PCNA反义寡核苷酸抑制人膀胱癌EJ细胞增殖活性的实验研究
作者：曾甫清 朱朝晖 林晨 赵军 鲁功成
单位：
关键词：
New Page 1 【摘要】 目的 探讨肾移植前后外周血淋巴细胞选凝素-L 的表达水平变化与肾移植排斥反应的关系。 方法 应用单克隆抗体- 流式细胞仪荧光抗体技术监测33例肾移植受者外周血淋巴细胞选凝素-L的表达水平。 结果 肾移植术后所有患者选凝素-L表达水平较术前显著降低，排斥反 应时排斥组明显升高(49.1±13.8)，同期稳定组无明显变化(36.5±12.7)。 结论 选凝素-L与肾移植排斥反应密切相关，抑制选凝素-L表达是联合应用免疫 抑制剂防治排斥反应的重要作用机制，监测选凝素-L的表达水平有助于肾移植排斥反应的 诊断。
Detection of selectin-L in renal allograft recipients
, 百拇医药
BA I Han,PAN Guanghui,ZHENG Shaobin.
(Department of Urology,Nanfang Hospital,Guan gzhou 510515,China)
【Abstract】 Objective To study the levels of select in-L in lymphocyte of renal transplant recipients. Methods The expression of selectin-L in lymphocyte was studied by means of flow cyt ometry in 33 renal transplant recipients 1 day before operation and on the 3rd, 6th,9th and 15th post operative days. Results The levels of selectin-L depressed notably after transplantation,ascended suddenly during the course of graft rejection. Conclusions Selectin-L is intimately correlated with renal transplant rejection.An important mechanism of the immunodepressives is the depress of selectin-L expression.The study of s electin-L is of help in the early diagnosis of graft rejection.
, http://www.100md.com
【Key words】 Kidney Transplantation Selectin-L
急性排斥反应是导致肾移植失败的主要原因。淋巴细胞是急性排斥反应的主要效应细胞，而粘附分子直接介导淋巴细胞浸润移植肾的整个过程，我们以淋巴细胞表面粘附分子之一选凝素-L为监测对象，探讨其在急性排斥反应中表达变化的意义。
资料和方法
一、监测对象及分组
接受同种异体肾移植术患者33例，男21例，女12例。平均年龄37岁。原发病为慢性肾小球肾炎、糖尿病、多囊肾等所致的慢性肾功能衰竭、尿毒症。手术前行血液透析8～19个月。供肾取自新鲜尸体，供受者ABO血型相容，淋巴细胞毒性试验小于10%。术后抗淋巴细胞球蛋白、环孢素A(CsA)、硫唑嘌呤、泼尼松顺序用药抗排斥治疗。术后15天内无临床排斥反应症状者，列入肾功稳定组，共24例；出现排斥反应症状且血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)升高，血CsA浓度正常者，列入排斥反应组，共9例。
, http://www.100md.com
二、外周血淋巴细胞选凝素-L表达测定
1.标本采集：分别于肾移植术前1天，术后3、6、9、15天抽取患者静脉血1ml，常规肝素抗凝。
2.单克隆抗体及标记物：选凝素-L的单克隆抗体为Dreg56，其特异性识别的抗原相对分子质量为75000～85000，标记物为FITC，由Coulter公司提供。
3.流式细胞仪血液单细胞样品制备：抗凝全血50μl，加结合型单抗10μl。25℃孵育10min。加PBS缓冲液320μl，300×g离心5min后，弃上清液，再加320μlPBS缓冲液，上机检测。
4.流式细胞仪检测：应用流式细胞仪(Elite Conlter Corporation,USA)常规检测方法。检测细胞数为5000个，结果以荧光标记阳性细胞占被测细胞百分率表示。
, 百拇医药
三、统计学处理
莸取数据以均数±标准差表示，采用t检验，P<0.05为显著性标准。
结 果
肾功稳定组术后移植肾功能逐渐恢复，每日尿量>2000ml，血Cr、BUN渐降低。排斥反应组术后4～6天开始尿量减少，血Cr、BUN同步升高，血CsA浓度正常，诊断为急性排斥反应。经治疗1～3天尿量恢复每日2000ml以上，血Cr、BUN逐渐降低。
选凝素-L监测结果见表1。
表1 肾移植前后淋巴细胞表面选凝素-L的表达水平(%)
组别
例数
术前
, http://www.100md.com
术 后
1～3d
4～6d
7～9d
10～15d
稳定组
24
42.5±9.8*
31.5±14.5
36.5±12.7
