通脉口服液对慢性肾炎气虚血瘀证大鼠模型的药效学研究

http://www.100md.com 《广州中医药大学学报》 2000年第4期

     作者：杨霓芝 包崑 王立新 王桦 雷娓娓

    单位：杨霓芝 包崑 王立新(广州中医药大学第二附属医院，广州 510120)王桦(广州空军总医院中医科，广州)；雷娓娓(广州中医药大学电镜室，广州 510405)

    关键词：@通脉口服液/药理学；黄芪/治疗应用；三七/治疗应用；肾炎/中药疗法；T淋巴细胞/免疫学；血液流变学/药物作用；疾病模型，动物；大鼠

    广州中医药大学学报000415摘要：目的：探讨益气活血药通脉口服液(由黄芪、三七组成)对大鼠慢性肾炎“气虚血瘀证”模型的治疗机理。方法：在大鼠慢性肾炎模型的基础上，加建大鼠“气虚血瘀证”模型，随机分通脉口服液高剂量治疗组、通脉口服液低剂量治疗组、金水宝治疗组、模型对照组及正常对照组，治疗4周后，进行组间疗效比较。结果：通脉口服液组对模型大鼠的一般状态、生化指标(包括T淋巴细胞亚群和血液流变学等)及肾组织病理的损害均有明显的改善作用，且高剂量组疗效要优于金水宝组和低剂量组。结论：通脉口服液通过益气活血，调节了模型大鼠的免疫功能，改善了血液高凝状态，减轻了肾脏病理损害，从而达到改善和稳定肾功能的目的，延缓了肾小球硬化的发生。

    中图分类号：R692.3 文献标识码：A

    文章编号：1007-3213(2000)04-0332-05

    Pharmacodynamic Study of Tongmai Oral Liquid for Chronic Nephritis Rat Model

    with Qi-deficiency and Blood-stasis Syndrome

    YANG Nizhi, BAO Kun, WANG Lixing

    (The Second Affiliated Hospital, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510120,China)

    WANG Hua

    (Dept. of TCM, General Hospital of Guangzhou Air Force, Guangzhou, China)

    LEI Weiwei

    (Dept. of Electron Microscopy, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405,China)

    Abstract: The mechanism of Tongmai Oral Liquid (TOL) for chronic nephritis rat model with Qi-deficiency and blood-stasis syndrome was studied.The model was established by adding Qi-deficiency and blood-stasis syndrome to the chronic nephritis rats. The experimental rats were randomly allocated to 5 groups: Group A (treated with high dosage of TOL), Group B (treated with low dosage of TOL), Group C (treated with Jinshuibao), Group D (model control group) and Group E (normal control group). After 4 weeks of treatment, general health state, biochemical indexes including T lymphocyte subgroup and blood rheology, and pathological damage of kidney tissue were much improved in Group A than Group B and Group C. It is indicated that TOL can improve the renal function and delay the occurrence of glomerular arteriosclerosis in rats by reinforcing Qi, activating blood flow, regulating immune function, lessening the hypercoagulative state and reducing renal damage.

    Key words:@ TONGMAI ORAL LIQUID/pharmacology;ASTRAGALUS MEMBRANACEUS/ther. use; PANAX PSEUDOGINSENG/ther. use;NEPHRITIS/ TCD therapy; T-LYMPHOCYTES/immunology;BLOOD RHEOLOGY/drug effects; DISEASE MODELS, ANIMAL; RATS

    我们应用具有益气活血作用的通脉口服液治疗慢性肾炎病人，临床已取得较满意的结果。在此基础上，为进一步研究该药作用机制，我们用通脉口服液对大鼠慢性肾炎“气虚血瘀证”模型进行了实验性治疗，现报告如下。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    1.1.1 实验动物 健康低龄SD大鼠(约100g)3只，雄性新西兰兔6只，由广州中医药大学动物中心提供；雄性清洁级SD大鼠60只，体重200～250g，由中山医科大学动物中心提供。

