三七皂苷对大鼠缺血脑组织一氧化氮合酶表达的影响——免疫细胞化学与图像分析系统在免疫药理学研究中的应用
作者：邹玉安 魏阿平
单位：邹玉安(张家口医学院第一附属医院神经内科 075000) 魏阿平(儿科)
关键词：脑缺血；一氧化氮合酶；三七皂苷；免疫细胞化学；图像分析系统
脑与神经疾病杂志000402
摘 要 应用免疫细胞化学技术与图像分析系统研究三七皂苷的免疫药理学机制。正常组大鼠；实验组大鼠(左颈总动脉结扎并于术前4小时肌注三七皂苷，7mg/kg-1)与对照组大鼠(左颈总动脉结扎用等量生理盐水取代三七皂苷)各分4小时组、12小时组、24小时组。各组鼠大脑皮质、海马与尾壳核内神经元性一氧化氧合酶(nNOS)的含量用LSAB法与计算机数字图像分析系统检测。结果显示对照组大鼠海马、尾壳核与大脑皮质内nNOS含量显著下降，三七皂苷可恢复缺血脑组织的nNOS表达，并对缺血脑组织发挥保护作用。同时，本实验还提示免疫细胞化学技术与图像分析系统用于免疫药理学研究是可行的。
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Expression of neuronal nitric oxide synthase in rat ischemic brain modulated by notoginsenoside A comprehensive methods for the study of immrmopharmacology
Zou Yuan et al.
(Department of Neurology,First Affiliated Hospital,Zhang jiakou Medical College,Zhangjiakou 075000)
Abstract To understand the immunopharmacological mechanism of notoginsenoside,immunocytochemistry(LSAB)and image analysis system was employed in this experiment.Neuronal nitric oxide synthase (nNOS)was labelled and detected pualitariveoy and qualitatively in cercbral cortex,hippocampus and caudate putanen nuclei in normal rat brains ,ischemic rat brains (experimental group )in postischemic peridos of 4h,12h,24h,which the notoginsenosied was administered prior to the occlusion of left commoncarotid artery (LCA).Specimens for LSAB and image analysis were also collected from rats in control group at 4h,12h and 24h,after the occlusion of LCA without injection of notoginsenoside.The content of nNOS in cerbral cortex,hippocampus,and caudate putamen nuclei of control rat brains decresed remarkably when compared with normal rats.Intensity of positive reaction to antiNOS-Iin ischemic rats was simil ar to that of normal rat brains.The results indicated that notoginsenoside could promote the cexpression of nNOS at the early stage of ceredral ischemia and suggested that notoginseoside might play a protective role fro nervous tissue in ischemic rains.Also,it was proved to be possible that immynocytochemistry and image analysis system could be a powerful approaches in the research of immunopharmacology as well.
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Key word Cerebral ischemia Neuronal nitric oxide synthase \Notoginsenoside Immunocytochemistry Image analysis system
一氧化氮(Nitric oxide,NO)是新近发现的一种免疫分子，在神经功能调节与神经系统疾病的发生、发展中发挥着重大作用，NO现已成为国际神经科学领域的最新研究热点，其免疫药理学作用亦倍受关注。在本实验中我们将免疫细胞化学与图像分析系统应用于三七皂苷的免疫药理研究，获得了三七皂苷免疫药理学机制的新认识，并据此提出了“免疫细胞药理学”(immunocytopharmacology)这一新概念。本文拟将我们建立或改进的免疫细胞化学方法与图像分析系统在免疫药理学研究中的应用予以介绍，并对其应用前景作展望性分析。