42.0±15.3*
53.8±15.7*
, 百拇医药
排斥组
9
44.9±11.2*
31.3±10.5
49.1±13.8*#
48.8±16.2*
43.5±11.1*△
*与术后3d比较，P<0.05；#与同期稳定组比较，P<0.05；△与同期稳定组比较，P<0.05讨 论
同种异体肾移植所致的急性排斥反应中，移植肾组织中最早出现的浸润细胞主要是淋巴细胞，表明淋巴细胞介导的细胞免疫在急性排斥反应中起主要作用[1]。近年来的研究还证明，各种粘附分子是淋巴细胞与血管内皮细胞粘附进而浸润移植肾的直接、必要参与者[2-4]。由此可见粘附分子在排斥反应过程中所起的重要作用。
, 百拇医药
既往对粘附分子表达情况与肾移植排斥反应关系的研究主要集中在移植肾组织中的表达情况，发现粘附分子在正常肾细胞和移植肾组织中表达的明显区别，有助于排斥反应的诊断。然而，关于粘附分子在移植肾排斥反应的主要免疫效应细胞--淋巴细胞表面的表达研究，国内尚未见报道。我们以选凝素-L为研究对象，采用单克隆抗体-流式细胞仪荧光免疫技术，动态观察其在肾移植受者外周血淋巴细胞表面的表达情况，并对其意义进行探讨。
选凝素-L是粘附分子选凝素家族的一分子，主要表达在白细胞表面，其他细胞很少表达，可以在血流状态下介导白细胞与血管内皮细胞的起始粘附，即介导白细胞沿血管壁的滚动。它的作用的发挥，是白细胞浸润移植组织的先决条件之一[5]。
选凝素-L在淋巴细胞表达水平动态检测结果显示：排斥反应时，排斥组的表达与稳定组比较明显升高。选凝素-L表达水平显著增高与排斥反应发生的这种一致性结果，提示可以将选凝素-L的表达水平作为肾移植排斥反应的诊断指标。
, 百拇医药
另外，监测还发现稳定组和排斥组在肾移植术后3天内，选凝素-L的表达水平较术前减低。这种与应用免疫抑制剂同步出现的低表达状态，可能是免疫抑制剂对选凝素-L表达的抑制作用，提示抑制选凝素-L表达可能是免疫抑制剂防止排斥反应发生的作用机制之一。体外实验发现，CsA可以抑制T淋巴细胞与内皮细胞的粘附，并证实CsA是通过抑制粘附分子的表达来实现这种作用的[6，7]，这一结果支持我们对术后选凝素-L表达降低的原因分析。
至于稳定组在术后表达较低水平以后，没有维持在这一水平上，而是有逐渐升高的趋势，至术后10～15天时，表达水平已经高于排斥组同期水平，这一现象可能与稳定组逐渐减少免疫抑制剂用量，而排斥组逐渐增加免疫抑制剂用量有关。
本课题受国家自然科学基金资助(39570200)
参考文献
1，毕爱华.医学免疫学.第1版.北京:人民军医出版社.1996,253-254.
, http://www.100md.com
2，Mampaso F,Marcen R,Molina A,et al.Expression of adhesion molecules in allog raft renal dysfunction:a distinct diagnostic pattern in rejection and cyclospori ne nephrotoxicity.Transplant Proc,1994,26∶2859-2860.
3，Kauppinen H,Soots A,Krogerus L,et al.Different expression of adhesion molec ules ICAM-1 and VCAM-1 and activation markers MHC class Ⅱand IL-2R in acute and chronic rejection of rat kidney allografts.Transplant Proc,1997,29∶3150-31 51.
, http://www.100md.com
4，Hauser IA,Riess R,Hansknecht B,et al.Expression of cell adhesion molecules in primary renal disease and renal allograft rejection.Nephrol Dial Transplant,1 997,12∶1122-1131.
5，Fuggle SV,Dicken DH.Cell adhesion molecules in clinical renal transpla ntation.Transplantation,1998,65∶763-769.
6，De Caterina R,Tanaka H,Nakagawa T,et al.The direct effect of injectable cyc losporine and its vehicle,cremophor,onendothelial vascular cell adhesion molecul e-1 expression:ricinoleic acid inhibits coronary artery endothelial activation .Transplantation,1995,60∶270-275.
7，Frishberg Y,Meyers C,Kelly CJ.Cyclosporine A regulates T cell-epithelial cel l adhesion by altering LFA-1 and Icam-1 expression.Kidney Int,1996,50∶45-53.
