人嗜酸性细胞趋化素基因cDNA的分离及序列分析
时凤丽 邹民吉 王嘉玺 府伟灵
提 要 目的：分离编码人嗜酸性细胞趋化素(hEot)的基因cDNA，并将它克隆至质粒pUC18中进行核苷酸序列分析。方法：采用TNFα刺激人肺上皮细胞提取总RNA，利用RT-PCR方法获得了hEot的cDNA，并将其定向插入pUC18载体中进行核苷酸序列。结果：DNA序列分析表明分离的hEot cDNA的序列与文献报道的完全一致。结论：本研究获得了序列正确的hEot基因cDNA，为下一步的研究打下基础。
关键词:人嗜酸性细胞趋化素 RT-PCR 基因 序列
1993年在致敏原刺激的豚鼠支气管肺泡灌洗液中鉴定出一种嗜酸性细胞趋化物，命名为嗜酸性细胞趋化素(Eotaxin,Eot)[1]。1996年人嗜酸性细胞趋化素(hEot)也得到克隆[2～4]。Eot是一种高度特异性的嗜酸性细胞趋化因子，它主要存在于呼吸道上皮细胞及肠道上皮细胞中[2，5]。Eot的存在有助于解释一些炎症部位嗜酸性细胞的高度选择性聚集，进一步解释哮喘及其它疾病的发生机制。目前国内尚未见到对Eot的研究报道，我们利用逆转录PCR获得了hEot cDNA，并构建载体对其序列测定，测序结果与文献报道的完全一致。这将有利于进一步详尽研究其生物学活性。
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1 材料与方法
1.1 质粒和菌株 质粒pUC18购自华美公司；E.coli DH5α系由军事医学科学院三所三室保存。
1.2 细胞及培养基
人肺上皮细胞A549由军科院五所苑锡同老师惠赠。RPMI 1640培养基购自GIBCO公司，小牛血清为北京军区军马所产品。LB培养基按文献配制。
1.3 工具酶及试剂
EcoRI、BamHI购自华美，T4连接酶购自Promega公司。DNA分子量标准pBR322/MspⅠ、λDNA/HindⅢ购自华美生物工程公司。TNF-α为北京邦定公司产品。DEPC为Sigma公司产品。RT-PCR试剂盒购自Promega公司。DNA快速回收试剂盒购自北京原平公司。
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1.4 细胞培养
参照文献[6]稍做改进。培养基为RPMI 1640，当细胞密度达到1×105/ml，用TNF-α刺激，终浓度为20μg/ml。刺激后4 h收获细胞。
1.5 细胞总RNA提取
按改进的RNA提取法[7]提取细胞总RNA。
1.6 引物的合成
根据文献报道的hEot cDNA序列，设计一对特异性引物，在上游引物加EcoRI的酶切位点，下游引物加BamHI的酶切位点。为以后的表达工作，又在两者5′端分别加有起始密码子ATG和终止密码子TAA，并且为了保持SD序列与ATG的距离以及提高引物的AT含量，在P1中ATG和SD之间又加入了两个A，为了使两引物的Tm值相似，将P1中第一位的密码子GGG换成GGA。
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P1：5′-GGAATTCAAATGGGACCAGCTTCTGTCCC
AACC-3′；
P2：5′-CGGGATCCTTATGGCTTTGGAGTTGGAG
ATTT-3′
引物由上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化。
1.7 目的基因的分离
取2μg总RNA扩增hEot基因的编码区片段。反应混合物首先于48℃反应45min进行逆转录，然后94℃变性2min，接着进入循环，94℃变性30s、52℃退火30s、68℃延伸40s，共循环35次，最后一次循环68℃再延伸5min。反应完毕取5μl反应产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳分析。PCR产物经酚、酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀，TE溶解，紫外鉴定及定量，-20℃保存备用。
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1.8 重组测序载体的构建
载体pUC18和RT-PCR产物均用EcoRI、BamHI酶切，然后用DNA快速回收试剂盒从琼脂糖凝胶快速纯化回收DNA片段，将回收后的pUC18/EcoRI+BamHI和PCR产物/EcoRI+BamHI进行14℃过夜连接；二者的比例依回收后的浓度而定，原则是PCR产物∶pUC18(摩尔比)=3∶1。
1.9 连接产物的转化及重组子的筛选和鉴定
取5μl连接产物转化受体菌E.coli DH5α的感受态细胞，挑取具有氨苄青霉素(AP)抗性的菌落于5ml含AP的LB培养基中37℃振摇过夜培养。碱裂解法小量快速提取质粒DNA进行双酶切鉴定。
1.10 DNA序列分析
碱裂解法大量抽提经双酶切鉴定的重组克隆的质粒，通过自动测序仪进行序列分析。
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2 结果
2.1 hEot cDNA的扩增
逆转录PCR的结果进行琼脂糖凝胶电泳分析发现在245bp左右有一条带，位于pBR322/MspI第5条带处，大小与预计相符，见图1。
图 1 琼脂糖凝胶电泳分析RT-PCR反应产物
Fig 1 Identification of the RT-PCR product by DNA agarose gel electrophoresis