    1.1.2 主要试剂 兔抗鼠Thy-1抗血清(ATS)的制备参照文献[1]，完全弗氏佐剂(Sigma公司)、卡介苗(北京药品生物制品研究所提供)，抗兔IgG荧光抗体(效价1∶10，由天象人公司提供)。

    1.1.3 实验药物 通脉口服液由黄芪、三七组成，按常规方法加工提取，使每mL含黄芪生药0.3 g、田七生药0.1 g，由广东省中医院制剂中心提供；金水宝胶囊每粒内含虫草菌粉0.33 g，由江西金水宝制药有限公司生产，批准文号(89)卫药准字Z-18号。

    1.2 实验方法

    1.2.1 实验分组 60只SD大鼠购回后适应性喂养1周，无异常发现者，随机分为通脉口服液高剂量组(A组，简称通脉高剂组)、通脉口服液低剂量组(B组，简称通脉低剂组)、金水宝组(C组)、模型对照组(D组)和正常对照组(E组)，每组12只，自由饮食。

    1.2.2 大鼠慢性肾炎模型的制备 采用抗Thy-1抗体制备大鼠系膜增生性肾炎(MsPGN)模型，参照文献[1]方法，将A、B、C、D组大鼠由尾静脉注射ATS10mL/kg，每周1次，连续4周。

    1.2.3 大鼠“气虚血瘀证”模型的建立 参照文献[2]方法，在实验第2周时，予A、B、C、D组大鼠行游泳疲劳试验，连续2周。

    1.2.4 给药剂量及途径 在首次注射ATS后的第 2 天开始给A、B、C组药物灌胃，A组用通脉口服液9mL/kg(约为成人药量公斤体重的20倍)；B组用通脉口服液4.5 mL/kg(约为成人药量公斤体重的10倍)；C组用金水宝1.7 粒/kg(剥去胶囊取粉末溶于蒸馏水中，约为成人药量公斤体重的10倍)；D组予蒸馏水按10mL/kg灌胃；均每日1次，共4周。

    1.3 观察指标

    全部大鼠于造模后第2周末及第4周末用代谢笼收集24h尿液，并于第4周末行眼球摘除采血，后处死取肾组织。观察一般情况；进行24h尿蛋白定量测定；尿纤维蛋白降解产物(FDP)测定；血尿素氮、血肌酐测定；血液流变学测定；T淋巴细胞亚群测定及肾组织学检查。

    1.4 统计学处理 所有数据以均数±标准差表示，对数值变量使用方差分析及Q检验；对分类变量使用χ²检验或秩和检验。

    2 实验结果

    2.1 一般情况 在实验过程中模型组有1例大鼠死亡。造模之各组大鼠均出现不同程度的精神不振、摄食减少、生长迟缓、身体消瘦、蜷缩、体毛无光泽、大便稀烂等现象，尤其以模型组最为明显。

    2.2 24h尿蛋白定量、尿FDP定性、血尿素氮、肌酐比较 结果见表1。

    2.3 血液流变学比较 结果见表2。

    表1 各组24h尿蛋白定量(m_24h蛋白)、尿FDP定性阳性率(p_FDP阳性)、血尿素氮(c_BUN)、血肌酐(c_scr)比较 (±s)

    N/例

    m_{24h蛋白，2周}/mg

    m_{24h蛋白，4周}/mg

    p_FDP阳性/%

    c_Bun/(mmol*L^-1)

    c_Scr/(μmol*L^-1)

    通脉高剂组

    12

    9.81±2.53^**

    7.00±1.45^**△

    25.00^##_▲▲▲

    8.23±1.30^**△

    53.42±5.88^**

    通脉低剂组

    12

    11.32±3.54^**

    10.64±3.16^**

    41.60^###_▲▲

    9.64±1.87^**

    55.32±5.77^*

    金水宝组

    12

    11.17±2.15^**

    10.45±3.10^**

    66.67^##

    9.63±1.98^**

    56.73±5.31

    模型组

    11

    27.54±8.62

    23.75±7.72

    100.00

    11.87±1.31

    60.95±3.01

    正常组

    12

    4.06±1.96^**

    3.97±1.96^**

    8.33^##

    6.52±1.13^**

    43.63±3.74^**

    t检验：*与模型组比较P<0.05，**P<0.01；△与金水宝组比较P<0.05。χ²检验：##与模型组比较P<0.01，###P<0.001；▲▲与金水宝组比较P<0.01，▲▲▲P<0.001

