反相高效液相色谱法测定芎芍胶囊中芍药甙犬血清浓度
作者：张壮 阎彦芳 王桂森 范吉平 陈可冀
单位：张壮 阎彦芳 王桂森 范吉平(北京中医药大学东直门医院 北京100700)；陈可冀(中国中医研究院西苑医院 北京100091)
关键词：反相高效液相色谱；芎芍胶囊；芍药甙；血药浓度；犬
北京中医药大学学报000408 摘要：建立芎芍胶囊中芍药甙血清药物浓度的反相高效液相色谱定量分析方法。色谱条件为固定相：Hypersil ODS2 C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇—水(25∶75)，流速1.0 mL/min，检测波长230 nm，柱温22 ℃。血清芍药甙浓度在93.6～4680.0 μg/L范围内线性关系良好，检测限5 μg/L，回收率(100.15±2.07)%，日内、日间精密度为1.58%～1.91%、1.72%～2.59%。本法准确性、灵敏度、专一性高，操作简便快速，为复方中芍药甙的血清药物浓度分析提供有意义的方法学参考。
, 百拇医药
中图分类号：R284.2
RP-HPLC Assay for the Determination of Paeoniflorin of
XiongShao Capsule in Canine Serum
Zhang Zhuang Yan Yanfang Wang Guisen et al.
(The Affiliated Dongzhimen Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100700)
ABSTRACT：Objective: To establish a sensitive HPLC method for the determination of serum concentration of the paeoniflorin (PF) in Chinese medicine Xiongshao Capsule. Method: The conditions were as follows: Solid phase, Hypersil ODS2 C18 column (150 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase, methanol-water(25∶75); flow rate:1.0 ml.min-1; detection wavelength, 230nm, temperature， 22 ℃. Results: Good linearity of PF in serunm was found within 93.6～4680.0 μg.L-1. The detection limit was 5μg.L-1. The mean rate of recovery was (100.15±2.07)%. The within-day and day-to-day relative standard deviation (RSD) ranged from 1.58～1.91% and 1.72～2.59%. Conclusion: It was a simple, sensitive, specific and accurate analysis method for PF in serum.
, 百拇医药
KEY WORDS: RP-HPLC; Paeoniflorin; Serum; Concentration
近年来高效液相色谱法(HPLC)已较多应用于中药复方成分的生物体内分析，并且由于其灵敏度、专一性、准确性好逐渐成为主流方法。我们在进行芎芍胶囊的药代动力学研究中，建立了较好的复方中芍药甙血清浓度测定的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法，现报道如下。
1 材料
1.1 仪器
岛津LC-6A高效液相色谱仪，C-R3A数据处理机；岛津SPD-6AV紫外可见检测器组成系统。
1.2 药品与试剂
芎芍胶囊由中国中医研究院西苑医院制剂室提供，批号：960113。芍药甙标准品，购自中国药品生物制品检定所，批号：0736-9608，经HPLC测定为单一色谱峰，归一化法含量为99.1%。甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯均为国产分析纯，水为三蒸水。
, 百拇医药
1.3 实验动物
杂种犬6只，体重(17.5±1.8)kg，均为雄性，第四军医大学西京医院实验动物中心提供。
2 方法
2.1 色谱条件
经反复预实验，确定色谱条件为流动相：甲醇—水(25∶75)，超声波脱气10 min。固定相：Hypersil ODS2 C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流速：1.0 mL/min，检测波长：230 nm，柱温：22 ℃，灵敏度：0.1 AUFS。在此条件下PF保留值tr=10.00±0.08 min(n=122)，采用外标法定量测定血清芍药甙浓度。
2.2 标准液配制与保存