材 料 与 方 法
一、实验动物
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老龄Wistar大鼠68只(标准CL级动物，约1.2岁，购自中国医学科学院实验动物繁育场)，体重350～500g，雌雄各半。将大鼠饲养在标准环境中，即室温28～30℃，相对湿度65～70%，照明度为280～350LX，光照节律为12小时明12小时暗，昼夜交替。标准日粮(购自北京医科大学实验动物室)，清洁饮水，自由饮食，雌雄分养。3日后按1∶1的雌雄比合笼，2日后用于本实验。
将实验大鼠分为正常组(8只)，实验组(30只)和对照组(30只)，雌雄各半。实验组和对照组又分为4h组、12h组和24h组，每组10只。
二、实验动物的处理
1.正常组大鼠用戊巴比妥钠麻醉(雄鼠33mg/kg-1体重，雌鼠30mg/kg-1体重，腹腔注射)，经左心室灌注4%多聚甲醛液进行全身固定，24h后取脑，用过乳头体后缘和视交叉后缘的两个冠状切面间脑片做实验材料，常规脱水，透明、Paraplast (购自Sigma公司)包埋。制备6μm冠状切片。
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实验组大鼠于复制脑缺血模型前4h注三七皂苷(昆明制药厂生产，批号950633-28，7mg/kg-1)，对照组大鼠则注射生理盐水。
2.脑缺血模型的复制： 参照Shibata等人的方法进行[1]。实验组与对照组 大鼠用戊巴比妥钠麻醉，并固定在解剖台上，颈腹侧剪毛，常规消毒，然后自胸骨柄前1cm处向吻侧做一2.5cm长纵切口，钝性分离胸乳突肌与肩胛舌骨肌，暴露左侧颈总动脉与迷走交感干，将二者分离开，顺势用0号丝线双重结扎颈总动脉，缝合皮肤，并扎绷带，尾号法标记。此即制成轻度脑缺血模型。
实验组和对照组分别于模型复制后4h、12h、与24h取脑，并按1的方法制备脑切片。
3.大脑皮质、海马与尾壳核内nNOS的免疫细胞化学标记
切片标本用改进的LSAB法进行nNOS的免疫细胞化学标记，主要步骤如下： 切片脱paraplast后复水，PBS冲洗5min×3，滴加10%正常小牛血清，室温下作用30min,倾去血清后迅速滴加兔抗大鼠nNOS多克隆抗体(购自Santa Cruz公司，工作浓度为1∶80)于湿盒内孵育，44℃过夜，PBS冲洗5min×3，滴加羊抗兔IgG-Bio(购自美国Zymed公司，工作浓度1∶60)，37℃于湿盒内孵育5min×3，滴加1%HRP Streptavidin工作液，37℃于湿盒内孵育30min，PBS 5min×3，DAB显色，镜下控制显色时间，自来水冲洗干净，常规脱水，透明，封片，普通光镜下观察。各组大鼠标本均设有阴性对照，即用生理盐水取代兔抗大鼠nNOS多克隆抗体，其余步骤同上。
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4.图像分析与统计学处理
图像分析在CMIAS001型真彩色图像分析系统(空军总医院生物医学工程研究所生产)中进行。
每只大鼠的海马(CA1区、CA2区与CA3区)、尾壳核与大脑皮质三个部位各取5张连续切片。由于神经元胞体形态不规则，故用手工分割法进行扫描采样。分析指标包括面积、直径、周长、圆度、平均灰度(Grey Level,GREV)与积分光密度(Intergratedoptical density,IOD)。
图像分析是一种数字图像处理技术。数字图像是由许多像素构成的，所谓像素是指在显示器屏幕上按“行”与“列”排列的点阵元素。每个像素都包含灰度信息(指二维平面上光能量分布的差异)和位置信息，这两种信息决定了图像的形态与灰度。IOD是指各个单独测到的像素光密度的总和，是图像分析仪的主要输出指标，故本实验用IOD值表示神经元内nNOS的含量。
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全部数据均用SAS软件包进行统计学处理。差异显著性用μ检验。
5.病理学观察
正常组、对照组与实验组脑切片做HE染色，观察比较大脑皮质、海马与尾壳核的组织结构特征。
结 果
本文用IOD值定量表示LSAB法标记nNOS实验结果。
1.正常组： IOD： 海马400.19±128.36，n=9，新大脑皮质479.38±150.04，n=7，尾壳核203.03±41.28，n=9。海马与尾壳核以及大脑皮质与尾壳核之间均存在显著差异(P<0.01)，但海马与大脑皮质间无显著差异(P>0.05)，说明海马与大脑皮质内神经元的nNOS含量相近，均高于尾壳核，见图1。
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图1 正常对照组海马、新皮质、尾壳核、积分光密度值
2.对照组与实验组大脑皮质、海马与尾壳核IOD的比较： 对照组分缺血4h、12h、24h三组，各组上述部位IOD与正常组间比较均有显著差异(P<0.01)，见图2。
3.正常组、对照组与实验组大脑皮质、海马与尾壳核IOD的比较： 将 各组大鼠脑的海马、尾壳核与大脑皮质的IOD值作为变量值，所得均值进行组间比较，并进行u检验，其结果反映缺血脑组织内nNOS含量的综合变化，并用以判断三七皂苷对缺血脑组织nNOS表达丰度的影响。三组大鼠海马、尾壳核与大脑皮质IOD比较的结果见图3。
图2 实验对照组不同缺血时间内各观察部位和正常对照组的积分光密度值的比较
