脑源性神经营养因子与中枢神经修复再生
作者：姜晓丹综述 宋文光 徐如祥 李铁林审校
单位：510282广州第一军医大学珠江医院
关键词：
临床神经病学杂志000434 神经营养因子在保护神经元存活并促进其突起生长发育过程中，常出现基因表达的时相变异,对不同种类的神经元有明显的作用选择性。脑源性神经营养因子(BDNF)作为神经营养因子家族中的一员,广泛分布于大脑中，是一类可促进运动神经元、感觉神经元、基底节前脑胆碱能神经元、皮层神经元、海马神经元、多巴胺能神经元等的存活和生长发育并能防止它们受损死亡，改善神经元病理状态、促进受损伤神经元再生及分化成熟等生物效应的多肽或蛋白质,在中枢神经系统(CNS)的损伤修复中具有重要的作用。本文就其理化性质、生物学特性及在中枢神经修复与再生中的作用等进行综述。
1 理化性质
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1.1 分子量及分子结构 BDNF是Barde等1982年从猪脑中分离纯化的一种碱性蛋白,分子量为12.3KD,等电点为10,因其来源于脑组织,并可维持鸡胚感觉神经元的体外存活、促使其神经元出芽而被命名[1]。由1.5千克的猪脑中可提取该因子1 mg,其生物活力为0.4 ng/ml.unit。BDNF有两种不同的前体形式,分别是长链和短链前体,目前已知短链前体由249个氨基酸组成[2]。1989年，Leibroch 等人用鼠cDNA探针和Northern Blot方法分析发现,脑内存在着BDNF的mRNA,证实了中枢神经可以合成BDNF;同时发现BDNF与已知的神经生长因子(NGF)结构上有着极其相似的氨基酸序列及相互关联的生物学活性,表现为二者的肽链均由大约120个氨基酸组成 (约有55%～60%的氨基酸同源序列),其中的6个恒定的半胱氨酸残基可形成维持BDNF、NGF生物活性所必需的三对二硫键。由此提出,BDNF与NGF同为一个基因家族,并与后来以PCR技术鉴定克隆出的NT-3、NT-4和NT-5一起被统称为“神经营养素家族”[3,4]。以T-载体克隆法对人BDNF全长基因PCR产物克隆及基因序列分析显示,人BDNF基因全长共744bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG[5]。BDNF所诱导的突触增强作用由cAMP介导的门控系统来调节[6]。
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1.2 分布及来源 BDNF主要由脑组织合成,主要分布于CNS中。用BDNF mRNA分析技术表明,BDNF在脑中主要分布在海马和皮质,也存在于纹状体中。Wetmore等人[7]在实验中发现,海马有能与BDNF特异结合的编码trKB基因高度表达,海马锥体细胞核中有BDNF的存在;BDNF mRNA 在海马锥体细胞、齿状回的颗粒细胞和皮质表现为阳性分布;在杏仁核、扣带回和内嗅皮质也散在分布着BDNF mRNA阳性细胞;由于基底神经核、中隔区、斜角带核内的胆碱能神经元胞浆中可见到BDNF而无BDNF mRNA表达,推测BDNF主要是在海马合成,之后被逆行运输到内侧隔区和斜束核、从新皮质逆行到基底神经核细胞，对相应部位的神经元起支持、 营养和分化作用,同时也有BDNF被运输至海马神经元核中,反馈调节BDNF的合成。研究显示,海马中BDNF mRNA是由谷氨酰胺能和γ-氨基丁酸能神经元的活动来调节的: 阻断谷氨酰胺受体或激活γ-氨基丁酸能神经元,可降低海马、中隔中的BDNF mRNA水平[8]。
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BDNF也存在于CNS的上丘及周围组织中。损伤后神经断端远侧部有较多的BDNF,提示雪旺氏细胞等支持细胞是应激状态下周围神经组织BDNF增多的主要来源。此外,Yamamoto等(1990) 证实,人类血小板中也含有BDNF,对于神经损伤部位的周围感觉神经元再生提供了一个重要来源。
2 生物学特性及在中枢神经修复与再生中的作用