精密称取芍药甙标准品7.80 mg，以甲醇溶解于50 mL容量瓶中，成为156.00 mg/L的标准母液，分装于玻璃试管中，-20 ℃密封保存。现用现取，以移液管精确稀释配制为31.20 mg/L，15.60 mg/L和6.24 mg/L的芍药甙标准溶液待用。
, 百拇医药
2.3 犬血清样品的预处理方法
微量加样器精取待测犬血清200 μL加入离心试管， 精取乙酸乙酯1.4 mL加入试管旋混120 s，3 000 r/min离心15 min，精取乙酸乙酯层1.0 mL，置于玻璃试管，60 ℃水浴，氮气吹干。HPLC测定前，流动相150 μL定容，进样100 μL。
2.4 标准曲线的制备
于尖底玻璃离心试管中分别加入6.24 mg/L标准液3、6 μL；15.60 mg/L标准液4 μL；31.2 mg/L标准液4、8 μL；156.00 mg/L标准液3、6 μL。室温氮气吹干后，以微量加样器精取混合空白犬血清200 μL加入离心试管，旋混60 s，静置5 min，成为血清芍药甙浓度分别为93.60、187.20、312.00、624.00、1248.00、2340.00、4680.00 μg/L的7个含药血清标准管。血清预处理后HPLC测定峰面积(APF)，共测定5组，经Q检验，各浓度点APF无逸出值。计算5组各浓度点平均值，以APF为纵坐标，以血清芍药甙浓度CPF为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程。
, 百拇医药
2.5 检测限确定法
按标准曲线含药血清制备法制备PF浓度为1、2、4、5、8、10、15、20 μg/L的含药犬血清，预处理后进样，以信噪比(S/N)为3时的PF血清浓度判为本HPLC分析方法的检测限。
2.6 日内、内间精密度测定法
124.80、936.00、3900.00 μg/L 3个1组高中低浓度系列含药血清，在1日内测定6组，计算APF的平均值(
)和标准偏差(s)，计算相对标准偏差RSD，结果为日内精密度。在10 d内不同天测定5次，计算RSD，结果为日间精密度。
2.7 回收率测定法
精取混合空白犬血清200 μL加入芍药甙标准液制备血清PF浓度(CPF)分别为124.80、936.00、3900.00 μg/L的3个1组高中低浓度系列含药血清，在10 d内检测5组，将APF代入标准曲线计算血药浓度实测值(CPF′)，回收率RC=CPF′/CPF。
, 百拇医药
2.8 犬给药及采血方法
生理盐水溶解芎芍胶囊配成相当于生药1 g/mL溶液，犬灌胃给药5 mL/kg，给药前取空白血清，给药后不同时点取血，分离血清，-15 ℃保存待测。
3 实验结果
3.1 HPLC色谱图
结果见图1。
图1 HPLC色谱图
A 芍药甙标准品a为PF的色谱峰 B 混合空白犬血清
C 混合空白犬血清加入芍药甙标准品 D 犬灌胃芎芍胶囊240 min时点血清
, 百拇医药
3.2 专一性
芍药甙峰与犬血清内源性物质、芎芍胶囊吸收入血的其他成分峰均实现基线分离效果。犬灌胃芎芍胶囊后血清经预处理后流动相定容液加入芍药甙标准液，只有保留时间(10.00±0.08)min处的色谱峰特异性增高，峰面积增加量与所加芍药甙量成正比，表明专一性良好。
3.3 检测限
检测限测定结果表明PF浓度5 μg/L的含药犬血清的HPLC色谱图符合S/N=3的条件，故本法的检测限为PF血清浓度5 μg/L。
3.4 线性范围与标准曲线
血清芍药甙浓度在93.60～4680.00 μg/L的范围内，PF峰面积与血清PF浓度间线性关系良好，标准曲线方程APF=41.4250CPF+1575.1988(r=0.9984)。表明可满足动物实验定量分析的要求。
, http://www.100md.com
3.5 日内、内间精密度
测定124.80、936.00、3900.00 μg/L低中高浓度血清的日内精密度RSD分别为1.84%，1.91%，1.58%；日间精密度RSD分别为2.59%，2.10%，1.72%，符合定量分析要求。
3.6 回收率
本法回收率测定结果表明符合定量分析要求。结果见表1。
3.7 犬灌胃芎芍胶囊血清芍药甙浓度
犬灌胃芎芍胶囊后血清芍药甙经时浓度测定结果见表2。
表1 芍药甙血清浓度测定方法的回收率实验结果 (±s) 加样浓度
, 百拇医药
(μg/L)
5次测定值(μg/L)
回收率/%
1
2
3
4
5
124.80
122.71
128.67
121.57
128.33
, http://www.100md.com
128.07
100.86±2.75
936.00
941.52
825.52
910.16
922.33
962.77
99.62±2.17
3900.00
3948.36
3875.04
, 百拇医药
3951.48
3834.87
3881.67
99.96±1.29
表2 犬灌胃芎芍胶囊血清芍药甙平均浓度 (μg/L;n=6;±s) 时间
30 min
45 min
60 min
120 min
180 min
, http://www.100md.com
240 min
300 min
360 min
420 min
平均浓度
153.89±
17.03
329.85±
33.91
586.30±
35.82
1534.69±
, 百拇医药
387.77
3515.92±
771.03
3276.65±
1329.95
1704.19±
