脑缺血后脑组织诱生型一氧化氮合酶 组织病理学及轻度低温对其影响
作者：刘雪平 冷珍璞 劳萍 王凤焰 薛瑞贤
单位：山东省立医院，济南 250021
关键词：脑缺血；再灌注；诱生型一氧化氮合酶；组织病理学；轻度低温
中国急救医学000409 [摘 要] 目的 观察脑缺血与诱生型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达和组织病理的关系及轻度低温的影响。方法 沙鼠30只分假手术组、缺血组及轻度低温组(颞肌温度33℃，12 h)，夹闭双侧颈总动脉30 min，再灌注24、48 h检测脑组织iNOS基因表达及组织病理变化。结果 原位杂交显示缺血组胶质细胞等呈现iNOS基因表达，海马区CA1神经细胞部分皱缩及缺失，轻度低温组与缺血组相比iNOS阳性细胞明显减小，灰阶值也有明显下降(P<0.01)，神经元结构基本正常。结论 轻度低温抑制脑缺血后脑组织iNOS基因表达及减轻海马区组织损害程度可能是其脑保护机制之一。
, 百拇医药
[中图分类号] R 743.31；R 36；Q 593.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1002-1949(2000)04-0216-02
Effect of mild hypothermia on inducible nitric oxide synthase and pathological change following ischemia and reperfusion injury
LIU Xue-ping,LENG Zhen-pu,LAO Ping,et al.
(Shandong Provincial Hospital,Jinan 250021,China)
[Abstract] Objective To observe the effect of mild hypothermia on inducible nitric oxide synthase(iNOS)and pathological change following cerebral ischemia and reperfusion injury.Methods 30 gerbils were divided into 3 groups:Sham-operated,ischemia,mild hypothermia(temporal muscles remain 33℃,12 h).Cerebral ischemia last 30 min by occluding bilateral common carotid arterial and reperfution for 24 h,48 h.INOS gene expression was detected by the situ hybrization and pathological change was observed by HE.Results INOS gene expression in ischemia group was presented in glial cell etc.Compared with ischemia group,mild hypothermia induced down regulation of iNOS gene expression and decreased the pathological change of postischemic pyramidal neurons.Conclusion Mild hypothermia which inhibited the iNOS gene expression and reduced the extent of pathological change may be one of the protective mechanisms on cerebral ischemia.
, 百拇医药
[Key words] Cerebral ischemia and reperfusion； Inducible nitric oxide synthase； Histopathology； Mild hypothermia
一氧化氮合酶(NOS)的生理作用通过其合成的NO表现出来。脑缺血后在细胞因子等刺激下，脑组织产生诱生型NOS(iNOS)，并持续产生大量NO，参与迟发性神经元损害[1，2]。实验表明轻度低温(31～34℃)能明显减轻脑缺血后神经元损害[3]，轻度低温对脑缺血所致iNOS基因表达的影响未见报道。现将实验报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物实验分组及模型制作 雄性沙鼠44只，体重50～80 g，随机分假手术组、缺血组和轻度低温组，采用常规前脑缺血再灌注模型，1%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉，分离并夹闭双侧颈总动脉30 min松夹，缺血组术中用电热垫保持颞温36～37℃12 h(半导体测温仪测温)，分别于再灌注24、48 h活取脑组织各7只。轻度低温组自夹闭双侧颈总动脉始，头背部放置冰块上，10 min内使温度降至32～33℃，维持12 h后自然复温，余步骤同上。假手术组不夹闭血管外，全过程同缺血组，每组各取7只分离海马组织，各取3只顶叶冠状切开分别液氮中储存。
, 百拇医药
1.2 试剂来源及配制 iNOS裸探针购自北京医科大学；地戈辛随机引物，购自伯安公司；iNOS探针标记按说明书操作。