1. pBR322/Msp I 2. RT-PCR product
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2.2 重组质粒的构建及酶切鉴定 重组质粒的构建，见图2。将RT-PCR产物经EcoRI/BamHI双酶切后，定向插入经同样双酶切的pUC18载体中，获得的重组质粒命名为pUC-hEot。经EcoRI/BamHI双酶切后的重组质粒酶切电泳图谱，见图3。双酶切后产生的片段为大小约定的240 bp的片段。
图 2 重组质粒pUC-hEot的构建示意图
Fig 2 The scheme for construction of the recombinant plasmid pUC-hEot
, 百拇医药 图 3 重组质粒pUC-hEot的双酶切鉴定图谱
Fig 3 Double restriction map of recombinant plasmid pUC-hEot
1. pBR322/Msp I 2. pUC-hEot/EcoRI+BamHI 3. pUC18/EcoRI+BamHI 4. λ DNA/HindⅢ
2.3 hEot基因片段的序列分析 把从人肺上皮细胞A549中扩增得到的hEot基因片段克隆至pUC18中，大量抽提重组质粒pUC-hEot，全自动测序仪进行序列分析，结果表明基因序列与文献报道的完全一致。图4为目的基因的序列分析结果。
hEot基因cDNA编码区的核苷酸序列和氨基酸序列如下：
GGG
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CCA
GCT
TCT
GTC
CCA
ACC
ACC
TGC
TGC
TTT
AAC
CTG
GCC
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图 4 hEot基因cDNA的序列分析
Fig 4 The DNA sequence of hEot gene cDNA without the leading peptide sequence
3 讨论
嗜酸性细胞趋化素(Eot)是一种高度选择性趋化嗜酸性细胞的趋化因子，属于β或CC趋化因子[2]。1996年hEot基因被克隆，人成熟Eot分子量为8.4×103u，由74个氨基酸残基组成[2～4]。迄今对它的功能及在疾病中的作用尚不完全清楚。对Eot的受体的研究发现它是CC趋化因子受体家族中的第三个受体即CCR3[3，8，9]，只在嗜酸性细胞表达。而Eot是唯一的一个只与一个受体结合的CC趋化因子，即只与CCR3结合，而此受体在配体结合上明显地缺少选择性。由于Eot受体表达的限制，Eot的活性就局限于嗜酸性细胞，因此，Eot具有高度特异性地趋化嗜酸性细胞的作用。推测人Eot是变态反应性哮喘、肠道蠕虫感染等疾病的重要炎性介质，对疾病的发生、发展可能起重要作用。因此，对Eot结构和功能的深入研究将进一步阐明一些疾病的发生机制，为预防和治疗奠定基础。
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国外对Eot结构和功能的研究也才刚刚起步，国内尚无文献报道。本研究根据国外报道的人Eot基因序列，设计并合成了特异性引物P1和P2，在两者5′端分别加有起始密码子ATG和终止密码子TAA以及EcoRI、BamHI限制性酶切位点，并且为了保持SD序列与ATG的距离以及提高引物的AT含量，在P1中ATG和SD之间又加入了两个A，为了使两引物的Tm值相似，将P1中第一位的密码子GGG换成GGA。由于上述在引物设计方面的优化，使PCR反应更特异、更灵敏，并使目的基因的鉴别变得较简便，也为下一步的研究工作打下基础。
趋化因子是高度诱导型基因[3]。采用RT-PCR技术，经过细胞因子TNFα刺激从人肺上皮细胞A549中获得特异的hEot cDNA，并进行序列分析得到证实。为以后hEot cDNA高效表达载体的构建和高效表达奠定基础。以上工作对Eot蛋白功能的研究将进一步揭示它的生物学活性，并有可能成为一种重要的细胞因子而应用于临床。
作者简介：时凤丽，女，34岁，主管技师，硕士研究生
, 百拇医药
作者单位：时凤丽 邹民吉 府伟灵 第三军医大学附属西南医院检验科基因诊断和治疗中心 重庆，400038
王嘉玺 军事医学科学院基础医学研究所 北京，100850
参考文献
1 Griffiths Johnson D A,Collins P D,Rossi A G,et al.The chemokine, eotaxin, activates guinea-pig eosinophils in vitro and causes their accumulation into the lung in vitro. Biochem Biophys Res Commun,1993,197(3):1167
2 Ponath P D,Qin S, Ringler D J,et al.Cloning of the human eosinophil chemoattractant,eotaxin,expression,receptor binding,and functional properties suggest a mechanism for the selective recruitment of eosinophils.J Clin Invest,1996,97(3):604
, 百拇医药