710.80
987.30±
290.79
522.72±
143.60
4 讨论
, 百拇医药
本实验建立的犬灌胃芎芍胶囊血清芍药甙浓度的RP-HPLC测定法，是在文献基础上改进优化而成的。根据芍药甙的理化性质[1]，芍药甙血清预处理方法曾选用氯仿、乙酸乙酯等作提取剂，最终确定乙酸乙酯，杂质峰明显少于氯仿提取法，提取率高，萃取一步完成，无乳化现象，简便快速。用乙酸乙酯提取液HPLC检测出现多个杂质峰，但都与芍药甙峰实现基线分离，不干扰芍药甙定性与定量分析。
流动相曾试用陈氏[2]、蒋氏[3]两文的流动相，陈法的保留时间较短，可分离空白犬血清中的芍药甙单体，但不能理想地分离芎芍胶囊复方灌胃后犬血清中的芍药甙，芍药甙峰与多个杂峰重叠在一起。蒋法所用流动相用冰乙酸调pH至3.0±0.1，但芍药甙在酸性条件下极易分解破坏，实验中发现虽可明显延长保留时间，但标准曲线各浓度点的峰面积标准差太大，且回收率低，无法达到定量分析要求。故本实验选用中性流动相，经反复摸索甲醇—水的比例，发现甲醇—水(25∶75)条件下，芍药甙峰与其他杂峰可实现基线分离，且保留时间为10 min，比较适中、快速；而若再减低甲醇—水的比例，则保留时间明显延长，峰形不理想，理论塔板数明显下降。
, 百拇医药
本实验建立的中药复方中芍药甙血清浓度的HPLC测定方法，线性关系良好，回收率精密度高，表明本法专一性、准确性、灵敏度高，操作简便快速，所用血清量少，为芎芍胶囊中芍药甙的药动学研究提供了较理想的定量分析方法，并为其他中药复方中芍药甙的血药浓度分析提供了有意义的方法学参考。
参考文献
1，梁学谦.芍药甙的分离提取及其药理作用.新医药学杂志，1974，(12)：42～44
2，陈崇宏，张 源，陈光亮.芍药甙的药代动力学研究.中国药理学通报，1990，6(5)：299～301
3，蒋学华，刘世端，徐 萍.反相高效液相色谱法测定血浆中芍药甙的含量.中成药，1993，15(20)：29～30
(收稿日期：2000-03-10), 百拇医药
单位：张壮 阎彦芳 王桂森 范吉平(北京中医药大学东直门医院 北京100700)；陈可冀(中国中医研究院西苑医院 北京100091)
关键词：反相高效液相色谱；芎芍胶囊；芍药甙；血药浓度；犬
北京中医药大学学报000408 摘要：建立芎芍胶囊中芍药甙血清药物浓度的反相高效液相色谱定量分析方法。色谱条件为固定相：Hypersil ODS2 C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇—水(25∶75)，流速1.0 mL/min，检测波长230 nm，柱温22 ℃。血清芍药甙浓度在93.6～4680.0 μg/L范围内线性关系良好，检测限5 μg/L，回收率(100.15±2.07)%，日内、日间精密度为1.58%～1.91%、1.72%～2.59%。本法准确性、灵敏度、专一性高，操作简便快速，为复方中芍药甙的血清药物浓度分析提供有意义的方法学参考。
, 百拇医药
中图分类号：R284.2
RP-HPLC Assay for the Determination of Paeoniflorin of
XiongShao Capsule in Canine Serum
Zhang Zhuang Yan Yanfang Wang Guisen et al.
(The Affiliated Dongzhimen Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100700)
ABSTRACT：Objective: To establish a sensitive HPLC method for the determination of serum concentration of the paeoniflorin (PF) in Chinese medicine Xiongshao Capsule. Method: The conditions were as follows: Solid phase, Hypersil ODS2 C18 column (150 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase, methanol-water(25∶75); flow rate:1.0 ml.min-1; detection wavelength, 230nm, temperature， 22 ℃. Results: Good linearity of PF in serunm was found within 93.6～4680.0 μg.L-1. The detection limit was 5μg.L-1. The mean rate of recovery was (100.15±2.07)%. The within-day and day-to-day relative standard deviation (RSD) ranged from 1.58～1.91% and 1.72～2.59%. Conclusion: It was a simple, sensitive, specific and accurate analysis method for PF in serum.