1.3 原位杂交检测iNOS 脑组织冰冻切片20 μm，4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗，0.2 M HCl 10 min，0.3%Triton-X-100冲洗15 min，0.2%甘氨酸15 min，PBS冲洗，5 M MgCI/PBS 30 min，2×SSC 15 min,4×SSC去离子甲酰胺(1：1)37℃ 15 min，然后按说明书进行预杂交及杂交反应，试剂均经DEPC水处理，镜下观察结果。
1.4 组织病理学 常规HE染色。
1.5 统计学处理 实验数据均用均数±标准差(
±s)，两组间均数比较用student's检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 脑组织iNOS基因表达 假手术组未见有iNOS基因表达，缺血组于皮质及海马区均见胶质细胞、单核细胞及中小微血管内皮细胞呈iNOS基因阳性表达，尤其在缺血再灌注48 h时表达明显；阳性细胞胞浆呈紫红色沉着，轻度低温组与缺血组相比，则阳性细胞明显减少，而且阳性细胞灰阶密度也明显减弱(34.89±4.56、28.74±4.78，P<0.01)。见图1。
图1.1 缺血组海马区iNOS mRNA阳性胶质细胞、血管内皮细胞(200×)
图1.2 轻度低温组海马区iNOS mRNA阳性细胞(200×)
2.2 组织病理变化 缺血组皮层神经细胞缺血变化不明显，海马CA1区部分缺失，有的胞核固缩、胞核及核仁不清晰，细胞周围间隙增大。轻度低温组上述区域细胞无明显缺失，细胞损伤改变明显减轻。见图2。
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图2.1 缺血组海马CA1区神经细胞缺血性变化(200×)
图2.2 轻度低温组海马CA1区神经细胞(200×)
3 讨论
缺血组再灌注24 h海马区胶质细胞及血管内皮细胞呈现iNOS基因表达，于再灌注48 h iNOS表达进一步增强，提示脑缺血后期NO产生主要由iNOS产生，同时缺血组皮层神经细胞缺血变化不明显，海马CA1区部分细胞缺失，有的胞核固缩、胞核及核仁不清晰，细胞周围间隙增大。推测海马区iNOS基因表达产生NO与海马CA1区神经细胞受损有关。关于NO在脑缺血中的作用有两种相反的观点，其结果取决于产生NO的细胞不同、量的多寡及时程。脑缺血早期NO迅速升高，早期NO由于其短暂的特性较少产生神经毒性作用，相反它通过NO/cGMP途径使脑血管扩张，增加脑血流，抗血小板聚集，抑制多形核白细胞的粘附，能对抗缺血性脑损伤[1，4]。脑缺血后数小时及数天，又有继发性NO增高，被认为主要由iNOS产生，导致迟发性神经元损害[4]，该NO通路激活主要由星形胶质细胞及白细胞被激活产生IL-1β、TNF-α等细胞因子诱导iNOS表达所致，而且由iNOS合成NO远比结构型NOS产生NO量多而持久，由iNOS合成NO主要发挥以下神经毒性作用[4～7]：①NO与超氧自由基反应生成过氧亚硝酸根，并进一步生成过氧亚硝酸或降解成羟自由基及二氧化氮，可造成细胞蛋白质、核酸及脂质膜的损伤。②NO易通过细胞膜与线粒体中的非血红素铁-硫复合物中的铁-硫中心结合，抑制线粒体呼吸。③NO亦能导致核酸的亚硝酰化和DNA链降解引起细胞死亡。轻度低温治疗后iNOS基因表达明显低于脑缺血组，海马CA1区细胞无明显缺失，细胞损伤改变明显减轻。推测轻度低温对iNOS基因转录有部分抑制作用减小过量NO产生，从而减轻海马区细胞损伤。轻度低温抑制脑组织NO过量产生及iNOS基因表达，可能是其具有脑保护机制之一。
, 百拇医药
[参考文献]
[1]钟慈声，孙安阳.一氧化氮与神经系统疾病[M].一氧化氮的生物医学，1995，217.
[2]Kenneth M,John W,Lauraine B. Nitric oxide: a downstream mediator of calcium toxicity in the ischemic cascade[J].Neurosci Lett,1994,166:43-47.
[3]Kader A,Frazzini VI,Baker CJ,et al. Effect of mild hypothermia on nitric oxide synthesis during focal cerebral ischemia[J].Neurosurgery,1994,35(2):272-277.
[4]Endoh M,Maiese K,Wagner J. Expression of the inducible from of nitric oxide synthase by reactive astrocyters after transient global ischemia[J].Brain Res,1994,651:92.
, 百拇医药
[5]Kader A,Frazzini VI,Solomon RA.Nitric oxide production during focal cerebral ischemia in rats[J].Stroke,1993,24:1079.
[6]Radi R,Backman JS,Bush KM,et al.Peroxynitite-induced membrane lipid peroxidation:the cytoxic perential of superoxide and nitric oxide[J].Arch Biochem Biophys,1991,288:481-487.
[7]Dawson TW,Dawson VL,Snuder SH.A novel neuronal messenger molecule in brain[J]:the free radical,nitric oxide.Ann neurol,1992,32:279.