3 Kitaura M,Nkajima T,Imai T,et al.Molecular cloning of human eotaxin,an eosinophil-selective CC chemokine,and identification of a specific eosinophil eotaxin receptor,CC chemokine receptor 3.J Biol Chem,1996,271(13):7725
4 Garcia Zepeda E A,Rothenberg M E,Ownbey R T,et al.Human eotaxin is a specific chemoattractant for eosinophil cells and provides a new mechanism to explain tissue eosinophilia.Nat Med,1996,2(4):449
5 Ganzalo J A,Jia G Q,Aguirre V,et al.Mouse eotaxin expression parallels eosinophil accumulation during lung allergic inflammation but it is not restricted to a Th2-type response.Immunity,1996,4(1):1
, 百拇医药
6 Lilly C M,Nakamura H,Kesselman H,et al.Expression of eotaxon by human lung epithelial cells,induction by cytokines and inhibition by glucocorticoids. J Clin Invest,1997,99(7):1767
7 Duan J B,Cai X,Zhou L M,et al.Single-step method of total RNA isolation by sodium dodecyl sulfate/phenol extraction from cultured cells.Analytical Biochem,1997,251(2):291
8 Daugherty B L,Siciliano S J,DeMartino J A,et al.Cloning,expression,and characterization of the human eosinophil eotaxin receptor.J Exp Med,1996,183(5):2349
9 Ponath P D,Qin S,Post T W,et al.Molecular cloning and characterization of a human eotaxin receptor expressed selectively on eosinophils.J Exp Med,1996,183(6):2437, http://www.100md.com
提 要 目的：分离编码人嗜酸性细胞趋化素(hEot)的基因cDNA，并将它克隆至质粒pUC18中进行核苷酸序列分析。方法：采用TNFα刺激人肺上皮细胞提取总RNA，利用RT-PCR方法获得了hEot的cDNA，并将其定向插入pUC18载体中进行核苷酸序列。结果：DNA序列分析表明分离的hEot cDNA的序列与文献报道的完全一致。结论：本研究获得了序列正确的hEot基因cDNA，为下一步的研究打下基础。
关键词:人嗜酸性细胞趋化素 RT-PCR 基因 序列
1993年在致敏原刺激的豚鼠支气管肺泡灌洗液中鉴定出一种嗜酸性细胞趋化物，命名为嗜酸性细胞趋化素(Eotaxin,Eot)[1]。1996年人嗜酸性细胞趋化素(hEot)也得到克隆[2～4]。Eot是一种高度特异性的嗜酸性细胞趋化因子，它主要存在于呼吸道上皮细胞及肠道上皮细胞中[2，5]。Eot的存在有助于解释一些炎症部位嗜酸性细胞的高度选择性聚集，进一步解释哮喘及其它疾病的发生机制。目前国内尚未见到对Eot的研究报道，我们利用逆转录PCR获得了hEot cDNA，并构建载体对其序列测定，测序结果与文献报道的完全一致。这将有利于进一步详尽研究其生物学活性。
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1 材料与方法
1.1 质粒和菌株 质粒pUC18购自华美公司；E.coli DH5α系由军事医学科学院三所三室保存。
1.2 细胞及培养基
人肺上皮细胞A549由军科院五所苑锡同老师惠赠。RPMI 1640培养基购自GIBCO公司，小牛血清为北京军区军马所产品。LB培养基按文献配制。
1.3 工具酶及试剂
EcoRI、BamHI购自华美，T4连接酶购自Promega公司。DNA分子量标准pBR322/MspⅠ、λDNA/HindⅢ购自华美生物工程公司。TNF-α为北京邦定公司产品。DEPC为Sigma公司产品。RT-PCR试剂盒购自Promega公司。DNA快速回收试剂盒购自北京原平公司。
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1.4 细胞培养
参照文献[6]稍做改进。培养基为RPMI 1640，当细胞密度达到1×105/ml，用TNF-α刺激，终浓度为20μg/ml。刺激后4 h收获细胞。
1.5 细胞总RNA提取
按改进的RNA提取法[7]提取细胞总RNA。
1.6 引物的合成