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图3 正常组，对照组和三七皂苷组在不同缺血时间内积分光密度值的比较
4.病理学观察： 对照组大鼠海马、尾壳核与大脑皮质内的神经元多数出现空泡样变，而对照组右侧半球和实验组鼠脑两半球均与正常组大鼠海马、尾壳核及大脑皮质结构相近。
讨 论
一氧化氮在缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)中的作用是当今国际神经科学研究领域的热点之一。大量研究表明，在缺血早期(尤其是24h以内)，由神经元和内皮细胞产生的NO可对神经组织发挥保护作用，但过量的NO(尤其是缺血24h以后，主要由胶质细胞产生)则可产生神经损伤作用[2]。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)是体内催化NO生成的关键酶[3]。该酶在任何形式上的改变都会直接影响NO的产生，故国际上一致将该酶的变化作为间接反映体内各组织NO含量变化的指标[4，5]。中药用于脑缺血的治疗已有几千年的历史，近年来也有不少单体或总提取物用于该病的治疗，例如川芎嗪、丹参黄酮、黄芩苷、绞股蓝皂苷、淫羊藿苷、三七总皂苷等[6～9]，但对其药理学机制尚不清楚。本实验应用免疫细胞化学技术与计算机数字图像分析研究三七皂苷对缺血脑组织内nNOS表达丰度的影响，以期阐明三七皂苷保护神经组织的NO机制。大脑皮质、尾壳核与海马是脑缺血的敏感区，故本实验主要观察这三部位内nNOS的变化。
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自从Furchtott[10]提出“内皮细胞源性舒张因子(EDRF)可能就是NO”的假说之后，对NO在神经系统中的作用进行了广泛的研究。越来越多的实验证明，NO对神经元可发挥双重作用[1，2，11～15]。缺血早期，NO可对神经元发挥保护作用[12]，随着脑缺血病程的进展(24h以后)，过量的NO则可介导神经毒性作用[11，14～15]。于是，寻找通过NO途径保护缺血脑组织药物的研究即成了目前神经药物学领域的最新热点。NOS抑制剂因缺乏鲜明的选择性而在发挥保护作用之后引起神经元损伤[11]，丹参可降低缺血24h后脑组织中NO的表达丰度[9]，三七总皂苷对缺血脑组织也具有一定的保护作用[9]，但三七皂苷单体对缺血脑组织NOS的调节作用尚无报道。
本实验通过比较正常大鼠、对照组大鼠与实验组大鼠海马、尾壳核与大脑皮质内nNOS的变化，发现nNOS表达丰度下降是脑缺血早期的一个重要细胞生物学特征。同时，本实验结果还显示，三七皂苷可提高缺血早期脑组织nNOS的表达丰度，根据病理组织学观察结果，作者认为，三七皂苷可能正是通过上调nNOS的表达而对神经元发挥保护作用。由此可以相信，开发治疗缺血性脑损伤中药剂的研究将具有很好的前景。
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一氧化氮作为一种免疫分子同样也受到免疫药理学工作者的高度重视。免疫药理学(Immunopharmacology)是一门新兴的边缘学科，1959年，Szentivanyi首先提出免疫药理学这一概念，其核心内容是免疫系统与神经系统的联系作用。60年代以后，免疫药理学则侧重于介绍药物与激素放射免疫检测方法(RIA)。70年代早期，免疫药理学理论体系中出现了免疫系统环苷酸药理学。70年代中期，免疫药理学的发展到免疫治疗学的临床前免疫药理学测试工作。70年代末，免疫药理学的内容扩展为炎症免疫学、免疫抑制剂治疗、环核苷酸药理学与免疫治疗学等领域。80年代以来，免疫药理学主要在研究方法上相互融通，以使先进的免疫学方法能够与经典的药理学方法融为一体，以成为现代药理学研究的强大工具。
本实验将免疫细胞化学技术与计算机数字图像分析系统应用于三七皂苷免疫药理学作用的研究就是现代技术与经典方法相融合的一个尝试。由于免疫细胞化学法具有高度的特异性，计算机数字图像分析系统具有精确的定量功能，这对研究新药的药效学、免疫药理学与毒理学及药动学机制无疑将发挥十分重要的作用。同时图像分析系统还排除用肉眼观察免疫细胞化学实验结果的个体差异，从而使实验结果的描述更加客观、真实。各种分析结果以直方图的形式取代照片也显得更加直观，并易于比较。因此，这两项新技术将在免疫药理学研究领域得到广泛的应用。目前，免疫细胞化学技术与核酸分子杂交技术进展迅猛，并于最近诞生的原位PCR技术[16]和Sothwestem细胞化学技术[17]。如果将Northern boltting、原位PCR与Southwestem细胞化学技术联合用于免疫药理学研究，将会在三维分子生物学水平上(即DNA、RNA与蛋白质水平上)获得新药的药效学资料，从而推动新药的研究与开发。本实验虽然只进行了三七皂苷调节NOS(一种蛋白)表达的一维分析，但三七皂苷可调节缺血脑组织内NO产生这一新发现将有助于扩大该药的临床应用范围，并改进三七皂苷的临床应用方法，这又进一步展示了免疫细胞化学技术与计算机数字图像分析系统在未来免疫药理学研究中的诱人前景。
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参考文献
1，Shibata,M.Araki,N,Hamada,J,et al.Brain nitrite oxide production during global ischenmia and reperfusion:an in vivo microdialysis study.Brain Res.1996,734∶86～90.