[收稿：1999-03-11，修回：1999-10-25], http://www.100md.com
单位：山东省立医院，济南 250021
关键词：脑缺血；再灌注；诱生型一氧化氮合酶；组织病理学；轻度低温
中国急救医学000409 [摘 要] 目的 观察脑缺血与诱生型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达和组织病理的关系及轻度低温的影响。方法 沙鼠30只分假手术组、缺血组及轻度低温组(颞肌温度33℃，12 h)，夹闭双侧颈总动脉30 min，再灌注24、48 h检测脑组织iNOS基因表达及组织病理变化。结果 原位杂交显示缺血组胶质细胞等呈现iNOS基因表达，海马区CA1神经细胞部分皱缩及缺失，轻度低温组与缺血组相比iNOS阳性细胞明显减小，灰阶值也有明显下降(P<0.01)，神经元结构基本正常。结论 轻度低温抑制脑缺血后脑组织iNOS基因表达及减轻海马区组织损害程度可能是其脑保护机制之一。
, 百拇医药
[中图分类号] R 743.31；R 36；Q 593.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1002-1949(2000)04-0216-02
Effect of mild hypothermia on inducible nitric oxide synthase and pathological change following ischemia and reperfusion injury
LIU Xue-ping,LENG Zhen-pu,LAO Ping,et al.
(Shandong Provincial Hospital,Jinan 250021,China)
[Abstract] Objective To observe the effect of mild hypothermia on inducible nitric oxide synthase(iNOS)and pathological change following cerebral ischemia and reperfusion injury.Methods 30 gerbils were divided into 3 groups:Sham-operated,ischemia,mild hypothermia(temporal muscles remain 33℃,12 h).Cerebral ischemia last 30 min by occluding bilateral common carotid arterial and reperfution for 24 h,48 h.INOS gene expression was detected by the situ hybrization and pathological change was observed by HE.Results INOS gene expression in ischemia group was presented in glial cell etc.Compared with ischemia group,mild hypothermia induced down regulation of iNOS gene expression and decreased the pathological change of postischemic pyramidal neurons.Conclusion Mild hypothermia which inhibited the iNOS gene expression and reduced the extent of pathological change may be one of the protective mechanisms on cerebral ischemia.
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[Key words] Cerebral ischemia and reperfusion； Inducible nitric oxide synthase； Histopathology； Mild hypothermia
一氧化氮合酶(NOS)的生理作用通过其合成的NO表现出来。脑缺血后在细胞因子等刺激下，脑组织产生诱生型NOS(iNOS)，并持续产生大量NO，参与迟发性神经元损害[1，2]。实验表明轻度低温(31～34℃)能明显减轻脑缺血后神经元损害[3]，轻度低温对脑缺血所致iNOS基因表达的影响未见报道。现将实验报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物实验分组及模型制作 雄性沙鼠44只，体重50～80 g，随机分假手术组、缺血组和轻度低温组，采用常规前脑缺血再灌注模型，1%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉，分离并夹闭双侧颈总动脉30 min松夹，缺血组术中用电热垫保持颞温36～37℃12 h(半导体测温仪测温)，分别于再灌注24、48 h活取脑组织各7只。轻度低温组自夹闭双侧颈总动脉始，头背部放置冰块上，10 min内使温度降至32～33℃，维持12 h后自然复温，余步骤同上。假手术组不夹闭血管外，全过程同缺血组，每组各取7只分离海马组织，各取3只顶叶冠状切开分别液氮中储存。
, 百拇医药
1.2 试剂来源及配制 iNOS裸探针购自北京医科大学；地戈辛随机引物，购自伯安公司；iNOS探针标记按说明书操作。