神经营养素家族的生物学效应依神经细胞膜上适当的受体-酪氨酸蛋白激酶(trK)A、B、C来表达,trK B能与BDNF、NT-3和NT-4结合而活化,trK A结合NGF及NT-3 ,trK C则主要与NT-3结合发挥作用。BDNF结合trK B受体所体现出来的生物学效应主要表现如下。
2.1 促进胚胎神经元发育分化成多巴胺(DA)能神经细胞,维持DA能神经元存活 对BDNF研究较多的是它在阿尔茨海默病(AD)病理改变和在帕金森病(PD)中的神经元保护效应及对病理行为的改善作用。Hofer和Knusel等分别认为,BDNF是一种允许特殊神经元存活的因子,它可刺激胆碱能神经元的存活和分化、增加多巴胺(DA)摄取活性。在CNS中,BDNF对基底胆碱能神经元、GABA能神经元、中脑黑质DA能神经元均有营养作用,在中脑黑质DA能神经元的发育过程中起重要作用。发育中的CNS,其早期神经元在不同发展阶段总会产生相应的神经递质类型及其受体,周围环境(如化学、体液和细胞间的相互作用等)可决定发育过程中神经元选择表现型[2]。将BDNF (50～150 ng/ml)加入种植培养的胚鼠大脑皮质细胞,可见到分泌酪氨酸羟化酶的培养细胞增加迅速,表明神经递质可通过自身调节和相互间作用来调节未成熟神经元对神经递质类型的选择,而BDNF对多种胚胎神经元的发育既有多方面的作用,又有一定的选择作用，可以说BDNF是中枢多巴胺能神经元存活、生长和分化中的关键因素之一。Jin等[9]在关于BDNF、NGF对AD模型鼠脑移植区胆碱能神经元发育生长调控的研究中发现，BDNF和NGF一样，能促进AD模型鼠行为改善和移植区胚胆碱能神经元的发育生长；若对胚脑移植分别加用BDNF、NGF以及BDNF+NGF、并以单纯胚脑移植对照作脑功能改善效应结果的比较分析，发现BDNF和NGF联合使用比单独使用一种因子更为有效。Chen等[10]以实验表明,构建表达载体pCMV4-hBDNF,用脂质体方法转染COS7细胞、 BDNF抗体免疫组化方法检测可见有BDNF在COS7细胞中表达,所表达的hBDNF蛋白分泌至胞外并促进脑黑质细胞的发育、生长、存活和分化。以BDNF基因疗法治疗Parkinson病发现， BDNF还能促进轴突生长、防止DA能神经元退化[11]。
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2.2 提高神经元的生物活性,减少损伤后神经元的自然死亡 神经损伤后,影响再生的因素除局部及靶器官的某些反应产物外,邻近非神经元细胞、传入纤维的末梢及远近组织所释放的激素、营养物质、代谢产物等,均可通过局部扩散或血液循环到达损伤部位,影响神经再生过程。
BDNF不但对多种神经元的发育分化和生长再生具有维持和促进作用,也能通过为损伤神经元提供营养而挽救CNS损伤的运动神经元和感觉神经元。Fawcett等[12]提出,BDNF是CNS的一种由去甲肾上腺素能神经元合成的顺行性神经营养因子。为了检测BDNF的功能重要性,实验中以多巴胺β羟化酶(DβH)作为去甲肾上腺素能神经元的标记物,分析了携带有DβH-BDNF基因转基因鼠的trK B酪氨酸激酶活性。发现在DβH-BDNF转基因鼠去甲肾上腺素能神经元中BDNF的合成增加,可以提高生后大鼠的新皮质这一去甲肾上腺素能靶区的trK B酪氨酸激酶活性;对新生鼠的面神经这一第二个去甲肾上腺素能靶区进行了BDNF功能检测,以进一步证实去甲肾上腺素能神经元表达的BDNF顺行性地调节着神经元的存活,发现若同时使对照组及转基因组的新生鼠面神经损伤,1周后,对照组大鼠的面神经神经元有72%缺失,而在DβH-BDNF转基因鼠中,去甲肾上腺素能神经元的缺失仅为30%～35%。表明BDNF由去甲肾上腺素能神经元分泌并激活靶区的trK B、致靶神经元存活和分化,即存在有自去甲肾上腺素能神经元向其纤维及其末梢的顺行性转运,并通过对受损伤神经元提供营养而挽救损伤的神经元。