2，Iadecloa,C.Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury.Trends-Neurosci.1997,20∶132～139.
3，Vincent,SR,Nitric oxide:A radical neurotransmitter in the central nervous system.Pron.Neurol,1994,42∶129～160.
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4，Karson,CN,Griffin,WST,Mark,RE,et al.Nitric oxide synthase(NOS)in schizophrenia,Mol.Chem.Neuropathol.1996,27∶275～284.
5，Koprowski,H,Zheng,YM,Heber-Katz,E,et al In vivo expression of inducible nitric oxide synthase in expermentally inducible neurologic diseases.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993,90∶3024～3027.
6，李振洲，匡培根，吴卫平.脑缺血后脑组织一氧化氮合成酶基因表达丹参影响的初步研究.卒中与神经疾病，1997，4∶1～3.
7，李黔宁，王东武，岳桂明等.绞股蓝皂苷脑干缺血性损伤保护作用及机制探讨.中国药学杂志，1997，32∶466～469.
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8，林新，李文魁.淫羊藿的研究新进展.中国药学杂志，1997，32∶499～469.
9，Ma,LY,Xiao,PG,Liang,FQ,et al.Effect of saponins of Panax notoginseng on synaptosomal 45 Ca uptake,Acta Pharmacol.Sin.1997,32∶213～215.
10，Furchgott,RF,Studies on relaxation of rabbit aorta by sodium nitrite the basis for the proposal that the acidactivatable inhibitory factor from retractro penis is inorganic nitrite and the endothhelium derived relaxing factor is nitricoxide.In:Vanhoutte,PM,ed.Vasodilation:Vascular Smoothe Muscle,Peptides,Attonmic Nerves and Endothelium.New york,Raven press,1988,401～414.∶
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11，Dalkara,T,Yoshida,T,Irikura,K,et al.Dual role of nitric oxide in focal cerebral inchemia,Neuropharmacol.1994,33∶1447～1452.
12，Zhang,FY,Xu,S,Iadecola,C,Time depence of effect of nitric oxide synthase inhibition on cerebral ischemic damage,J.Cereb.Blood Flow Metab.1995,15∶595～601.
13，Kuppusamy,P.,Ohnishi,ST,Numagami,Y et al.Three dimentional imaging of nitric oxide production inthe rat brain subjected to ischemia-hypoxia.J.Cereb.Blood Flow Metab.1995,15∶899～903.
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14，Iadecola,C,Zhang FY,Xu,s.et al.Inducible nitric oxide synthase gene expression in brain following cerebral ischemia.J.Cereb.Blood Flow metab.1995,15 378～384.∶
15，Hunotk,S,Boissier,F,Faucheux,B,et al.Nitric oxide synthase and neuronal vulnerability in Parkinson's disease.Neurosci,1996,72∶355～363.
16，Bagasra,O.Seshamma,T,Pomerantz,BJ.Polymerase chin reacion in situ:intracellular amplification and detection of HIV-1 proviral DNA and other specific genes.J.Immunol.Meth.1993,158∶131～145.
17，Takehiko,K.and Nakane,PK.In situ htbridization and southwestem histochemistry with thymine dimerizek oligonucleotide probes.XIV th International Symposium on Morphological Sciences,Programme-Abstracts.Beijing,International Academic Publishers.1997,P183.