    表2 各组血液流变学比较 (±s)

    N/例

    η_{全血比粘度，低切}

    /(mPa^.s^-1)

    η_{全血比粘度，高切}

    /(mPa^.s^-1)

    η_{全血还原粘度}

    /(mPa^.s^-1)

    I_聚集指数

    通脉高剂组

    12

    18.66±0.64^**△△

    6.15±0.64^**△△

    37.88±8.23^*

    2.98±0.39^**△

    通脉低剂组

    12

    21.15±3.49^*

    6.70±0.77^*

    42.38±7.98

    3.05±0.20^**

    金水宝组

    12

    22.86±3.33

    7.07±0.46

    44.28±6.76

    3.30±0.32^**

    模型组

    11

    25.47±4.39

    7.47±0.54

    46.37±8.08

    3.79±0.34

    正常组

    12

    15.13±2.23^**

    5.62±0.85^**

    34.31±4.58^**

    2.82±0.32^**

    η_{血浆比粘度}/(mPa^.s^-1)

    φ_{红细胞压积}/%

    s_总积分/分

    通脉高剂组

    1.61±0.50^**△△

    46.92±3.06^**

    39.58±4.48^**△△

    通脉低剂组

    1.76±0.05

    47.75±3.37^**

    45.75±4.39^*

    金水宝组

    1.76±0.06

    49.50±3.18^*

    47.17±4.40

    模型组

    1.82±0.07

    52.85±2.56

    49.90±3.39

    正常组

    1.55±0.09**

    41.17±3.30^**

    38.83±4.45^**

    *与模型组比较P<0.05，**P<0.01；与金水宝组比较△P<0.05，△△P<0.01 2.4 肾组织学检查

    2.4.1 免疫荧光学检查 在荧光显微镜下，正常组大鼠肾小球内无IgG沉积，而造模之各组系膜区均可见IgG呈颗粒或团块状沉积，弥漫或节段分布，强度不一。其中模型组表现最重，通脉高剂组最轻。见表3。免疫荧光强度分级标准参照文献[3]。

    2.4.2 光镜检查 正常组有3例见肾小球毛细血管轻度充血，余无异常。模型组肾小球内系膜细胞均有增生。系膜基质增宽，并可见少量中性粒细胞浸润。基底膜未见明显增厚。大部分肾小球增大。肾球囊闭塞。近曲小管上皮细胞呈中度或重度细胞内水肿，部分肾小管腔内见蛋白。各治疗组(通脉高剂组、通脉低剂组、金水宝组)系膜增生现象均有减轻，近曲小管上皮细胞内水肿明显好转，肾小管内蛋白消失。见图1。

    表3 各组大鼠免疫荧光检查结果比较 组 别

    N/例

    N_荧光强度/例

    -

    +

    ++

    +++

    ++++

    通脉高剂组

    12

    5

    2

    4

    1

    0^*

    通脉低剂组

    12

    2

    2

    5

    2

    1

    金水宝组

    12

    3

    3

    4

    2

    0

    模型组

    11

    0

    1

    2

    3

    50

    正常组

    12

    12

    0

    0

    0

    0^**

    *与模型组比较P<0.05，**P<0.01

    每例标本任选10个肾小球，计数每个肾小球的细胞数，并测量每个肾小球的长径，经统计，如表4所示。

    2.4.3 电镜检查 正常组细胞结构完整。模型组系膜区显著增宽，系膜细胞和系膜基质增生，有云雾状电子致密物在系膜区沉积，部分足突融合，毛细血管基底膜基本正常。各治疗组病理改变轻于模型组，以通脉高剂组病变最轻，通脉低剂组、金水宝组次之。见图2。

