EGF、TGF-β及胰岛素对兔骨骼肌卫星细胞增殖的影响
作者：徐蓬 顾晓明
单位：徐蓬(710032 西安，第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科)；顾晓明(710032 西安，第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科)
关键词：生长物质；胰岛素；肌，骨骼；动物，实验
中华口腔医学杂志000417 【摘要】 目的 研究表皮生长因子(epithelium growth factor, EGF)、转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)及胰岛素对兔骨骼肌卫星细胞(satellite cell, SC)增殖的影响。方法 采用MTT法测定EGF、TGF-β和胰岛素对兔骨骼肌SC增殖的影响。结果 在体外培养过程中，EGF和胰岛素促进兔骨骼肌SC增殖的作用较TGF-β明显，以胰岛素的作用最为显著，并且其促进作用随实验中所用浓度的增加及作用时间的延长而增强。结论 EGF、TGF-β和胰岛素均能促进兔骨骼肌SC的增殖，为体外对兔骨骼肌SC进行研究提供细胞来源。
, 百拇医药
The effects of EGF， TGF-β and insulin on the growth of rabbit′s skeletal muscle satellite cell
XU Peng，GU Xiaoming
(Department of Oral Maxillofacial Surgery，College of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of epithelium growth factor (EGF), transforming growth factor-β(TGF-β) and insulin on the growth of cultured rabbit′s skeletal muscle satellite cells.Methods After treatment with EGF, TGF-β and insulin, MTT method was used to study the proliferation of the cells. Results EGF and insulin could promote the growth of the satellite cells more significantly than that of TGF-β. Conclusion It implied that there was a close relationship between the effects of three agents and the regeneration of injured muscles. This kind of positive effect appeared in a dose- and time-dependent manner.
, 百拇医药
【Key words】 Growth substances； Insulin； Muscle，skeletal； Animals，laboratory
随着对骨骼肌失神经后肌肉再生与功能恢复的进一步研究和近年来免疫学的不断发展，越来越多的研究表明，生长因子在这一过程中发挥一定的作用，并且已成为相关研究工作中的重要内容[1]。但由于缺乏有效的技术手段，对生长因子在肌肉再生与功能恢复中的作用尚不十分清楚。我们利用体外培养的正常骨骼肌卫星细胞(satellite cell, SC)作为细胞模型，研究表皮生长因子(epithelium growth factor, EGF)、转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)及胰岛素等几种与肌肉再生密切相关的生长因子对兔骨骼肌SC增殖的影响。
材料与方法
1.材料：SC为第4代传代培养的兔骨骼肌SC，实验中所用药物和生长因子的具体种类和名称见表1；生长因子和有关药物浓度的选择以相关文献与预实验结果相结合而定。每种生长因子和药物浓度设定3个浓度梯度，相互之间差5倍(表1)。
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2.方法：SC培养24 h后加入按比例稀释的含有细胞因子和药物的培养液，每孔100 μl。每块培养板的每种生长因子每浓度梯度接种8个孔；设6个时间点，间隔24 h。分别在加药后第1～6天每天取1组培养板加入MTT试剂，测量每个孔的吸光度值(A)。然后计算每种生长因子和药物每一浓度组每天8个孔的吸光度平均值，以时间为横坐标，相对A值为纵坐标，绘制出不同的作用曲线。
结果
用MTT法测定SC的增殖情况，用倒置显微镜观察，细胞内针状结晶的多少与所用药物浓度和作用时间成正相关。具体作用效果的强弱因药物的不同而不同。
1.EGF对骨骼肌SC增殖的影响：EGF对肌SC增殖有加强和促进作用，其效应在加药后第2天显现出来，并随EGF浓度的增加和作用时间的延长而增强(图1)。EGF的浓度为0.25 mg/L时，SC的数量约比对照组高25%。
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表1 药物的种类、最终稀释浓度和分组 药物名称
种类
1组
2组
3组
4组
表皮生长因子(Sigma)
基因工程制品
空白对照
0.01 mg/L
0.05 mg/L
0.25 mg/L
, 百拇医药
转化生长因子β(Sigma)
基因工程制品
空白对照
5.00×104 IU/L
2.50×105 IU/L
1.25×106 IU/L
胰岛素(国产)
化学合成
空白对照
36 mg/L
180 mg/L
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900 mg/L
图1 表皮生长因子对兔骨骼肌卫星细胞增殖的作用