收稿日期：2000-03-28, http://www.100md.com
单位：邹玉安(张家口医学院第一附属医院神经内科 075000) 魏阿平(儿科)
关键词：脑缺血；一氧化氮合酶；三七皂苷；免疫细胞化学；图像分析系统
脑与神经疾病杂志000402
摘 要 应用免疫细胞化学技术与图像分析系统研究三七皂苷的免疫药理学机制。正常组大鼠；实验组大鼠(左颈总动脉结扎并于术前4小时肌注三七皂苷，7mg/kg-1)与对照组大鼠(左颈总动脉结扎用等量生理盐水取代三七皂苷)各分4小时组、12小时组、24小时组。各组鼠大脑皮质、海马与尾壳核内神经元性一氧化氧合酶(nNOS)的含量用LSAB法与计算机数字图像分析系统检测。结果显示对照组大鼠海马、尾壳核与大脑皮质内nNOS含量显著下降，三七皂苷可恢复缺血脑组织的nNOS表达，并对缺血脑组织发挥保护作用。同时，本实验还提示免疫细胞化学技术与图像分析系统用于免疫药理学研究是可行的。
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Expression of neuronal nitric oxide synthase in rat ischemic brain modulated by notoginsenoside A comprehensive methods for the study of immrmopharmacology
Zou Yuan et al.
(Department of Neurology,First Affiliated Hospital,Zhang jiakou Medical College,Zhangjiakou 075000)
Abstract To understand the immunopharmacological mechanism of notoginsenoside,immunocytochemistry(LSAB)and image analysis system was employed in this experiment.Neuronal nitric oxide synthase (nNOS)was labelled and detected pualitariveoy and qualitatively in cercbral cortex,hippocampus and caudate putanen nuclei in normal rat brains ,ischemic rat brains (experimental group )in postischemic peridos of 4h,12h,24h,which the notoginsenosied was administered prior to the occlusion of left commoncarotid artery (LCA).Specimens for LSAB and image analysis were also collected from rats in control group at 4h,12h and 24h,after the occlusion of LCA without injection of notoginsenoside.The content of nNOS in cerbral cortex,hippocampus,and caudate putamen nuclei of control rat brains decresed remarkably when compared with normal rats.Intensity of positive reaction to antiNOS-Iin ischemic rats was simil ar to that of normal rat brains.The results indicated that notoginsenoside could promote the cexpression of nNOS at the early stage of ceredral ischemia and suggested that notoginseoside might play a protective role fro nervous tissue in ischemic rains.Also,it was proved to be possible that immynocytochemistry and image analysis system could be a powerful approaches in the research of immunopharmacology as well.
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Key word Cerebral ischemia Neuronal nitric oxide synthase \Notoginsenoside Immunocytochemistry Image analysis system
一氧化氮(Nitric oxide,NO)是新近发现的一种免疫分子，在神经功能调节与神经系统疾病的发生、发展中发挥着重大作用，NO现已成为国际神经科学领域的最新研究热点，其免疫药理学作用亦倍受关注。在本实验中我们将免疫细胞化学与图像分析系统应用于三七皂苷的免疫药理研究，获得了三七皂苷免疫药理学机制的新认识，并据此提出了“免疫细胞药理学”(immunocytopharmacology)这一新概念。本文拟将我们建立或改进的免疫细胞化学方法与图像分析系统在免疫药理学研究中的应用予以介绍，并对其应用前景作展望性分析。