, 百拇医药
KEY WORDS: RP-HPLC; Paeoniflorin; Serum; Concentration
近年来高效液相色谱法(HPLC)已较多应用于中药复方成分的生物体内分析，并且由于其灵敏度、专一性、准确性好逐渐成为主流方法。我们在进行芎芍胶囊的药代动力学研究中，建立了较好的复方中芍药甙血清浓度测定的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法，现报道如下。
1 材料
1.1 仪器
岛津LC-6A高效液相色谱仪，C-R3A数据处理机；岛津SPD-6AV紫外可见检测器组成系统。
1.2 药品与试剂
芎芍胶囊由中国中医研究院西苑医院制剂室提供，批号：960113。芍药甙标准品，购自中国药品生物制品检定所，批号：0736-9608，经HPLC测定为单一色谱峰，归一化法含量为99.1%。甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯均为国产分析纯，水为三蒸水。
, 百拇医药
1.3 实验动物
杂种犬6只，体重(17.5±1.8)kg，均为雄性，第四军医大学西京医院实验动物中心提供。
2 方法
2.1 色谱条件
经反复预实验，确定色谱条件为流动相：甲醇—水(25∶75)，超声波脱气10 min。固定相：Hypersil ODS2 C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流速：1.0 mL/min，检测波长：230 nm，柱温：22 ℃，灵敏度：0.1 AUFS。在此条件下PF保留值tr=10.00±0.08 min(n=122)，采用外标法定量测定血清芍药甙浓度。
2.2 标准液配制与保存
精密称取芍药甙标准品7.80 mg，以甲醇溶解于50 mL容量瓶中，成为156.00 mg/L的标准母液，分装于玻璃试管中，-20 ℃密封保存。现用现取，以移液管精确稀释配制为31.20 mg/L，15.60 mg/L和6.24 mg/L的芍药甙标准溶液待用。
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2.3 犬血清样品的预处理方法
微量加样器精取待测犬血清200 μL加入离心试管， 精取乙酸乙酯1.4 mL加入试管旋混120 s，3 000 r/min离心15 min，精取乙酸乙酯层1.0 mL，置于玻璃试管，60 ℃水浴，氮气吹干。HPLC测定前，流动相150 μL定容，进样100 μL。
2.4 标准曲线的制备
于尖底玻璃离心试管中分别加入6.24 mg/L标准液3、6 μL；15.60 mg/L标准液4 μL；31.2 mg/L标准液4、8 μL；156.00 mg/L标准液3、6 μL。室温氮气吹干后，以微量加样器精取混合空白犬血清200 μL加入离心试管，旋混60 s，静置5 min，成为血清芍药甙浓度分别为93.60、187.20、312.00、624.00、1248.00、2340.00、4680.00 μg/L的7个含药血清标准管。血清预处理后HPLC测定峰面积(APF)，共测定5组，经Q检验，各浓度点APF无逸出值。计算5组各浓度点平均值，以APF为纵坐标，以血清芍药甙浓度CPF为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程。
, 百拇医药
2.5 检测限确定法
按标准曲线含药血清制备法制备PF浓度为1、2、4、5、8、10、15、20 μg/L的含药犬血清，预处理后进样，以信噪比(S/N)为3时的PF血清浓度判为本HPLC分析方法的检测限。
2.6 日内、内间精密度测定法
124.80、936.00、3900.00 μg/L 3个1组高中低浓度系列含药血清，在1日内测定6组，计算APF的平均值(
)和标准偏差(s)，计算相对标准偏差RSD，结果为日内精密度。在10 d内不同天测定5次，计算RSD，结果为日间精密度。2.7 回收率测定法
精取混合空白犬血清200 μL加入芍药甙标准液制备血清PF浓度(CPF)分别为124.80、936.00、3900.00 μg/L的3个1组高中低浓度系列含药血清，在10 d内检测5组，将APF代入标准曲线计算血药浓度实测值(CPF′)，回收率RC=CPF′/CPF。
, 百拇医药
2.8 犬给药及采血方法
生理盐水溶解芎芍胶囊配成相当于生药1 g/mL溶液，犬灌胃给药5 mL/kg，给药前取空白血清，给药后不同时点取血，分离血清，-15 ℃保存待测。
3 实验结果
3.1 HPLC色谱图
结果见图1。
图1 HPLC色谱图
A 芍药甙标准品a为PF的色谱峰 B 混合空白犬血清
C 混合空白犬血清加入芍药甙标准品 D 犬灌胃芎芍胶囊240 min时点血清