(收稿日期：1999-10-29), 百拇医药
单位：
关键词：
New Page 1 【摘要】 目的 探讨肾移植前后外周血淋巴细胞选凝素-L 的表达水平变化与肾移植排斥反应的关系。 方法 应用单克隆抗体- 流式细胞仪荧光抗体技术监测33例肾移植受者外周血淋巴细胞选凝素-L的表达水平。 结果 肾移植术后所有患者选凝素-L表达水平较术前显著降低，排斥反 应时排斥组明显升高(49.1±13.8)，同期稳定组无明显变化(36.5±12.7)。 结论 选凝素-L与肾移植排斥反应密切相关，抑制选凝素-L表达是联合应用免疫 抑制剂防治排斥反应的重要作用机制，监测选凝素-L的表达水平有助于肾移植排斥反应的 诊断。
Detection of selectin-L in renal allograft recipients
, 百拇医药
BA I Han,PAN Guanghui,ZHENG Shaobin.
(Department of Urology,Nanfang Hospital,Guan gzhou 510515,China)
【Abstract】 Objective To study the levels of select in-L in lymphocyte of renal transplant recipients. Methods The expression of selectin-L in lymphocyte was studied by means of flow cyt ometry in 33 renal transplant recipients 1 day before operation and on the 3rd, 6th,9th and 15th post operative days. Results The levels of selectin-L depressed notably after transplantation,ascended suddenly during the course of graft rejection. Conclusions Selectin-L is intimately correlated with renal transplant rejection.An important mechanism of the immunodepressives is the depress of selectin-L expression.The study of s electin-L is of help in the early diagnosis of graft rejection.
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【Key words】 Kidney Transplantation Selectin-L
急性排斥反应是导致肾移植失败的主要原因。淋巴细胞是急性排斥反应的主要效应细胞，而粘附分子直接介导淋巴细胞浸润移植肾的整个过程，我们以淋巴细胞表面粘附分子之一选凝素-L为监测对象，探讨其在急性排斥反应中表达变化的意义。
资料和方法
一、监测对象及分组
接受同种异体肾移植术患者33例，男21例，女12例。平均年龄37岁。原发病为慢性肾小球肾炎、糖尿病、多囊肾等所致的慢性肾功能衰竭、尿毒症。手术前行血液透析8～19个月。供肾取自新鲜尸体，供受者ABO血型相容，淋巴细胞毒性试验小于10%。术后抗淋巴细胞球蛋白、环孢素A(CsA)、硫唑嘌呤、泼尼松顺序用药抗排斥治疗。术后15天内无临床排斥反应症状者，列入肾功稳定组，共24例；出现排斥反应症状且血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)升高，血CsA浓度正常者，列入排斥反应组，共9例。
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二、外周血淋巴细胞选凝素-L表达测定
1.标本采集：分别于肾移植术前1天，术后3、6、9、15天抽取患者静脉血1ml，常规肝素抗凝。
2.单克隆抗体及标记物：选凝素-L的单克隆抗体为Dreg56，其特异性识别的抗原相对分子质量为75000～85000，标记物为FITC，由Coulter公司提供。
3.流式细胞仪血液单细胞样品制备：抗凝全血50μl，加结合型单抗10μl。25℃孵育10min。加PBS缓冲液320μl，300×g离心5min后，弃上清液，再加320μlPBS缓冲液，上机检测。
4.流式细胞仪检测：应用流式细胞仪(Elite Conlter Corporation,USA)常规检测方法。检测细胞数为5000个，结果以荧光标记阳性细胞占被测细胞百分率表示。
, 百拇医药
三、统计学处理
莸取数据以均数±标准差表示，采用t检验，P<0.05为显著性标准。
结 果
肾功稳定组术后移植肾功能逐渐恢复，每日尿量>2000ml，血Cr、BUN渐降低。排斥反应组术后4～6天开始尿量减少，血Cr、BUN同步升高，血CsA浓度正常，诊断为急性排斥反应。经治疗1～3天尿量恢复每日2000ml以上，血Cr、BUN逐渐降低。
选凝素-L监测结果见表1。
表1 肾移植前后淋巴细胞表面选凝素-L的表达水平(%)
组别
例数
术前
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术 后
1～3d
4～6d
7～9d
10～15d
稳定组
24
42.5±9.8*
31.5±14.5
36.5±12.7