材 料 与 方 法
一、实验动物
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老龄Wistar大鼠68只(标准CL级动物，约1.2岁，购自中国医学科学院实验动物繁育场)，体重350～500g，雌雄各半。将大鼠饲养在标准环境中，即室温28～30℃，相对湿度65～70%，照明度为280～350LX，光照节律为12小时明12小时暗，昼夜交替。标准日粮(购自北京医科大学实验动物室)，清洁饮水，自由饮食，雌雄分养。3日后按1∶1的雌雄比合笼，2日后用于本实验。
将实验大鼠分为正常组(8只)，实验组(30只)和对照组(30只)，雌雄各半。实验组和对照组又分为4h组、12h组和24h组，每组10只。
二、实验动物的处理
1.正常组大鼠用戊巴比妥钠麻醉(雄鼠33mg/kg-1体重，雌鼠30mg/kg-1体重，腹腔注射)，经左心室灌注4%多聚甲醛液进行全身固定，24h后取脑，用过乳头体后缘和视交叉后缘的两个冠状切面间脑片做实验材料，常规脱水，透明、Paraplast (购自Sigma公司)包埋。制备6μm冠状切片。
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实验组大鼠于复制脑缺血模型前4h注三七皂苷(昆明制药厂生产，批号950633-28，7mg/kg-1)，对照组大鼠则注射生理盐水。
2.脑缺血模型的复制： 参照Shibata等人的方法进行[1]。实验组与对照组 大鼠用戊巴比妥钠麻醉，并固定在解剖台上，颈腹侧剪毛，常规消毒，然后自胸骨柄前1cm处向吻侧做一2.5cm长纵切口，钝性分离胸乳突肌与肩胛舌骨肌，暴露左侧颈总动脉与迷走交感干，将二者分离开，顺势用0号丝线双重结扎颈总动脉，缝合皮肤，并扎绷带，尾号法标记。此即制成轻度脑缺血模型。
实验组和对照组分别于模型复制后4h、12h、与24h取脑，并按1的方法制备脑切片。
3.大脑皮质、海马与尾壳核内nNOS的免疫细胞化学标记
切片标本用改进的LSAB法进行nNOS的免疫细胞化学标记，主要步骤如下： 切片脱paraplast后复水，PBS冲洗5min×3，滴加10%正常小牛血清，室温下作用30min,倾去血清后迅速滴加兔抗大鼠nNOS多克隆抗体(购自Santa Cruz公司，工作浓度为1∶80)于湿盒内孵育，44℃过夜，PBS冲洗5min×3，滴加羊抗兔IgG-Bio(购自美国Zymed公司，工作浓度1∶60)，37℃于湿盒内孵育5min×3，滴加1%HRP Streptavidin工作液，37℃于湿盒内孵育30min，PBS 5min×3，DAB显色，镜下控制显色时间，自来水冲洗干净，常规脱水，透明，封片，普通光镜下观察。各组大鼠标本均设有阴性对照，即用生理盐水取代兔抗大鼠nNOS多克隆抗体，其余步骤同上。
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4.图像分析与统计学处理
图像分析在CMIAS001型真彩色图像分析系统(空军总医院生物医学工程研究所生产)中进行。
每只大鼠的海马(CA1区、CA2区与CA3区)、尾壳核与大脑皮质三个部位各取5张连续切片。由于神经元胞体形态不规则，故用手工分割法进行扫描采样。分析指标包括面积、直径、周长、圆度、平均灰度(Grey Level,GREV)与积分光密度(Intergratedoptical density,IOD)。
图像分析是一种数字图像处理技术。数字图像是由许多像素构成的，所谓像素是指在显示器屏幕上按“行”与“列”排列的点阵元素。每个像素都包含灰度信息(指二维平面上光能量分布的差异)和位置信息，这两种信息决定了图像的形态与灰度。IOD是指各个单独测到的像素光密度的总和，是图像分析仪的主要输出指标，故本实验用IOD值表示神经元内nNOS的含量。
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全部数据均用SAS软件包进行统计学处理。差异显著性用μ检验。
5.病理学观察
正常组、对照组与实验组脑切片做HE染色，观察比较大脑皮质、海马与尾壳核的组织结构特征。
结 果
本文用IOD值定量表示LSAB法标记nNOS实验结果。
1.正常组： IOD： 海马400.19±128.36，n=9，新大脑皮质479.38±150.04，n=7，尾壳核203.03±41.28，n=9。海马与尾壳核以及大脑皮质与尾壳核之间均存在显著差异(P<0.01)，但海马与大脑皮质间无显著差异(P>0.05)，说明海马与大脑皮质内神经元的nNOS含量相近，均高于尾壳核，见图1。
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图1 正常对照组海马、新皮质、尾壳核、积分光密度值
2.对照组与实验组大脑皮质、海马与尾壳核IOD的比较： 对照组分缺血4h、12h、24h三组，各组上述部位IOD与正常组间比较均有显著差异(P<0.01)，见图2。
3.正常组、对照组与实验组大脑皮质、海马与尾壳核IOD的比较： 将 各组大鼠脑的海马、尾壳核与大脑皮质的IOD值作为变量值，所得均值进行组间比较，并进行u检验，其结果反映缺血脑组织内nNOS含量的综合变化，并用以判断三七皂苷对缺血脑组织nNOS表达丰度的影响。三组大鼠海马、尾壳核与大脑皮质IOD比较的结果见图3。
图2 实验对照组不同缺血时间内各观察部位和正常对照组的积分光密度值的比较