    2.5 各组 T 淋巴细胞亚群比较 结果见表5。表4 各组肾小球内细胞数、肾小球大小的比较 (±s) 组 别

    N/例

    N_细胞数/个

    l_{肾小球直径}/μm

    通脉高剂组

    12

    49.13±10.01^**△

    87.62±9.67^**△△

    通脉低剂组

    12

    55.09±9.54^**

    96.83±12.22^**

    金水宝组

    12

    58.33±9.33^**

    109.65±10.89^**

    模型组

    11

    76.37±12.35

    130.66±14.08

    正常组

    12

    42.12±7.95^**

    78.37±9.52^**

    **与模型组比P<0.01；△与金水宝组比P<0.05，△△P<0.01表5 各组T淋巴结胞亚群比较 (±s) 组 别

    N/例

    p_CD3/%

    p_CD4/%

    p_CD8/%

    p_CD4/p_CD8

    通脉高剂组

    12

    59.58±8.87^**

    31.50±4.93^**

    23.92±3.40^**

    1.33±0.03^**

    通脉低剂组

    12

    55.83±7.12^*

    29.42±3.78^*

    25.50±4.01^*

    1.16±0.02^**

    金水宝组

    12

    55.33±8.22^**

    29.17±4.04^**

    25.00±3.91^*

    1.20±0.08^**

    模型组

    11

    46.73±5.82

    24.36±3.38

    28.91±3.70

    0.86±0.03

    正常组

    12

    65.42±6.39^**

    33.00±4.31^**

    23.50±3.15^**

    1.44±0.12^**

    *与模型组比较P<0.05，**P<0.01

    3 讨论

    3.1 模型的选择、制备与评价

    原发性慢性肾小球肾炎的主要病理类型是系膜增生性肾炎(MsPGN,包括IgA肾病)，约占我国原发性肾小球病理类型的66.6% ^[4]。而且系膜的病变也是其他多种类型肾炎常见且突出的表现，故采用MsPGN模型来研究慢性肾炎具有较好的代表性。

    结合我们的临床观察发现，慢性肾炎患者中医辨证为气虚证的最多，占56.3%，并且约85%以上的气虚证患者兼夹有血瘀证。可以说，慢性肾炎的中医证型临床以气虚血瘀证最为常见^[5]。

    根据以上认识，我们选用了陈氏等^[1]建立的改进型大鼠抗Thy-1肾炎模型，此模型与临床系膜增生性肾炎表现相似。再根据“过度劳倦有伤形体”及“气为血帅，气行则血行，气虚则血瘀”的理论，我们在大鼠肾炎造模过程中，又对大鼠进行了游泳疲劳试验，以此取得了慢性肾炎“气虚血瘀”证模型。

    所以本实验的动物模型既具有西医肾“病”的特征，又具有中医“证”的特征，我们认为这种有双重接触点的动物模型可使中医药治疗机理的研究更加客观和科学。

    造模后的大鼠肾脏病理显示为典型的系膜增生。造模过程中大鼠出现了精神不振、摄食减少、生长迟缓等气虚症候，T淋巴细胞亚群检测提示模型组大鼠CD₃、CD₄降低，CD₈增高，导致CD₄/CD₈比值降低，表明机体存在细胞免疫功能紊乱，同时造模大鼠有尿纤维蛋白降解产物的增多与血液流变学中的异常。此表明本实验的大鼠慢性肾炎“气虚血瘀”证模型制造成功。

    图1 名组光镜下视图(HE染色)

    图2 各组电镜下视图

    3.2 阳性对照药物的确立

    目前市场上治疗慢性肾炎的有关中成药主要有金水宝、雷公藤多甙、火把花根、黄蜀葵花及昆明山海棠等。考虑上述各药物的使用范围、适应证、毒副反应及价格等方面后，结合本实验的特点，我们选择了金水宝作实验对照。金水宝是从青海冬虫夏草中分离所得的虫草拟青霉CS-4菌株，经纯化、人工发酵培养而制成的人工冬虫夏草口服制剂。对冬虫夏草及其人工制剂等的研究表明，它们可从不同的方面对肾脏病患者进行免疫功能的调节^[6]。毕氏等^[7]的临床观察尚发现金水宝有降血脂、降血液粘度及抑制血小板聚集的作用。所以我们认为选用金水宝作本试验的阳性对照药是可行的。