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Tuszynski等[13]将NGF转基因成纤维细胞移植到未受损伤的成年鼠脊髓T7段，发现有大量CGRP标记的感觉神经纤维长入移植体，为转基因细胞在未来的神经再生和神经移植研究奠定了基础。最近又有Murray等[14]发现,若将经基因工程处理过的可产生BDNF的初级成纤维细胞移植入颈段脊髓半切腔中,1～2个月后再用荧光金逆行束路追踪及生物素化葡聚糖右旋糖苷胺顺行束路追踪技术对红核脊髓束再生情况进行检测,可以发现在逆行束路追踪实验中,移植物尾侧至少有3～4节段红核脊髓束中出现大约7%的神经元轴突再生;顺行束路追踪实验的红核脊髓束轴突穿行或围绕于移植物再生,并在移植物尾侧的白质内长距离生长、终止于脊髓灰质这一红核脊髓束轴突的正常靶。而对未经基因工程处理过的初级成纤维细胞单独进行移植颈段脊髓半切腔内移植,则不诱导神经再生。这些发现为成年哺乳动物CNS损伤后修复再生及转基因治疗大脑变性疾病研究等均提供了广阔的应用前景。
对于感觉神经元,BDNF与NGF亦有协同营养作用,即感觉神经元通过中枢突获得BDNF而通过背根节的周围突获得NGF[10]。在体外实验中,BDNF可通过减少神经元死亡(而非促进增殖)这一营养方式来维持游离种植的鸡胚感觉神经元存活并促使其轴突生长。除了营养发育早期的感觉神经元,BDNF也经营养因子受体trK B来介导对成熟感觉神经元的营养作用。
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2.3 其它功效 BDNF能维持前庭神经核、三叉神经感觉神经元的功能及胚胎视网膜神经节细胞的存活[15]。BDNF的这种功能具有选择性,应用其同家族的NGF则未发现类似功能。以分子生物学手段实验性破坏基因致使BDNF缺失,发现前庭神经核及三叉神经节的体积分别缩小90%及40%;动物尚有运动及平衡失调出现。
3 小结
BDNF是一种主要由脑组织合成、能够维持CNS多种神经元(尤其是DA能神经元)存活及促进神经纤维生长的碱性蛋白。大脑皮质、海马及纹状体为BDNF的主要分布区域。应用BDNF特别是BDNF转基因细胞,可增加体内外DA能神经元活力，替代内源性营养因子激发神经损伤后CNS神经元的代谢改变,对于治疗帕金森病及促进CNS神经轴突的成功再生具有广阔的应用前景。
参考文献
1，Christiane AL,Lars O,Ted E,et al. Science,1988,240:1339
, http://www.100md.com
2，Chen Q and Zhu Jiakai.Forei. Med.Sci.Sec.Traum. Surg,1996,17:195
3，Gan S.Adv.Physiol.Sci.1994,25:295
4，Peter CM,Leonardo B,Stephen S,et al. Science,1990,247:1446
5，Yu Y,Chen Q,Zhao B,et al. Bull. Acad. Mil. Sci. 1996,20: 8
6，Jiang X,Song W,Cai Y,et al.VS Chin J Int.Med,1999,1:21
7，Wetmore C,Cao YH,Pettersson RF,et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991,88:9843
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8，Gafra F,Castren E,Thoenen H,et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991,88:10037
9，Jin G,Xu H,Wu Y,et al. Acta Anato Sinica,1999,30:107
10，Chen.Q,Wang J,Fan M. Transac. Biolchem. Biophysic,1997,29:419
11，Kang UJ. Mov Disord,1998,13: 59
12，Fawcett JP,Bamji SX,Causing CG,et al. J Neurosci,1998,18:2808
13，Toszynski MH,Gabriel K,Gage FH,et al. Exp Neurol,1996,137: 157
14，Liu Y,Kim D,Himes BT,et al. J Neurosci,1999,19:4370