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图3 正常组，对照组和三七皂苷组在不同缺血时间内积分光密度值的比较
4.病理学观察： 对照组大鼠海马、尾壳核与大脑皮质内的神经元多数出现空泡样变，而对照组右侧半球和实验组鼠脑两半球均与正常组大鼠海马、尾壳核及大脑皮质结构相近。
讨 论
一氧化氮在缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)中的作用是当今国际神经科学研究领域的热点之一。大量研究表明，在缺血早期(尤其是24h以内)，由神经元和内皮细胞产生的NO可对神经组织发挥保护作用，但过量的NO(尤其是缺血24h以后，主要由胶质细胞产生)则可产生神经损伤作用[2]。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)是体内催化NO生成的关键酶[3]。该酶在任何形式上的改变都会直接影响NO的产生，故国际上一致将该酶的变化作为间接反映体内各组织NO含量变化的指标[4，5]。中药用于脑缺血的治疗已有几千年的历史，近年来也有不少单体或总提取物用于该病的治疗，例如川芎嗪、丹参黄酮、黄芩苷、绞股蓝皂苷、淫羊藿苷、三七总皂苷等[6～9]，但对其药理学机制尚不清楚。本实验应用免疫细胞化学技术与计算机数字图像分析研究三七皂苷对缺血脑组织内nNOS表达丰度的影响，以期阐明三七皂苷保护神经组织的NO机制。大脑皮质、尾壳核与海马是脑缺血的敏感区，故本实验主要观察这三部位内nNOS的变化。
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自从Furchtott[10]提出“内皮细胞源性舒张因子(EDRF)可能就是NO”的假说之后，对NO在神经系统中的作用进行了广泛的研究。越来越多的实验证明，NO对神经元可发挥双重作用[1，2，11～15]。缺血早期，NO可对神经元发挥保护作用[12]，随着脑缺血病程的进展(24h以后)，过量的NO则可介导神经毒性作用[11，14～15]。于是，寻找通过NO途径保护缺血脑组织药物的研究即成了目前神经药物学领域的最新热点。NOS抑制剂因缺乏鲜明的选择性而在发挥保护作用之后引起神经元损伤[11]，丹参可降低缺血24h后脑组织中NO的表达丰度[9]，三七总皂苷对缺血脑组织也具有一定的保护作用[9]，但三七皂苷单体对缺血脑组织NOS的调节作用尚无报道。
本实验通过比较正常大鼠、对照组大鼠与实验组大鼠海马、尾壳核与大脑皮质内nNOS的变化，发现nNOS表达丰度下降是脑缺血早期的一个重要细胞生物学特征。同时，本实验结果还显示，三七皂苷可提高缺血早期脑组织nNOS的表达丰度，根据病理组织学观察结果，作者认为，三七皂苷可能正是通过上调nNOS的表达而对神经元发挥保护作用。由此可以相信，开发治疗缺血性脑损伤中药剂的研究将具有很好的前景。
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一氧化氮作为一种免疫分子同样也受到免疫药理学工作者的高度重视。免疫药理学(Immunopharmacology)是一门新兴的边缘学科，1959年，Szentivanyi首先提出免疫药理学这一概念，其核心内容是免疫系统与神经系统的联系作用。60年代以后，免疫药理学则侧重于介绍药物与激素放射免疫检测方法(RIA)。70年代早期，免疫药理学理论体系中出现了免疫系统环苷酸药理学。70年代中期，免疫药理学的发展到免疫治疗学的临床前免疫药理学测试工作。70年代末，免疫药理学的内容扩展为炎症免疫学、免疫抑制剂治疗、环核苷酸药理学与免疫治疗学等领域。80年代以来，免疫药理学主要在研究方法上相互融通，以使先进的免疫学方法能够与经典的药理学方法融为一体，以成为现代药理学研究的强大工具。
本实验将免疫细胞化学技术与计算机数字图像分析系统应用于三七皂苷免疫药理学作用的研究就是现代技术与经典方法相融合的一个尝试。由于免疫细胞化学法具有高度的特异性，计算机数字图像分析系统具有精确的定量功能，这对研究新药的药效学、免疫药理学与毒理学及药动学机制无疑将发挥十分重要的作用。同时图像分析系统还排除用肉眼观察免疫细胞化学实验结果的个体差异，从而使实验结果的描述更加客观、真实。各种分析结果以直方图的形式取代照片也显得更加直观，并易于比较。因此，这两项新技术将在免疫药理学研究领域得到广泛的应用。目前，免疫细胞化学技术与核酸分子杂交技术进展迅猛，并于最近诞生的原位PCR技术[16]和Sothwestem细胞化学技术[17]。如果将Northern boltting、原位PCR与Southwestem细胞化学技术联合用于免疫药理学研究，将会在三维分子生物学水平上(即DNA、RNA与蛋白质水平上)获得新药的药效学资料，从而推动新药的研究与开发。本实验虽然只进行了三七皂苷调节NOS(一种蛋白)表达的一维分析，但三七皂苷可调节缺血脑组织内NO产生这一新发现将有助于扩大该药的临床应用范围，并改进三七皂苷的临床应用方法，这又进一步展示了免疫细胞化学技术与计算机数字图像分析系统在未来免疫药理学研究中的诱人前景。
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参考文献
1，Shibata,M.Araki,N,Hamada,J,et al.Brain nitrite oxide production during global ischenmia and reperfusion:an in vivo microdialysis study.Brain Res.1996,734∶86～90.
