去松果体对大鼠学习能力及大脑皮质NOS表达的影响
作者：徐斌 陈俊抛 林煜 王为 刘辉 高曲文
单位：徐斌 陈俊抛 林煜 王为(510282广州第一军医大学附属珠江医院神经内科)；刘辉(大连医科大学生理教研室)；高曲文(广州军区总医院老年四科)
关键词：松果体；记忆；一氧化氮
临床神经病学杂志000401 【摘要】 目的 探讨去松果体后其功能减退致褪黑素(MT)分泌减少对大鼠学习能力及大脑皮质一氧化氮合酶(NOS)表达的影响。方法 将大鼠进行Y型迷宫测试，淘汰学习障碍的大鼠，将学习正常的大鼠随机分二组，实验组手术摘除松果体，对照组给予假手术，饲养40天后再行Y型迷宫测试，SABC法检测神经元型一氧化氮合酶(nNOS)表达。结果 实验组大鼠学习能力明显低于对照组大鼠(P<0.01)，而大脑皮质、内侧隔核-斜角带核(SM-DB)nNOS免疫反应阳性细胞增多，与对照组相比分别为P<0.05、P<0.01，纹状体、海马与对照组相比nNOS阳性细胞无明显差别，均P>0.05。结论 大鼠松果体摘除可以引起大鼠学习能力障碍，其原因可能与大脑皮质、SM-DB nNOS过度表达，引起NO神经毒性有关。
Effects of pinealectomy on the learning abilities
and the expression of nitric oxide synthase
in cerebral cortex of rats
Xu Bin，Chen Junpao，Lin Yu
(Department of Neurology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of decreased secretion of melatonin(MT) caused by pinealectomy on the learning abilities and the expression of nitric oxide synthase (NOS) in cerebral cortex of rats.Methods The rats were divided into two groups randomly after tested by Y-type maze and those with learning dysfunction were eliminated,the experimental group was treated by pinealectomy, the control group was given sham operation. The rats were tested by Y-type maze after fed for forty days and the expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) was tested by SABC method.Results The learning abi-lities of the experimental group were significant lower than those of the control rats (P<0.01), nNOS positive cell in neocortex and medial septal nucleus-diagonal band nucleus (SM-DB) were more than that of control rats (P<0.05 and P<0.01 respectively ),but there was no significant difference between the experimental group and the control rats in nNOS-positive cell quantity of corpus striatum and hippocampus (P>0.05).Conclusion Pinealectomy might cause the disorder of learning abilities in the rats,it might correlate with NO neurotoxicity arose by over expression nNOS in cerebral cortex and SM-DB.
【Key words】 Pineal Memory NO