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3.2 专一性
芍药甙峰与犬血清内源性物质、芎芍胶囊吸收入血的其他成分峰均实现基线分离效果。犬灌胃芎芍胶囊后血清经预处理后流动相定容液加入芍药甙标准液，只有保留时间(10.00±0.08)min处的色谱峰特异性增高，峰面积增加量与所加芍药甙量成正比，表明专一性良好。
3.3 检测限
检测限测定结果表明PF浓度5 μg/L的含药犬血清的HPLC色谱图符合S/N=3的条件，故本法的检测限为PF血清浓度5 μg/L。
3.4 线性范围与标准曲线
血清芍药甙浓度在93.60～4680.00 μg/L的范围内，PF峰面积与血清PF浓度间线性关系良好，标准曲线方程APF=41.4250CPF+1575.1988(r=0.9984)。表明可满足动物实验定量分析的要求。
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3.5 日内、内间精密度
测定124.80、936.00、3900.00 μg/L低中高浓度血清的日内精密度RSD分别为1.84%，1.91%，1.58%；日间精密度RSD分别为2.59%，2.10%，1.72%，符合定量分析要求。
3.6 回收率
本法回收率测定结果表明符合定量分析要求。结果见表1。
3.7 犬灌胃芎芍胶囊血清芍药甙浓度
犬灌胃芎芍胶囊后血清芍药甙经时浓度测定结果见表2。
表1 芍药甙血清浓度测定方法的回收率实验结果 (
±s) 加样浓度, 百拇医药
(μg/L)
5次测定值(μg/L)
回收率/%
1
2
3
4
5
124.80
122.71
128.67
121.57
128.33
, http://www.100md.com
128.07
100.86±2.75
936.00
941.52
825.52
910.16
922.33
962.77
99.62±2.17
3900.00
3948.36
3875.04
, 百拇医药
3951.48
3834.87
3881.67
99.96±1.29
表2 犬灌胃芎芍胶囊血清芍药甙平均浓度 (μg/L;n=6;
±s) 时间30 min
45 min
60 min
120 min
180 min
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240 min
300 min
360 min
420 min
平均浓度
153.89±
17.03
329.85±
33.91
586.30±
35.82
1534.69±
, 百拇医药
387.77
3515.92±
771.03
3276.65±
1329.95
1704.19±
710.80
987.30±
290.79
522.72±
143.60
4 讨论
, 百拇医药
本实验建立的犬灌胃芎芍胶囊血清芍药甙浓度的RP-HPLC测定法，是在文献基础上改进优化而成的。根据芍药甙的理化性质[1]，芍药甙血清预处理方法曾选用氯仿、乙酸乙酯等作提取剂，最终确定乙酸乙酯，杂质峰明显少于氯仿提取法，提取率高，萃取一步完成，无乳化现象，简便快速。用乙酸乙酯提取液HPLC检测出现多个杂质峰，但都与芍药甙峰实现基线分离，不干扰芍药甙定性与定量分析。
流动相曾试用陈氏[2]、蒋氏[3]两文的流动相，陈法的保留时间较短，可分离空白犬血清中的芍药甙单体，但不能理想地分离芎芍胶囊复方灌胃后犬血清中的芍药甙，芍药甙峰与多个杂峰重叠在一起。蒋法所用流动相用冰乙酸调pH至3.0±0.1，但芍药甙在酸性条件下极易分解破坏，实验中发现虽可明显延长保留时间，但标准曲线各浓度点的峰面积标准差太大，且回收率低，无法达到定量分析要求。故本实验选用中性流动相，经反复摸索甲醇—水的比例，发现甲醇—水(25∶75)条件下，芍药甙峰与其他杂峰可实现基线分离，且保留时间为10 min，比较适中、快速；而若再减低甲醇—水的比例，则保留时间明显延长，峰形不理想，理论塔板数明显下降。
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本实验建立的中药复方中芍药甙血清浓度的HPLC测定方法，线性关系良好，回收率精密度高，表明本法专一性、准确性、灵敏度高，操作简便快速，所用血清量少，为芎芍胶囊中芍药甙的药动学研究提供了较理想的定量分析方法，并为其他中药复方中芍药甙的血药浓度分析提供了有意义的方法学参考。
参考文献
1，梁学谦.芍药甙的分离提取及其药理作用.新医药学杂志，1974，(12)：42～44
2，陈崇宏，张 源，陈光亮.芍药甙的药代动力学研究.中国药理学通报，1990，6(5)：299～301
3，蒋学华，刘世端，徐 萍.反相高效液相色谱法测定血浆中芍药甙的含量.中成药，1993，15(20)：29～30
(收稿日期：2000-03-10), 百拇医药