1.3 原位杂交检测iNOS 脑组织冰冻切片20 μm，4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗，0.2 M HCl 10 min，0.3%Triton-X-100冲洗15 min，0.2%甘氨酸15 min，PBS冲洗，5 M MgCI/PBS 30 min，2×SSC 15 min,4×SSC去离子甲酰胺(1：1)37℃ 15 min，然后按说明书进行预杂交及杂交反应，试剂均经DEPC水处理，镜下观察结果。
1.4 组织病理学 常规HE染色。
1.5 统计学处理 实验数据均用均数±标准差(
±s)，两组间均数比较用student's检验。, 百拇医药
2 结果
2.1 脑组织iNOS基因表达 假手术组未见有iNOS基因表达，缺血组于皮质及海马区均见胶质细胞、单核细胞及中小微血管内皮细胞呈iNOS基因阳性表达，尤其在缺血再灌注48 h时表达明显；阳性细胞胞浆呈紫红色沉着，轻度低温组与缺血组相比，则阳性细胞明显减少，而且阳性细胞灰阶密度也明显减弱(34.89±4.56、28.74±4.78，P<0.01)。见图1。
图1.1 缺血组海马区iNOS mRNA阳性胶质细胞、血管内皮细胞(200×)
图1.2 轻度低温组海马区iNOS mRNA阳性细胞(200×)
2.2 组织病理变化 缺血组皮层神经细胞缺血变化不明显，海马CA1区部分缺失，有的胞核固缩、胞核及核仁不清晰，细胞周围间隙增大。轻度低温组上述区域细胞无明显缺失，细胞损伤改变明显减轻。见图2。
, 百拇医药
图2.1 缺血组海马CA1区神经细胞缺血性变化(200×)
图2.2 轻度低温组海马CA1区神经细胞(200×)
3 讨论
缺血组再灌注24 h海马区胶质细胞及血管内皮细胞呈现iNOS基因表达，于再灌注48 h iNOS表达进一步增强，提示脑缺血后期NO产生主要由iNOS产生，同时缺血组皮层神经细胞缺血变化不明显，海马CA1区部分细胞缺失，有的胞核固缩、胞核及核仁不清晰，细胞周围间隙增大。推测海马区iNOS基因表达产生NO与海马CA1区神经细胞受损有关。关于NO在脑缺血中的作用有两种相反的观点，其结果取决于产生NO的细胞不同、量的多寡及时程。脑缺血早期NO迅速升高，早期NO由于其短暂的特性较少产生神经毒性作用，相反它通过NO/cGMP途径使脑血管扩张，增加脑血流，抗血小板聚集，抑制多形核白细胞的粘附，能对抗缺血性脑损伤[1，4]。脑缺血后数小时及数天，又有继发性NO增高，被认为主要由iNOS产生，导致迟发性神经元损害[4]，该NO通路激活主要由星形胶质细胞及白细胞被激活产生IL-1β、TNF-α等细胞因子诱导iNOS表达所致，而且由iNOS合成NO远比结构型NOS产生NO量多而持久，由iNOS合成NO主要发挥以下神经毒性作用[4～7]：①NO与超氧自由基反应生成过氧亚硝酸根，并进一步生成过氧亚硝酸或降解成羟自由基及二氧化氮，可造成细胞蛋白质、核酸及脂质膜的损伤。②NO易通过细胞膜与线粒体中的非血红素铁-硫复合物中的铁-硫中心结合，抑制线粒体呼吸。③NO亦能导致核酸的亚硝酰化和DNA链降解引起细胞死亡。轻度低温治疗后iNOS基因表达明显低于脑缺血组，海马CA1区细胞无明显缺失，细胞损伤改变明显减轻。推测轻度低温对iNOS基因转录有部分抑制作用减小过量NO产生，从而减轻海马区细胞损伤。轻度低温抑制脑组织NO过量产生及iNOS基因表达，可能是其具有脑保护机制之一。
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[参考文献]
[1]钟慈声，孙安阳.一氧化氮与神经系统疾病[M].一氧化氮的生物医学，1995，217.
[2]Kenneth M,John W,Lauraine B. Nitric oxide: a downstream mediator of calcium toxicity in the ischemic cascade[J].Neurosci Lett,1994,166:43-47.
[3]Kader A,Frazzini VI,Baker CJ,et al. Effect of mild hypothermia on nitric oxide synthesis during focal cerebral ischemia[J].Neurosurgery,1994,35(2):272-277.
[4]Endoh M,Maiese K,Wagner J. Expression of the inducible from of nitric oxide synthase by reactive astrocyters after transient global ischemia[J].Brain Res,1994,651:92.
, 百拇医药
[5]Kader A,Frazzini VI,Solomon RA.Nitric oxide production during focal cerebral ischemia in rats[J].Stroke,1993,24:1079.
[6]Radi R,Backman JS,Bush KM,et al.Peroxynitite-induced membrane lipid peroxidation:the cytoxic perential of superoxide and nitric oxide[J].Arch Biochem Biophys,1991,288:481-487.
[7]Dawson TW,Dawson VL,Snuder SH.A novel neuronal messenger molecule in brain[J]:the free radical,nitric oxide.Ann neurol,1992,32:279.
[收稿：1999-03-11，修回：1999-10-25], http://www.100md.com