15，Conover JC,Saika T,Soppet D,et al. Nature,1994,375: 235
(收稿1999-09-28), 百拇医药
单位：510282广州第一军医大学珠江医院
关键词：
临床神经病学杂志000434 神经营养因子在保护神经元存活并促进其突起生长发育过程中，常出现基因表达的时相变异,对不同种类的神经元有明显的作用选择性。脑源性神经营养因子(BDNF)作为神经营养因子家族中的一员,广泛分布于大脑中，是一类可促进运动神经元、感觉神经元、基底节前脑胆碱能神经元、皮层神经元、海马神经元、多巴胺能神经元等的存活和生长发育并能防止它们受损死亡，改善神经元病理状态、促进受损伤神经元再生及分化成熟等生物效应的多肽或蛋白质,在中枢神经系统(CNS)的损伤修复中具有重要的作用。本文就其理化性质、生物学特性及在中枢神经修复与再生中的作用等进行综述。
1 理化性质
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1.1 分子量及分子结构 BDNF是Barde等1982年从猪脑中分离纯化的一种碱性蛋白,分子量为12.3KD,等电点为10,因其来源于脑组织,并可维持鸡胚感觉神经元的体外存活、促使其神经元出芽而被命名[1]。由1.5千克的猪脑中可提取该因子1 mg,其生物活力为0.4 ng/ml.unit。BDNF有两种不同的前体形式,分别是长链和短链前体,目前已知短链前体由249个氨基酸组成[2]。1989年，Leibroch 等人用鼠cDNA探针和Northern Blot方法分析发现,脑内存在着BDNF的mRNA,证实了中枢神经可以合成BDNF;同时发现BDNF与已知的神经生长因子(NGF)结构上有着极其相似的氨基酸序列及相互关联的生物学活性,表现为二者的肽链均由大约120个氨基酸组成 (约有55%～60%的氨基酸同源序列),其中的6个恒定的半胱氨酸残基可形成维持BDNF、NGF生物活性所必需的三对二硫键。由此提出,BDNF与NGF同为一个基因家族,并与后来以PCR技术鉴定克隆出的NT-3、NT-4和NT-5一起被统称为“神经营养素家族”[3,4]。以T-载体克隆法对人BDNF全长基因PCR产物克隆及基因序列分析显示,人BDNF基因全长共744bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG[5]。BDNF所诱导的突触增强作用由cAMP介导的门控系统来调节[6]。
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1.2 分布及来源 BDNF主要由脑组织合成,主要分布于CNS中。用BDNF mRNA分析技术表明,BDNF在脑中主要分布在海马和皮质,也存在于纹状体中。Wetmore等人[7]在实验中发现,海马有能与BDNF特异结合的编码trKB基因高度表达,海马锥体细胞核中有BDNF的存在;BDNF mRNA 在海马锥体细胞、齿状回的颗粒细胞和皮质表现为阳性分布;在杏仁核、扣带回和内嗅皮质也散在分布着BDNF mRNA阳性细胞;由于基底神经核、中隔区、斜角带核内的胆碱能神经元胞浆中可见到BDNF而无BDNF mRNA表达,推测BDNF主要是在海马合成,之后被逆行运输到内侧隔区和斜束核、从新皮质逆行到基底神经核细胞，对相应部位的神经元起支持、 营养和分化作用,同时也有BDNF被运输至海马神经元核中,反馈调节BDNF的合成。研究显示,海马中BDNF mRNA是由谷氨酰胺能和γ-氨基丁酸能神经元的活动来调节的: 阻断谷氨酰胺受体或激活γ-氨基丁酸能神经元,可降低海马、中隔中的BDNF mRNA水平[8]。
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BDNF也存在于CNS的上丘及周围组织中。损伤后神经断端远侧部有较多的BDNF,提示雪旺氏细胞等支持细胞是应激状态下周围神经组织BDNF增多的主要来源。此外,Yamamoto等(1990) 证实,人类血小板中也含有BDNF,对于神经损伤部位的周围感觉神经元再生提供了一个重要来源。
2 生物学特性及在中枢神经修复与再生中的作用