近年来发现一氧化氮(NO)作为一种神经递质参与学习记忆过程，如NO与海马长时程增强的形成有关，但过量NO产生也可引起神经毒性作用[1]。一氧化氮合酶(NOS)是催化内源性NO的唯一酶类，催化L-精氨酸进行双氧化反应生成NO和L-胍氨酸。NOS分两类，原生型(cNOS)和诱导型(iNOS)，cNOS又分神经元型(nNOS)和内皮型(eNOS)，其中nNOS被认为可能和学习记忆有关，nNOS和iNOS过度表达与NO神经毒性有关，eNOS具有保护作用。近来发现褪黑素(MT)具有抗氧化、抗自由基作用以及生理剂量褪黑素可以抑制NOS活性[2]。在我们前期工作中发现去松果体可导致大鼠学习记忆能力下降，而NO/nNOS和学习记忆有密切关系，似乎MT减少、学习记忆和NO/nNOS三者存在矛盾。为此，我们通过摘除大鼠松果体，观察大鼠学习能力及皮质nNOS表达，初步探讨MT减少对大鼠学习能力及nNOS表达影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 雄性SD大鼠(第一军医大学实验动物中心提供)，体重190～210 g，鼠龄6周，首先将大鼠进行Y型迷宫测试，淘汰学习障碍者，将学习正常SD大鼠12只随机分两组，实验组和对照组各6只，置隔音环境中，11小时光照(8∶30～19∶30)，13小时黑暗(19∶30～8∶30)，自由摄食、饮水，适应3天后行手术。实验组行松果体摘除术，对照组行假手术，手术时间均放在19∶30～22∶30，每次手术做1只实验组大鼠和1只对照组大鼠，术后单独饲养，7天后实验组与对照组分放，继续饲养33天。
1.2 方法
1.2.1 学习能力测试 大鼠学习能力测试用三等分Y型迷宫进行。先将大鼠放入迷宫箱中，适应5分钟，使其对三臂均探索进入，然后从Ⅰ臂开始随机次序变换测试，给电压40V，延迟时间5秒。电击后大鼠逃避至安全区为正确反应，否则为错误反应。每测1次休息30秒，测10次休息5分钟。大鼠学习成绩以连续10次测试中有9次(9/10)正确反应时，所需电击数表示。每次测试均放在20∶00～23∶00进行。第一次测试时，如连续30次未跑正确者将其淘汰，手术后40天再测试时，如连续30次未跑正确者按30次计算。
1.2.2 动物模型和免疫组化 松果体摘除参考Kuszak等[3]报道的方法。对照组以相同步骤进行，但不摘除松果体。手术40天后用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，暴露心脏，通过左心室插管至主动脉，生理盐水100～150 ml冲洗，4%多聚甲醛溶液150 ml快速灌注，250 ml慢滴，2小时后取脑，在前囟处标记，4%多聚甲醛溶液固定4小时，置30%蔗糖溶液(4℃)至沉底，在标记点前1.6 mm～标记点后4.6 mm范围内做冰冻冠状连续切片，厚度50 μm，每隔200 μm取4张分套，1张用0.01M pH7.4PBS接片，0.3%甲醇过氧化氢封闭内源性过氧化氢酶，0.3% TritonX100 37℃处理30分钟，ABB封闭内源性生物素，切片入nNOS一抗(1∶100)4℃孵育72小时，入二抗室温下3小时，SABC室温反应2小时，DAB显色，明胶贴片，常规脱水、透明、封片。阴性对照以PBS代替nNOS一抗，余步骤相同。
1.2.3 统计方法 大鼠学习能力以大鼠学习成绩表示；皮质nNOS表达以每只大鼠随机取相同部位的3张切片，共计6张切片，光镜下分别随机选右侧皮质、SM-DB、纹状体、海马区各部位相邻4个视野(×400)，统计nNOS阳性细胞数，取每个视野的均数及标准差。用SPSS 8.0统计软件包做t检验。
2 结 果
2.1 学习能力 从Y型迷宫实验结果可以看出，术前实验组大鼠学习能力(14.67±4.97次)与对照组(14.33±4.32次)基本一致(P>0.05)，松果体摘除40天后大鼠学习能力(28.67±2.42次)比术前自身对照及术后假手术组(13.83±8.33次)对照明显下降(P<0.01)，所需电击次数明显增加，表明大鼠松果体摘除40天后学习能力下降。
2.2 不同脑区nNOS表达 实验组大鼠大脑皮质含有较多nNOS阳性细胞数，并以体感皮质稍多于运动皮质，nNOS阳性细胞形态各异，染色较深，轴突可贯穿数层，数量(5.9±0.68)比对照组(3.68±0.39)多(P<0.05)；SM-DB部nNOS阳性细胞数(16.21±2.03)明显多于对照组(9.32±1.05)(P<0.01)；海马部(4.27±0.75)、纹状体区(9.35±2.58)nNOS阳性细胞数与对照组(3.94±0.53和8.96±2.31)相比无明显差别(P>0.05)。实验组海马部nNOS阳性细胞大多染色较淡，细胞较小，但锥体细胞层有浓染的胞体大、轴突粗长nNOS阳性细胞，而对照组锥体细胞层nNOS阳性细胞轴突不显色，实验组和对照组纹状体区nNOS阳性细胞均染色深，突起丰富呈网状。
3 讨 论
NO作为一种特殊神经递质参与学习记忆过程，但NO具有双向作用，适量NO是学习记忆所必须的，如机体产生过多NO则会出现神经毒性作用。给大鼠脑室注射能自发性释放NO的硝普钠，较低剂量可以提高大鼠学习成绩，而注射较高剂量的硝普钠反使大鼠学习成绩下降，可能与NO释放过多产生神经毒性有关[4]。由于NO是小气体分子，在体内半衰期短，仅数秒，因此NO作用与NOS水平有关，目前认为nNOS和iNOS与NO神经毒性有关，iNOS为胶质细胞或巨噬细胞受刺激时表达产生。在人类星形胶质细胞是产生NO主要细胞。在生理条件下nNOS 和eNOS 即有表达，无需诱导，它们活性依赖于细胞内Ca2+升高以及钙调蛋白(CaM)的结合，细胞内Ca2+升高可迅速短暂激活它们，iNOS的活性不依赖于Ca2+和CaM，在生理状态下不表达，在多种细胞因子等刺激下，iNOS编码基因可被激活。生理条件下NO毒性可能与nNOS有关，对于NO在生理条件下如何完成生理功能同时又避免神经毒性的具体机理仍不详。 