2. TGF-β对骨骼肌SC增殖的影响：TGF-β对SC增殖亦有一定的促进作用，但不如EGF的作用明显。从图2中可以看出， 其作用在加药后第3天方表现出来。其促进增殖作用也随TGF-β浓度的增加和作用时间的延长而增强，但其最高浓度组SC数量在第6天仅比对照组高约10%。
图2 转化生长因子β对兔骨骼肌卫星细胞增殖的作用
3.胰岛素对骨骼肌SC增殖的影响：胰岛素有极强的促SC增殖的能力，其作用在加药后第1天即开始出现，此后迅速增强，在第5～6天达到最高，其最低浓度在第6天时比对照组高30 %(图3)。
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讨论
由于外伤、感染、神经病变等因素的影响，颌面部的肌肉组织经常受到损伤。一般认为, 肌肉损伤后其自身的再生能力非常有限，主要是由于肌肉细胞在成熟的个体中已经分化成为终末细胞，自身的增殖再生能力已经丧失，而有增殖能力的肌母细胞的数量又非常有限。因此肌肉受到损伤后，常不能进行自我修复，进而影响其功能的恢复。这样，作为肌母细胞的SC的增殖能力，就成了制约肌肉再生能力的一个关键所在。
在本实验中，对EGF、TGF-β和胰岛素在体外培养的兔骨骼肌SC增殖过程中的作用进行了研究，结果发现上述生长因子和药物对体外培养的SC的增殖有促进作用。因药物不同，所发挥的作用强弱亦不相同(均取最高浓度组),见图4。
图3 胰岛素对兔骨骼肌卫星细胞增殖的作用
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图4 表皮生长因子、转化生长因子β及胰岛素对兔骨骼肌卫星细胞增殖的作用
在上述3种药物和生长因子中，EGF作为一种主要的丝裂原，促进了肌SC的有丝分裂，最终使肌SC大量增殖[2]。EGF最初是由Cohen及 Elliott[3]从鼠的颌下腺中发现的一种小蛋白，可以刺激啮齿类动物早熟,主要是促进表皮细胞生长和角质化。EGF是一种促间充质细胞和表皮细胞进行有丝分裂的丝裂原[4],在促进哺乳类动物细胞进行有丝分裂和影响其某些分化过程方面具有与胰岛素相同的作用。推测在骨骼肌SC表面有跨膜受体。
以往研究发现， TGF-β对上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、肠上皮细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖均有一定抑制作用，但 TGF-β对某些细胞还有促进增殖的作用，这主要取决于细胞类型[5]。此外， TGF-β可以促进细胞外基质的形成，并在胚胎发生和组织修复中发挥重要作用[6]。本实验结果表明，TGF-β对骨骼肌SC的增殖有一定促进作用。由于TGF-β还具有促进组织修复的作用，因此在肌肉的形成过程中亦有积极作用。
, 百拇医药
近来的研究表明，胰岛素能促进多种细胞的DNA合成，并能进一步促进其增殖，如成骨细胞、成纤维细胞等[7] 。本研究结果证明，胰岛素对兔骨骼肌SC也有明显的促进增殖作用。
本研究表明，EGF、TGF-β及胰岛素对兔骨骼肌SC增殖均有促进作用，可进一步影响骨骼肌的修复，这为颌面部肌肉损伤后的再生提供了新思路。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770803)
参考文献
1，Ewton DZ, Florini JR. Effects of insulin-like growth factors and transforming growth factor-beta on the growth and differentiation of muscle cells in culture. Proc Soc Exp Biol Med，1990，194:74-80.
, http://www.100md.com
2，Ham RG, St Clair JA, Webster C. Improved media for normal human muscle satelite cells: serum free clonal growth and enhanced growth with low serum. Invitro Cell Dev Biol,1988,24:833-844.
3，Cohen S, Elliott GA. The stimulation of epidermal keratinization by a protein isolated from the submaillary giand of the mouse. J Invest Dermatal, 1963,40:1-5.
4，Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. Ann Rev Biochem ,1979,48:193-216.
, http://www.100md.com
5，Sporn MB, Roberts AB, Wakefield LM, et al. Some recent advances in the chemistry and biology of trarsforming growth factor-beta. J Cell Biol,1987,105: 1039-1045.
6，Shiplay GD, Tucker RF, Moses HL. Type beta transforming growth factor /growth inhibitor stimulates entry of monolayer cultures of AKR-2B cells into S phase after a prolonged prereplicative interval. Proc Natl Acad Sci U S A, 1985,82:4147-4151.
7，Conover CA, Clarkson JT, Bale LK. Physiological concentrations of insulin induce cellular desensitization to the mitogenic effects of insulin-like growth factor I. Diabetes, 1994,43:1130-1137.