    3.3 通脉口服液组方依据

    现大多中医学者已认识到慢性肾炎的发病多以气虚为本，以血瘀为标，即因气虚而发病，因血瘀而致疾病迁延难愈，虚与瘀均贯穿于疾病过程的始终。而现代医学研究发现免疫反应是引起肾小球疾病的关键，由免疫反应介导的凝血启动则是病变持续发展和肾功能进行性减退的重要因素。从中可看出中西医对慢性肾炎发病的认识有相通之处。据此，我们研制了具有益气活血作用的通脉口服液来治疗慢性肾炎。

    3.4 通脉口服液作用机理

    通脉口服液由黄芪与三七组成。黄芪性味甘，微温，有补气升阳，利水消肿，益卫固表之效。现代药理研究证实，黄芪对机体的免疫系统有广泛的影响，具有较强的免疫调节作用，表现以免疫增强为主，但在某些条件下又具有免疫抑制作用^[8，9]。三七味甘、微苦，性温，有活血祛瘀之效，研究证实其能抑制血小板功能，促进纤溶，使血液粘度降低，能显著改善体内高凝状态^[10]。张氏等^[11]进一步对三七皂甙进行研究，发现其能促进肾间质细胞凋亡，防止间质细胞增殖过度，可延缓肾小球硬化的发生。

    通过本动物实验发现：通脉口服液能降低尿蛋白、尿FDP及血清Bun与Scr，改善血液流变学，调节细胞免疫功能，并减轻肾脏病理损害，突出表现为抑制IgG在肾小球系膜区的沉积，以及抑制系膜细胞与系膜基质增殖。综合观察，疗效以通脉高剂量组最明显，优于通脉低剂量组和金水宝对照组，呈现出一定的量效依赖关系。

    综上所述，我们认为通脉口服液对慢性肾炎的作用机理：一方面是通过益气扶正来调节机体免疫功能，增强免疫稳定性，抑制已发生的免疫反应；另一方面，通过活血祛瘀来改善体内微循环，降低血液高凝状态，并抑制肾小球内的异常增殖，最终达到改善或稳定肾功能的目的，从而延缓肾小球硬化的发生。

    基金项目：广东省重点科技攻关项目(编号：97053)

    作者简介：杨霓芝(1948-)，女，主任医师；

    参考文献：

    [1] 陈广平，郭慕依，张月娥，等.大鼠Thy-1抗血清制备及系膜增生性肾炎模型的建立[J].临床与实验病理学杂志，1996，3：241

    [2] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，1991.146

    [3] 邹万忠.肾脏病理与临床[M].湖南：湖南科学技术出版社，1993，9-10

    [4] 黎大石，关天俊，刘志红，等.4298例成年人肾小球疾病病理类型及流行病学特点[J].肾脏病与透析肾移植杂志，1997，2：103

    [5] 包，杨霓芝.慢性肾炎气虚证及其兼夹证分析[J].江苏中医，2000，5：10

    [6] 王国栋.冬虫夏草类防治肾脏病研究进展[J].辽宁中医杂志，1995，2：93

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    [8] 李丽英，王海燕.黄芪、当归对肝脏和肾脏功能的保护作用[J].中华肾脏病杂志，1995，6：372

    [9] 殷静先.黄芪药理研究与临床应用[J].时珍国药研究，1998，3：230

    [10] 王本祥.现代中药药理学[M].天津：天津科学技术出版社，1997.807-818

    [11] 张国强，叶任高，孔庆瑜，等.三七总甙诱导间质纤维化人肾成纤维细胞凋亡及其分子机理初探[J].中华肾脏病杂志，1998，2：93

    收稿日期：2000-08-50

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