MT是一种主要由松果体分泌的神经内分泌激素，具有水溶性和高度脂溶性。除松果体外，视网膜、副泪腺、肠和唾液腺也分泌MT，但人类和哺乳类动物血中MT主要来源于松果体，其浓度呈昼夜节律变化，摘除松果体后血中浓度极低，节律波动消失。目前发现MT生理功能除作为大部分动物体内光周期信号外，还与抑制性成熟、增强免疫、抗衰老、抗氧化和淬灭自由基等有关。MT抗氧化作用不仅直接清除自由基，而且能促使抗氧化物酶表达，发挥间接抗氧化作用[5，6]，如增加超氧化物岐化酶(SOD)mRNA表达[7]。另外MT通过与CaM结合抑制 NOS活性，减少 NO生成。MT也可以刺激过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽还原酶(GPd)活性[8]。本实验中发现去松果体大鼠学习能力下降，nNOS在皮质、SM-DB表达增多，同时其它实验也发现去松果体大鼠皮质、海马乙酰胆碱脂酶(AChE)纤维密度减少(此处未示实验数据)。一般认为前脑基底部NO分泌与乙酰胆碱(Ach)分泌一致，NO可以调节ACh基础释放，NO释放增多，ACh也分泌增多，应用NOS抑制剂灌注脑组织，可使ACh基础释放减少40%[9]。但本实验结果发现去松果体后nNOS表达增多，而AChE却减少，与传统理论不一致，可能的解释是生理剂量MT抑制中枢系统NOS活性和表达，摘除大鼠松果体后致大鼠血液循环中MT极低，MT对中枢神经系统NOS抑制作用解除，致使NOS表达增多，活性增强，NO释放增多，长时间大量释放NO可产生神经毒性作用损害胆碱能神经元，使胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性降低，数量减少，从而影响ACh合成，由于ACh与学习记忆有关，ACh减少使大鼠学习能力降低。在基底前脑ChAT与AChE相一致，胆碱能神经元SM-DB及Meynert基底核发出纤维投射到大脑新皮质、海马，如这些部位胆碱能神经元受损伤，引起新皮质、海马ChAT活性降低和AChE阳性染色纤维减少。一般认为NOS阳性细胞同时ChAT染色阳性，而NOS阳性细胞能抵抗NO神经毒性，这与上述解释又相矛盾。但Thorns[10]在Alzheimer病(AD)病人内嗅区和海马通过nNOS和磷酸化tau免疫组化双标技术发现nNOS阳性细胞对神经变性更敏感，nNOS 可能与AD病理改变有关。
O'Mahony[11]将β-淀粉样蛋白(Aβ)注射到大鼠基底核诱发胆碱能神经元变性，发现依赖Ca2+和CaM的nNOS在Aβ神经毒性中起重要作用，nNOS活性增强与胆碱神经元变性相一致，推测NO/nNOS可能在部分Aβ神经毒性中起决定性作用。本实验室通过摘除大鼠松果体，微量Aβ海马注射，发现MT减少通过增强炎症反应加重Aβ神经毒性作用(此处未示实验数据)。临床研究发现AD病人血液中MT减少，节律消失[12]，以上研究提示AD患者MT减少不仅直接通过增强NO/nNOS神经毒性作用来损害胆碱能神经元，而且可协助Aβ通过增强NO/nNOS神经毒性以及其它途径加强对胆碱能神经元损害，从而影响学习记忆能力。
MT生理功能目前仍不很清楚，松果体摘除对大鼠学习能力影响以及NO/NOS在其中作用仍需作进一步研究。
参考文献
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2，王晓飞,刘知民,彭树勋. 褪黑素：一个多功能的光周期信号.生理科学进展,1998,29:281
3，Kuszak J, Rodin M.A new technique of pinealecomy for adult rats. Eexperientia,1977，33:283
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9，韩济生,关新民主编.医用神经生物学.武汉出版社出版,1996.145
10，Thorns V,Hansen L, Masliah E.nNOS expression neurons in the enthorhinal cortex and hippocampus are affected in patients with Alzheimer's disease. Exp Neurol,1998，150:14
11，O'Mahony S, Harkany T, Rensink AA.Beta-amyloid-induced cholinergic denervation correlates with enhanced nitric oxide synthase activity in rat cerebral cortex, reversal by NMDA receptor blockade.Brain Res Bull,1998，45:405
12，Uchida K, Okamoto N, Ohara K, et al.Daily rhythm of serum melatonin in patients with dementia of the degenerate.Brain Research,1996，717:154
(收稿2000-02-02 修回2000-04-20)