(收稿日期：1999-03-16), http://www.100md.com
单位：徐蓬(710032 西安，第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科)；顾晓明(710032 西安，第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科)
关键词：生长物质；胰岛素；肌，骨骼；动物，实验
中华口腔医学杂志000417 【摘要】 目的 研究表皮生长因子(epithelium growth factor, EGF)、转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)及胰岛素对兔骨骼肌卫星细胞(satellite cell, SC)增殖的影响。方法 采用MTT法测定EGF、TGF-β和胰岛素对兔骨骼肌SC增殖的影响。结果 在体外培养过程中，EGF和胰岛素促进兔骨骼肌SC增殖的作用较TGF-β明显，以胰岛素的作用最为显著，并且其促进作用随实验中所用浓度的增加及作用时间的延长而增强。结论 EGF、TGF-β和胰岛素均能促进兔骨骼肌SC的增殖，为体外对兔骨骼肌SC进行研究提供细胞来源。
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The effects of EGF， TGF-β and insulin on the growth of rabbit′s skeletal muscle satellite cell
XU Peng，GU Xiaoming
(Department of Oral Maxillofacial Surgery，College of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of epithelium growth factor (EGF), transforming growth factor-β(TGF-β) and insulin on the growth of cultured rabbit′s skeletal muscle satellite cells.Methods After treatment with EGF, TGF-β and insulin, MTT method was used to study the proliferation of the cells. Results EGF and insulin could promote the growth of the satellite cells more significantly than that of TGF-β. Conclusion It implied that there was a close relationship between the effects of three agents and the regeneration of injured muscles. This kind of positive effect appeared in a dose- and time-dependent manner.
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【Key words】 Growth substances； Insulin； Muscle，skeletal； Animals，laboratory
随着对骨骼肌失神经后肌肉再生与功能恢复的进一步研究和近年来免疫学的不断发展，越来越多的研究表明，生长因子在这一过程中发挥一定的作用，并且已成为相关研究工作中的重要内容[1]。但由于缺乏有效的技术手段，对生长因子在肌肉再生与功能恢复中的作用尚不十分清楚。我们利用体外培养的正常骨骼肌卫星细胞(satellite cell, SC)作为细胞模型，研究表皮生长因子(epithelium growth factor, EGF)、转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)及胰岛素等几种与肌肉再生密切相关的生长因子对兔骨骼肌SC增殖的影响。
材料与方法
1.材料：SC为第4代传代培养的兔骨骼肌SC，实验中所用药物和生长因子的具体种类和名称见表1；生长因子和有关药物浓度的选择以相关文献与预实验结果相结合而定。每种生长因子和药物浓度设定3个浓度梯度，相互之间差5倍(表1)。
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2.方法：SC培养24 h后加入按比例稀释的含有细胞因子和药物的培养液，每孔100 μl。每块培养板的每种生长因子每浓度梯度接种8个孔；设6个时间点，间隔24 h。分别在加药后第1～6天每天取1组培养板加入MTT试剂，测量每个孔的吸光度值(A)。然后计算每种生长因子和药物每一浓度组每天8个孔的吸光度平均值，以时间为横坐标，相对A值为纵坐标，绘制出不同的作用曲线。
结果
用MTT法测定SC的增殖情况，用倒置显微镜观察，细胞内针状结晶的多少与所用药物浓度和作用时间成正相关。具体作用效果的强弱因药物的不同而不同。
1.EGF对骨骼肌SC增殖的影响：EGF对肌SC增殖有加强和促进作用，其效应在加药后第2天显现出来，并随EGF浓度的增加和作用时间的延长而增强(图1)。EGF的浓度为0.25 mg/L时，SC的数量约比对照组高25%。
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表1 药物的种类、最终稀释浓度和分组 药物名称
种类
1组
2组
3组
4组
表皮生长因子(Sigma)
基因工程制品
空白对照
0.01 mg/L
0.05 mg/L
0.25 mg/L
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转化生长因子β(Sigma)
基因工程制品
空白对照
5.00×104 IU/L
2.50×105 IU/L
1.25×106 IU/L
胰岛素(国产)
化学合成
空白对照
36 mg/L
180 mg/L
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900 mg/L
图1 表皮生长因子对兔骨骼肌卫星细胞增殖的作用
