K,et al.Protocal for efficient secretion of HAS developed from Pichia Pastoris.Pharm Eng,1992,12：48-51.
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10，Thill GP,Davis GR,Stillman C,et al.Positive and negative effects of multi-copy integrated expression vectors on protein expression in Pichia Pastoris.Proceedings of the 6th international symposium on genetics of microorganisms. Societe Franscaise de Microbiologie.Paris,1990,2：477-490.
11，Romanos MA,Scorer CA,Clare JJ.Foreign gene expression in yeast. Yeast,1992,8：423-428.
12，Koti S,Robert GB,Keith EK,et al.Strategies for optimal synthesis and secretion of heterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia Pastoris.Gene,1997,190：55-62.
(收稿日期：2000-02-14)
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单位：马骊 王小宁(中国人民解放军第一军医大学分子免疫学重点实验室 广州 510515)；张智清 陈爱君 姚立红 姜忠良(中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室)
关键词：内皮生长因子；毕赤酵母；基因表达
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Expression and characterization of human vascular endothelial growth factor in Pichia.pastoris
MA Li, ZHANG Zhiqing, CHEN Aijun
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【Abstract】 Objective To study the expression of human VEGF165 cDNA in Pichia.pastoris and to obtain high-level expression of recombinant human VEGF165 (hVEGF165) with good biological activity. Methods Amplifying hVEGF165 cDNA by PCR,after confirmed by DNA sequence analysis,the gene was inserted into the Pichia.pastoris expression vector pPIC9K containing AOX1 promoter and α secreting signal peptides, the recombinant expression plasmid pPIC9K/VEGF165 was constructed and transformed into KM71. The multiple insert transformants were screened, fermented in flasks and induced by 1% methanol. Results After 4 days of methanol induction, the expressed hVEGF165 came up to 30% of total proteins in supernatant by SDS-PAGE. The expressed hVEGF165 was further proved having good antigenicity and high specificity by ELISA and Western blot assay, and having good biological activity to stimulate HUVEC proliferation. Conclusion High-level expression of secreted hVEGF165 had been successfully achieved in Pichia.pastoris expression system.
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【Key words】 Vascular endothelial growth factors; Pichia.pastoris; Gene expression
人血管内皮生长因子hVEGF165是由165个氨基酸组成的糖蛋白，其分子内有3对二硫键和1个糖基化位点，二硫键对维持其三级结构起重要作用，而糖基化仅与分泌功能有关〔1〕。作为一种高特异性促血管内皮细胞生长因子，VEGF在心血管领域已被用于冠心病防治的实验研究，发现它可促进小冠状血管侧枝循环的建立，恢复心肌血流供应，减少梗塞面积，促进缺血心肌的功能恢复，而且对实验性动脉成形术后再狭窄也具有很好的防治作用，因此，研究开发重组VEGF对于缺血性心脏病及其他
组织缺血性疾病的防治具有重大的应用价值。