神经营养素家族的生物学效应依神经细胞膜上适当的受体-酪氨酸蛋白激酶(trK)A、B、C来表达,trK B能与BDNF、NT-3和NT-4结合而活化,trK A结合NGF及NT-3 ,trK C则主要与NT-3结合发挥作用。BDNF结合trK B受体所体现出来的生物学效应主要表现如下。
2.1 促进胚胎神经元发育分化成多巴胺(DA)能神经细胞,维持DA能神经元存活 对BDNF研究较多的是它在阿尔茨海默病(AD)病理改变和在帕金森病(PD)中的神经元保护效应及对病理行为的改善作用。Hofer和Knusel等分别认为,BDNF是一种允许特殊神经元存活的因子,它可刺激胆碱能神经元的存活和分化、增加多巴胺(DA)摄取活性。在CNS中,BDNF对基底胆碱能神经元、GABA能神经元、中脑黑质DA能神经元均有营养作用,在中脑黑质DA能神经元的发育过程中起重要作用。发育中的CNS,其早期神经元在不同发展阶段总会产生相应的神经递质类型及其受体,周围环境(如化学、体液和细胞间的相互作用等)可决定发育过程中神经元选择表现型[2]。将BDNF (50～150 ng/ml)加入种植培养的胚鼠大脑皮质细胞,可见到分泌酪氨酸羟化酶的培养细胞增加迅速,表明神经递质可通过自身调节和相互间作用来调节未成熟神经元对神经递质类型的选择,而BDNF对多种胚胎神经元的发育既有多方面的作用,又有一定的选择作用，可以说BDNF是中枢多巴胺能神经元存活、生长和分化中的关键因素之一。Jin等[9]在关于BDNF、NGF对AD模型鼠脑移植区胆碱能神经元发育生长调控的研究中发现，BDNF和NGF一样，能促进AD模型鼠行为改善和移植区胚胆碱能神经元的发育生长；若对胚脑移植分别加用BDNF、NGF以及BDNF+NGF、并以单纯胚脑移植对照作脑功能改善效应结果的比较分析，发现BDNF和NGF联合使用比单独使用一种因子更为有效。Chen等[10]以实验表明,构建表达载体pCMV4-hBDNF,用脂质体方法转染COS7细胞、 BDNF抗体免疫组化方法检测可见有BDNF在COS7细胞中表达,所表达的hBDNF蛋白分泌至胞外并促进脑黑质细胞的发育、生长、存活和分化。以BDNF基因疗法治疗Parkinson病发现， BDNF还能促进轴突生长、防止DA能神经元退化[11]。
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2.2 提高神经元的生物活性,减少损伤后神经元的自然死亡 神经损伤后,影响再生的因素除局部及靶器官的某些反应产物外,邻近非神经元细胞、传入纤维的末梢及远近组织所释放的激素、营养物质、代谢产物等,均可通过局部扩散或血液循环到达损伤部位,影响神经再生过程。
BDNF不但对多种神经元的发育分化和生长再生具有维持和促进作用,也能通过为损伤神经元提供营养而挽救CNS损伤的运动神经元和感觉神经元。Fawcett等[12]提出,BDNF是CNS的一种由去甲肾上腺素能神经元合成的顺行性神经营养因子。为了检测BDNF的功能重要性,实验中以多巴胺β羟化酶(DβH)作为去甲肾上腺素能神经元的标记物,分析了携带有DβH-BDNF基因转基因鼠的trK B酪氨酸激酶活性。发现在DβH-BDNF转基因鼠去甲肾上腺素能神经元中BDNF的合成增加,可以提高生后大鼠的新皮质这一去甲肾上腺素能靶区的trK B酪氨酸激酶活性;对新生鼠的面神经这一第二个去甲肾上腺素能靶区进行了BDNF功能检测,以进一步证实去甲肾上腺素能神经元表达的BDNF顺行性地调节着神经元的存活,发现若同时使对照组及转基因组的新生鼠面神经损伤,1周后,对照组大鼠的面神经神经元有72%缺失,而在DβH-BDNF转基因鼠中,去甲肾上腺素能神经元的缺失仅为30%～35%。表明BDNF由去甲肾上腺素能神经元分泌并激活靶区的trK B、致靶神经元存活和分化,即存在有自去甲肾上腺素能神经元向其纤维及其末梢的顺行性转运,并通过对受损伤神经元提供营养而挽救损伤的神经元。