根据文献报道的hEot cDNA序列，设计一对特异性引物，在上游引物加EcoRI的酶切位点，下游引物加BamHI的酶切位点。为以后的表达工作，又在两者5′端分别加有起始密码子ATG和终止密码子TAA，并且为了保持SD序列与ATG的距离以及提高引物的AT含量，在P1中ATG和SD之间又加入了两个A，为了使两引物的Tm值相似，将P1中第一位的密码子GGG换成GGA。
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P1：5′-GGAATTCAAATGGGACCAGCTTCTGTCCC
AACC-3′；
P2：5′-CGGGATCCTTATGGCTTTGGAGTTGGAG
ATTT-3′
引物由上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化。
1.7 目的基因的分离
取2μg总RNA扩增hEot基因的编码区片段。反应混合物首先于48℃反应45min进行逆转录，然后94℃变性2min，接着进入循环，94℃变性30s、52℃退火30s、68℃延伸40s，共循环35次，最后一次循环68℃再延伸5min。反应完毕取5μl反应产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳分析。PCR产物经酚、酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀，TE溶解，紫外鉴定及定量，-20℃保存备用。
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1.8 重组测序载体的构建
载体pUC18和RT-PCR产物均用EcoRI、BamHI酶切，然后用DNA快速回收试剂盒从琼脂糖凝胶快速纯化回收DNA片段，将回收后的pUC18/EcoRI+BamHI和PCR产物/EcoRI+BamHI进行14℃过夜连接；二者的比例依回收后的浓度而定，原则是PCR产物∶pUC18(摩尔比)=3∶1。
1.9 连接产物的转化及重组子的筛选和鉴定
取5μl连接产物转化受体菌E.coli DH5α的感受态细胞，挑取具有氨苄青霉素(AP)抗性的菌落于5ml含AP的LB培养基中37℃振摇过夜培养。碱裂解法小量快速提取质粒DNA进行双酶切鉴定。
1.10 DNA序列分析
碱裂解法大量抽提经双酶切鉴定的重组克隆的质粒，通过自动测序仪进行序列分析。
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2 结果
2.1 hEot cDNA的扩增
逆转录PCR的结果进行琼脂糖凝胶电泳分析发现在245bp左右有一条带，位于pBR322/MspI第5条带处，大小与预计相符，见图1。
图 1 琼脂糖凝胶电泳分析RT-PCR反应产物
Fig 1 Identification of the RT-PCR product by DNA agarose gel electrophoresis
1. pBR322/Msp I 2. RT-PCR product
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2.2 重组质粒的构建及酶切鉴定 重组质粒的构建，见图2。将RT-PCR产物经EcoRI/BamHI双酶切后，定向插入经同样双酶切的pUC18载体中，获得的重组质粒命名为pUC-hEot。经EcoRI/BamHI双酶切后的重组质粒酶切电泳图谱，见图3。双酶切后产生的片段为大小约定的240 bp的片段。
图 2 重组质粒pUC-hEot的构建示意图
Fig 2 The scheme for construction of the recombinant plasmid pUC-hEot
, 百拇医药 图 3 重组质粒pUC-hEot的双酶切鉴定图谱
Fig 3 Double restriction map of recombinant plasmid pUC-hEot
1. pBR322/Msp I 2. pUC-hEot/EcoRI+BamHI 3. pUC18/EcoRI+BamHI 4. λ DNA/HindⅢ
2.3 hEot基因片段的序列分析 把从人肺上皮细胞A549中扩增得到的hEot基因片段克隆至pUC18中，大量抽提重组质粒pUC-hEot，全自动测序仪进行序列分析，结果表明基因序列与文献报道的完全一致。图4为目的基因的序列分析结果。
hEot基因cDNA编码区的核苷酸序列和氨基酸序列如下：
GGG
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图 4 hEot基因cDNA的序列分析
Fig 4 The DNA sequence of hEot gene cDNA without the leading peptide sequence
3 讨论
嗜酸性细胞趋化素(Eot)是一种高度选择性趋化嗜酸性细胞的趋化因子，属于β或CC趋化因子[2]。1996年hEot基因被克隆，人成熟Eot分子量为8.4×103u，由74个氨基酸残基组成[2～4]。迄今对它的功能及在疾病中的作用尚不完全清楚。对Eot的受体的研究发现它是CC趋化因子受体家族中的第三个受体即CCR3[3，8，9]，只在嗜酸性细胞表达。而Eot是唯一的一个只与一个受体结合的CC趋化因子，即只与CCR3结合，而此受体在配体结合上明显地缺少选择性。由于Eot受体表达的限制，Eot的活性就局限于嗜酸性细胞，因此，Eot具有高度特异性地趋化嗜酸性细胞的作用。推测人Eot是变态反应性哮喘、肠道蠕虫感染等疾病的重要炎性介质，对疾病的发生、发展可能起重要作用。因此，对Eot结构和功能的深入研究将进一步阐明一些疾病的发生机制，为预防和治疗奠定基础。