VEGF由于天然来源非常有限，产量甚微，远不能满足临床应用的需要，因此利用DNA重组技术大量生产VEGF势在必行。我们在大肠埃希菌中高效表达了hVEGF165，但其以不溶解无活性的包涵体形式存在，其纯化和复性困难。在哺乳动物细胞中表达了hVEGF165，但表达量很低。甲基营养型酵母作为一种新型外源基因表达系统，兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工的双重特点，是外源基因表达的理想宿主〔2〕。我们利用PCR技术，扩增出495 bp的hVEGF165基因片段，并克隆于Pichia.pastoris酵母表达载体pPIC9K，实现了其高效分泌性表达。
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1 材料和方法
1.1 质粒、菌株和细胞株 hVEGF165*SR真核表达质粒由美国波士顿医学中心吴天根博士惠赠。酵母表达载体pPIC9K及宿主菌KM71购自Invitrogen公司。大肠埃希菌DH5α与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)株由本室保存。
1.2 酶和主要试剂 pGEM-T载体、限制性内切酶、T4连接酶及Taq DNA聚合酶购自Promega公司。酵母培养基Pepton、YNB(W/O)为Difco公司产品。hVEGF165单抗为本室以原核表达纯化的hVEGF165为抗原免疫小鼠制备的。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自晶美生物工程公司。
1.3 目的基因片段的扩增 引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物：5′-TAGAATTCGC
ACCCATGGCAGAAGGAGG-3′引入EcoR Ⅰ位点，下游引物：5′-TAGCGGCCGCTATCACCGCCTCGG
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CTTGTC-3′,引入Not Ⅰ位点。以hVEGF165*SR真核表达质粒为模板，PCR扩增条件为94℃ 45 s，68℃ 45 s，72℃ 60 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。
1.4 重组质粒的构建 将PCR产物插入pGEM-T载体，转化宿主菌DH5α，提取质粒，DNA测序正确后，以EcoR Ⅰ及Not Ⅰ双酶切，回收495 bp片段，插入pPIC9K的相同位点，连接产物转化宿主菌DH5α，提取质粒，酶切鉴定。
1.5 表达质粒转化酵母宿主菌 按文献〔3〕方法将酵母菌KM71制备成感受态，取出80 μl与5～10 μg Sac Ⅰ线性化的重组表达质粒混合，转入0.2 cm电转杯，冰浴5 min，于Bio-Rad Gene Pulser电转仪1 500 V，25 μF，200 条件下电转化，立即加入1 ml冰浴山梨醇，将菌液涂布于MD/-His(1.34%YNB，4×10-5%Biotin,2%Dextrose，1.5%Agar)选择平板上，30℃孵育2～3 d，观察转化子的生长。
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1.6 多拷贝整合转化子的筛选 将His+转化子分别对应地点在逐步增高G418浓度(0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0 mg/ml)的YPD平板上，30℃孵育2～3 d，筛选高G418抗性且生长良好的菌株作为表达株。
1.7 转化子的PCR检测 接种单菌落于10 μl无菌水中，加入5 μl Lyticase(5 U/μl),30℃培养10 min后，将菌液置于液氮中1 min，室温下解冻后用作模板，以α-Factor和3′AOX1引物作PCR检测，扩增条件为：95℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
1.8 表达菌株的诱导表达 接种单菌落于100 ml BMGY培养基(1% Yeast extract,2% Pepton,100% mmol/L Potassium phosphate,pH 6.0,1.34%YNB,4×10-5% Biotin,1% Glycerol)于30℃培养至吸光度A值(600 nm)≈4.0，离心收集菌体，用20 ml BMMY培养基(1% Yeast extract,2% Pepton,100 mmol/L Potassium phosphate,pH6.0，1.34%YNB,4×10-5% Biotin,1% Methanol)重悬培养，每日取样1 ml，并补加100%甲醇于培养基至浓度为1%，诱导表达6 d，样品离心收集上清，-20℃保存。
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1.9 表达产物的免疫学鉴定 Western blot方法参见文献〔4〕。
1.10 生物活性测定 采用HUVEC细胞株MTT测定法。将HUVEC用无血清1640培养基洗3次，用含5%血清的1640培养基调整细胞数为4×104/ml。将rhVEGF165表达上清用无血清1640培养基稀释至浓度为100 μg/ml，并在96孔板上倍比稀释，每孔留50 μl，加入HUVEC 100 μl，于37℃、5%CO2条件下培养36 h，每孔加MTT 20 μl，培养5 h后，加入20%SDS 80 μl裂解细胞，1 h后用酶标仪读取A(570 nm)值，绘制曲线，与对照组曲线比较，观察rhVEGF165的生物学活性。
2 结果
2.1 重组表达质粒的构建和鉴定 重组质粒的构建如图1，PCR扩增的hVEGF165基因片段长度为495 bp，与预计的大小相符，插入pGEM-T载体，转化宿主菌DH5α，提取质粒，DNA序列分析证实与国外文献报道一致。重组质粒pPIC9K/hVEGF165经EcoR Ⅰ+Not Ⅰ双酶切鉴定，得到相应片段。
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2.2 重组蛋白的表达 对G418抗性不同的His+转化子进行表达筛选时发现，多拷贝转化子外源基因表达量明显高于单拷贝转化子，基因拷贝数增加，表达量也随之增加，从占上清的10%增加到30%。提取菌体DNA，用α-Factor和3′AOX1引物作PCR检测，得到812 bp大小的特异片段，表明转化子基因组中确实整合有hVEGF165基因。SDS-PAGE分析甲醇诱导时间对表达量的影响发现，甲醇诱导第1 d，即有表达产物出现，但表达量较低，随着表达时间的延长，表达量也逐步增高，到第4 d达到高峰，经双波长薄层扫描，表达量最高可达上清总蛋白的30%以上。非还原条件下，表达的hVEGF165完全以有活性的同源二聚体形式存在，大小约为48 000；还原条件下，表达的hVEGF165以单体形式存在，大小约为24 000(图2)。