2. TGF-β对骨骼肌SC增殖的影响：TGF-β对SC增殖亦有一定的促进作用，但不如EGF的作用明显。从图2中可以看出， 其作用在加药后第3天方表现出来。其促进增殖作用也随TGF-β浓度的增加和作用时间的延长而增强，但其最高浓度组SC数量在第6天仅比对照组高约10%。
图2 转化生长因子β对兔骨骼肌卫星细胞增殖的作用
3.胰岛素对骨骼肌SC增殖的影响：胰岛素有极强的促SC增殖的能力，其作用在加药后第1天即开始出现，此后迅速增强，在第5～6天达到最高，其最低浓度在第6天时比对照组高30 %(图3)。
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讨论
由于外伤、感染、神经病变等因素的影响，颌面部的肌肉组织经常受到损伤。一般认为, 肌肉损伤后其自身的再生能力非常有限，主要是由于肌肉细胞在成熟的个体中已经分化成为终末细胞，自身的增殖再生能力已经丧失，而有增殖能力的肌母细胞的数量又非常有限。因此肌肉受到损伤后，常不能进行自我修复，进而影响其功能的恢复。这样，作为肌母细胞的SC的增殖能力，就成了制约肌肉再生能力的一个关键所在。
在本实验中，对EGF、TGF-β和胰岛素在体外培养的兔骨骼肌SC增殖过程中的作用进行了研究，结果发现上述生长因子和药物对体外培养的SC的增殖有促进作用。因药物不同，所发挥的作用强弱亦不相同(均取最高浓度组),见图4。
图3 胰岛素对兔骨骼肌卫星细胞增殖的作用
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图4 表皮生长因子、转化生长因子β及胰岛素对兔骨骼肌卫星细胞增殖的作用
在上述3种药物和生长因子中，EGF作为一种主要的丝裂原，促进了肌SC的有丝分裂，最终使肌SC大量增殖[2]。EGF最初是由Cohen及 Elliott[3]从鼠的颌下腺中发现的一种小蛋白，可以刺激啮齿类动物早熟,主要是促进表皮细胞生长和角质化。EGF是一种促间充质细胞和表皮细胞进行有丝分裂的丝裂原[4],在促进哺乳类动物细胞进行有丝分裂和影响其某些分化过程方面具有与胰岛素相同的作用。推测在骨骼肌SC表面有跨膜受体。
以往研究发现， TGF-β对上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、肠上皮细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖均有一定抑制作用，但 TGF-β对某些细胞还有促进增殖的作用，这主要取决于细胞类型[5]。此外， TGF-β可以促进细胞外基质的形成，并在胚胎发生和组织修复中发挥重要作用[6]。本实验结果表明，TGF-β对骨骼肌SC的增殖有一定促进作用。由于TGF-β还具有促进组织修复的作用，因此在肌肉的形成过程中亦有积极作用。
, 百拇医药
近来的研究表明，胰岛素能促进多种细胞的DNA合成，并能进一步促进其增殖，如成骨细胞、成纤维细胞等[7] 。本研究结果证明，胰岛素对兔骨骼肌SC也有明显的促进增殖作用。
本研究表明，EGF、TGF-β及胰岛素对兔骨骼肌SC增殖均有促进作用，可进一步影响骨骼肌的修复，这为颌面部肌肉损伤后的再生提供了新思路。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770803)
参考文献
1，Ewton DZ, Florini JR. Effects of insulin-like growth factors and transforming growth factor-beta on the growth and differentiation of muscle cells in culture. Proc Soc Exp Biol Med，1990，194:74-80.
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2，Ham RG, St Clair JA, Webster C. Improved media for normal human muscle satelite cells: serum free clonal growth and enhanced growth with low serum. Invitro Cell Dev Biol,1988,24:833-844.
3，Cohen S, Elliott GA. The stimulation of epidermal keratinization by a protein isolated from the submaillary giand of the mouse. J Invest Dermatal, 1963,40:1-5.
4，Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. Ann Rev Biochem ,1979,48:193-216.
, http://www.100md.com
5，Sporn MB, Roberts AB, Wakefield LM, et al. Some recent advances in the chemistry and biology of trarsforming growth factor-beta. J Cell Biol,1987,105: 1039-1045.
6，Shiplay GD, Tucker RF, Moses HL. Type beta transforming growth factor /growth inhibitor stimulates entry of monolayer cultures of AKR-2B cells into S phase after a prolonged prereplicative interval. Proc Natl Acad Sci U S A, 1985,82:4147-4151.
7，Conover CA, Clarkson JT, Bale LK. Physiological concentrations of insulin induce cellular desensitization to the mitogenic effects of insulin-like growth factor I. Diabetes, 1994,43:1130-1137.
(收稿日期：1999-03-16), http://www.100md.com