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Tuszynski等[13]将NGF转基因成纤维细胞移植到未受损伤的成年鼠脊髓T7段，发现有大量CGRP标记的感觉神经纤维长入移植体，为转基因细胞在未来的神经再生和神经移植研究奠定了基础。最近又有Murray等[14]发现,若将经基因工程处理过的可产生BDNF的初级成纤维细胞移植入颈段脊髓半切腔中,1～2个月后再用荧光金逆行束路追踪及生物素化葡聚糖右旋糖苷胺顺行束路追踪技术对红核脊髓束再生情况进行检测,可以发现在逆行束路追踪实验中,移植物尾侧至少有3～4节段红核脊髓束中出现大约7%的神经元轴突再生;顺行束路追踪实验的红核脊髓束轴突穿行或围绕于移植物再生,并在移植物尾侧的白质内长距离生长、终止于脊髓灰质这一红核脊髓束轴突的正常靶。而对未经基因工程处理过的初级成纤维细胞单独进行移植颈段脊髓半切腔内移植,则不诱导神经再生。这些发现为成年哺乳动物CNS损伤后修复再生及转基因治疗大脑变性疾病研究等均提供了广阔的应用前景。
对于感觉神经元,BDNF与NGF亦有协同营养作用,即感觉神经元通过中枢突获得BDNF而通过背根节的周围突获得NGF[10]。在体外实验中,BDNF可通过减少神经元死亡(而非促进增殖)这一营养方式来维持游离种植的鸡胚感觉神经元存活并促使其轴突生长。除了营养发育早期的感觉神经元,BDNF也经营养因子受体trK B来介导对成熟感觉神经元的营养作用。
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3 小结
BDNF是一种主要由脑组织合成、能够维持CNS多种神经元(尤其是DA能神经元)存活及促进神经纤维生长的碱性蛋白。大脑皮质、海马及纹状体为BDNF的主要分布区域。应用BDNF特别是BDNF转基因细胞,可增加体内外DA能神经元活力，替代内源性营养因子激发神经损伤后CNS神经元的代谢改变,对于治疗帕金森病及促进CNS神经轴突的成功再生具有广阔的应用前景。
参考文献
1，Christiane AL,Lars O,Ted E,et al. Science,1988,240:1339
, http://www.100md.com
2，Chen Q and Zhu Jiakai.Forei. Med.Sci.Sec.Traum. Surg,1996,17:195
3，Gan S.Adv.Physiol.Sci.1994,25:295
4，Peter CM,Leonardo B,Stephen S,et al. Science,1990,247:1446
5，Yu Y,Chen Q,Zhao B,et al. Bull. Acad. Mil. Sci. 1996,20: 8
6，Jiang X,Song W,Cai Y,et al.VS Chin J Int.Med,1999,1:21
7，Wetmore C,Cao YH,Pettersson RF,et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991,88:9843
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8，Gafra F,Castren E,Thoenen H,et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991,88:10037
9，Jin G,Xu H,Wu Y,et al. Acta Anato Sinica,1999,30:107
10，Chen.Q,Wang J,Fan M. Transac. Biolchem. Biophysic,1997,29:419
11，Kang UJ. Mov Disord,1998,13: 59
12，Fawcett JP,Bamji SX,Causing CG,et al. J Neurosci,1998,18:2808
13，Toszynski MH,Gabriel K,Gage FH,et al. Exp Neurol,1996,137: 157
14，Liu Y,Kim D,Himes BT,et al. J Neurosci,1999,19:4370
15，Conover JC,Saika T,Soppet D,et al. Nature,1994,375: 235
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