图1 重组质粒pPIC9K/VEGF165的构建
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Fig.1 Construction of recombinant plasmid pPIC9K/VEGF165
1：KM71/pPIC9K/hVEGF165表达上清(非还原型)；2：KM71/pPIC9K/hVEGF165表达上清；3：KM71/pPIC9K/hVEGF165诱导前上清对照；4:KM71/pPIC9K诱导上清对照；5:蛋白质分子量标准
图2 重组蛋白的SDS-PAGE分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein
1：Expressed supernatant of KM71/pPIC9K/hVEGF165(non-reduced).2:Expressed supernatant of KM71/pPIC9K/hVEGF165.3:Non-induced supernatant of KM71/pPIC9K/hVEGF165 as control.4:Induced supernatant of KM71/pPIC9K as control.5:Standard molecular weight marker
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2.3 表达产物的免疫学鉴定 Western blot结果显示，非还原型hVEGF165表达上清在相对分子质量48 000处有一特异性条带；还原型hVEGF165表达上清在相对分子质量24 000处有一特异性条带，而空载体转化菌诱导上清对照未见特异性条带(图3)，证实表达产物具有hVEGF165抗原性。
图3 重组蛋白的Western blot分析
Fig.3 Western blot analysis of recombinant protein
1：Expressed supernatant of KM71/pPIC9K/hVEGF165(non-reduced).2:Expressed supernatant of KM71/pPIC9K/hVEGF165.3:Induced supernatant of KM71/pPIC9K as control
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2.4 生物学活性测定 VEGF的主要生物学活性是刺激血管内皮细胞生长，我们用MTT法在HUVEC细胞株上测定其生物学活性，结果表明,hVEGF165表达上清可呈剂量依赖性地刺激HUVEC的增殖，表达上清稀释210倍至100 ng/ml时仍能刺激HUVEC的增殖，而空载体转化菌诱导上清对照无刺激HUVEC增殖的能力，表明表达的rhVEGF165具有天然VEGF的生物学活性(图4)。
3 讨论
Pichia.pastoris基因表达系统是一种新型外源基因表达系统，兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工，发酵条件简单，表达水平高，适宜高密度培养，并且具有分泌型表达优势，为工业化生产和纯化提供极大的方便。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg〔5〕、TNF〔6〕、EGF〔7〕、破伤风毒素C片段〔8〕、人血清白蛋白〔9〕等多种外源基因。
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外源基因的拷贝数是影响其表达量的一个重要因素。一般来讲，整合的拷贝数越多，表达量越高，但不是绝对的，有时单拷贝和多拷贝对表达量没有影响，甚至多拷贝引起表达量下降〔10〕。我们对大量的不同G418抗性转化子作表达筛选时发现，VEGF165基因多拷贝转化子表达量明显高于单拷贝转化子，随基因拷贝数增加，表达量也随之增加，从占菌体的10%增加到30%。
图4 rhVEGF165生物活性测定结果
Fig.4 Biological activity assay of rhVEGF165
—— ◆ rhVEGF165.…… ■ Induced supernatant of KM71/pPIC9K as control
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表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合〔11〕两种方式。单交换整合时或插入AOX1位点，或插入His4位点。有文献报道以His4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，使lacZ表达盒偶尔丢失，故AOX1位点更好〔12〕。我们采用SacⅠ单酶切使表达载体线性化，转化宿主菌KM71，单交换整合入染色体的AOX1位点，筛选出的表达菌株性质稳定，适合高密度发酵培养。
表达的蛋白在α因子信号肽引导下分泌到培养基中，这样，不仅避免了产物被细胞内蛋白酶降解和因产物在细胞内堆积所造成的毒性作用而影响细胞代谢，而且大大简化了产物的分离纯化过程，为工业化大规模生产提供了便利条件。
我们成功地利用酵母表达载体Pichia.pastoris高效表达了可溶性人血管内皮生长因子hVEGF165，并证实其具有刺激HUVEC增殖的功能，这对开发其在缺血性心脏病及肢体继发性动脉闭塞等疾病的防治应用奠定了基础。
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(收稿日期：2000-02-14)
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