2，Iadecloa,C.Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury.Trends-Neurosci.1997,20∶132～139.
3，Vincent,SR,Nitric oxide:A radical neurotransmitter in the central nervous system.Pron.Neurol,1994,42∶129～160.
, 百拇医药
4，Karson,CN,Griffin,WST,Mark,RE,et al.Nitric oxide synthase(NOS)in schizophrenia,Mol.Chem.Neuropathol.1996,27∶275～284.
5，Koprowski,H,Zheng,YM,Heber-Katz,E,et al In vivo expression of inducible nitric oxide synthase in expermentally inducible neurologic diseases.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993,90∶3024～3027.
6，李振洲，匡培根，吴卫平.脑缺血后脑组织一氧化氮合成酶基因表达丹参影响的初步研究.卒中与神经疾病，1997，4∶1～3.
7，李黔宁，王东武，岳桂明等.绞股蓝皂苷脑干缺血性损伤保护作用及机制探讨.中国药学杂志，1997，32∶466～469.
, 百拇医药
8，林新，李文魁.淫羊藿的研究新进展.中国药学杂志，1997，32∶499～469.
9，Ma,LY,Xiao,PG,Liang,FQ,et al.Effect of saponins of Panax notoginseng on synaptosomal 45 Ca uptake,Acta Pharmacol.Sin.1997,32∶213～215.
10，Furchgott,RF,Studies on relaxation of rabbit aorta by sodium nitrite the basis for the proposal that the acidactivatable inhibitory factor from retractro penis is inorganic nitrite and the endothhelium derived relaxing factor is nitricoxide.In:Vanhoutte,PM,ed.Vasodilation:Vascular Smoothe Muscle,Peptides,Attonmic Nerves and Endothelium.New york,Raven press,1988,401～414.∶
, 百拇医药
11，Dalkara,T,Yoshida,T,Irikura,K,et al.Dual role of nitric oxide in focal cerebral inchemia,Neuropharmacol.1994,33∶1447～1452.
12，Zhang,FY,Xu,S,Iadecola,C,Time depence of effect of nitric oxide synthase inhibition on cerebral ischemic damage,J.Cereb.Blood Flow Metab.1995,15∶595～601.
13，Kuppusamy,P.,Ohnishi,ST,Numagami,Y et al.Three dimentional imaging of nitric oxide production inthe rat brain subjected to ischemia-hypoxia.J.Cereb.Blood Flow Metab.1995,15∶899～903.
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14，Iadecola,C,Zhang FY,Xu,s.et al.Inducible nitric oxide synthase gene expression in brain following cerebral ischemia.J.Cereb.Blood Flow metab.1995,15 378～384.∶
15，Hunotk,S,Boissier,F,Faucheux,B,et al.Nitric oxide synthase and neuronal vulnerability in Parkinson's disease.Neurosci,1996,72∶355～363.
16，Bagasra,O.Seshamma,T,Pomerantz,BJ.Polymerase chin reacion in situ:intracellular amplification and detection of HIV-1 proviral DNA and other specific genes.J.Immunol.Meth.1993,158∶131～145.
17，Takehiko,K.and Nakane,PK.In situ htbridization and southwestem histochemistry with thymine dimerizek oligonucleotide probes.XIV th International Symposium on Morphological Sciences,Programme-Abstracts.Beijing,International Academic Publishers.1997,P183.
收稿日期：2000-03-28, http://www.100md.com