42.0±15.3*
53.8±15.7*
, 百拇医药
排斥组
9
44.9±11.2*
31.3±10.5
49.1±13.8*#
48.8±16.2*
43.5±11.1*△
*与术后3d比较，P<0.05；#与同期稳定组比较，P<0.05；△与同期稳定组比较，P<0.05讨 论
同种异体肾移植所致的急性排斥反应中，移植肾组织中最早出现的浸润细胞主要是淋巴细胞，表明淋巴细胞介导的细胞免疫在急性排斥反应中起主要作用[1]。近年来的研究还证明，各种粘附分子是淋巴细胞与血管内皮细胞粘附进而浸润移植肾的直接、必要参与者[2-4]。由此可见粘附分子在排斥反应过程中所起的重要作用。
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既往对粘附分子表达情况与肾移植排斥反应关系的研究主要集中在移植肾组织中的表达情况，发现粘附分子在正常肾细胞和移植肾组织中表达的明显区别，有助于排斥反应的诊断。然而，关于粘附分子在移植肾排斥反应的主要免疫效应细胞--淋巴细胞表面的表达研究，国内尚未见报道。我们以选凝素-L为研究对象，采用单克隆抗体-流式细胞仪荧光免疫技术，动态观察其在肾移植受者外周血淋巴细胞表面的表达情况，并对其意义进行探讨。
选凝素-L是粘附分子选凝素家族的一分子，主要表达在白细胞表面，其他细胞很少表达，可以在血流状态下介导白细胞与血管内皮细胞的起始粘附，即介导白细胞沿血管壁的滚动。它的作用的发挥，是白细胞浸润移植组织的先决条件之一[5]。
选凝素-L在淋巴细胞表达水平动态检测结果显示：排斥反应时，排斥组的表达与稳定组比较明显升高。选凝素-L表达水平显著增高与排斥反应发生的这种一致性结果，提示可以将选凝素-L的表达水平作为肾移植排斥反应的诊断指标。
, 百拇医药
另外，监测还发现稳定组和排斥组在肾移植术后3天内，选凝素-L的表达水平较术前减低。这种与应用免疫抑制剂同步出现的低表达状态，可能是免疫抑制剂对选凝素-L表达的抑制作用，提示抑制选凝素-L表达可能是免疫抑制剂防止排斥反应发生的作用机制之一。体外实验发现，CsA可以抑制T淋巴细胞与内皮细胞的粘附，并证实CsA是通过抑制粘附分子的表达来实现这种作用的[6，7]，这一结果支持我们对术后选凝素-L表达降低的原因分析。
至于稳定组在术后表达较低水平以后，没有维持在这一水平上，而是有逐渐升高的趋势，至术后10～15天时，表达水平已经高于排斥组同期水平，这一现象可能与稳定组逐渐减少免疫抑制剂用量，而排斥组逐渐增加免疫抑制剂用量有关。
本课题受国家自然科学基金资助(39570200)
参考文献
1，毕爱华.医学免疫学.第1版.北京:人民军医出版社.1996,253-254.
, http://www.100md.com
2，Mampaso F,Marcen R,Molina A,et al.Expression of adhesion molecules in allog raft renal dysfunction:a distinct diagnostic pattern in rejection and cyclospori ne nephrotoxicity.Transplant Proc,1994,26∶2859-2860.
3，Kauppinen H,Soots A,Krogerus L,et al.Different expression of adhesion molec ules ICAM-1 and VCAM-1 and activation markers MHC class Ⅱand IL-2R in acute and chronic rejection of rat kidney allografts.Transplant Proc,1997,29∶3150-31 51.
, http://www.100md.com
4，Hauser IA,Riess R,Hansknecht B,et al.Expression of cell adhesion molecules in primary renal disease and renal allograft rejection.Nephrol Dial Transplant,1 997,12∶1122-1131.
5，Fuggle SV,Dicken DH.Cell adhesion molecules in clinical renal transpla ntation.Transplantation,1998,65∶763-769.
6，De Caterina R,Tanaka H,Nakagawa T,et al.The direct effect of injectable cyc losporine and its vehicle,cremophor,onendothelial vascular cell adhesion molecul e-1 expression:ricinoleic acid inhibits coronary artery endothelial activation .Transplantation,1995,60∶270-275.
7，Frishberg Y,Meyers C,Kelly CJ.Cyclosporine A regulates T cell-epithelial cel l adhesion by altering LFA-1 and Icam-1 expression.Kidney Int,1996,50∶45-53.
(收稿日期：1999-10-29), 百拇医药