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国外对Eot结构和功能的研究也才刚刚起步，国内尚无文献报道。本研究根据国外报道的人Eot基因序列，设计并合成了特异性引物P1和P2，在两者5′端分别加有起始密码子ATG和终止密码子TAA以及EcoRI、BamHI限制性酶切位点，并且为了保持SD序列与ATG的距离以及提高引物的AT含量，在P1中ATG和SD之间又加入了两个A，为了使两引物的Tm值相似，将P1中第一位的密码子GGG换成GGA。由于上述在引物设计方面的优化，使PCR反应更特异、更灵敏，并使目的基因的鉴别变得较简便，也为下一步的研究工作打下基础。
趋化因子是高度诱导型基因[3]。采用RT-PCR技术，经过细胞因子TNFα刺激从人肺上皮细胞A549中获得特异的hEot cDNA，并进行序列分析得到证实。为以后hEot cDNA高效表达载体的构建和高效表达奠定基础。以上工作对Eot蛋白功能的研究将进一步揭示它的生物学活性，并有可能成为一种重要的细胞因子而应用于临床。
作者简介：时凤丽，女，34岁，主管技师，硕士研究生
, 百拇医药
作者单位：时凤丽 邹民吉 府伟灵 第三军医大学附属西南医院检验科基因诊断和治疗中心 重庆，400038
王嘉玺 军事医学科学院基础医学研究所 北京，100850
参考文献
1 Griffiths Johnson D A,Collins P D,Rossi A G,et al.The chemokine, eotaxin, activates guinea-pig eosinophils in vitro and causes their accumulation into the lung in vitro. Biochem Biophys Res Commun,1993,197(3):1167
2 Ponath P D,Qin S, Ringler D J,et al.Cloning of the human eosinophil chemoattractant,eotaxin,expression,receptor binding,and functional properties suggest a mechanism for the selective recruitment of eosinophils.J Clin Invest,1996,97(3):604
, 百拇医药
3 Kitaura M,Nkajima T,Imai T,et al.Molecular cloning of human eotaxin,an eosinophil-selective CC chemokine,and identification of a specific eosinophil eotaxin receptor,CC chemokine receptor 3.J Biol Chem,1996,271(13):7725
4 Garcia Zepeda E A,Rothenberg M E,Ownbey R T,et al.Human eotaxin is a specific chemoattractant for eosinophil cells and provides a new mechanism to explain tissue eosinophilia.Nat Med,1996,2(4):449
5 Ganzalo J A,Jia G Q,Aguirre V,et al.Mouse eotaxin expression parallels eosinophil accumulation during lung allergic inflammation but it is not restricted to a Th2-type response.Immunity,1996,4(1):1
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6 Lilly C M,Nakamura H,Kesselman H,et al.Expression of eotaxon by human lung epithelial cells,induction by cytokines and inhibition by glucocorticoids. J Clin Invest,1997,99(7):1767
7 Duan J B,Cai X,Zhou L M,et al.Single-step method of total RNA isolation by sodium dodecyl sulfate/phenol extraction from cultured cells.Analytical Biochem,1997,251(2):291
8 Daugherty B L,Siciliano S J,DeMartino J A,et al.Cloning,expression,and characterization of the human eosinophil eotaxin receptor.J Exp Med,1996,183(5):2349
9 Ponath P D,Qin S,Post T W,et al.Molecular cloning and characterization of a human eotaxin receptor expressed selectively on eosinophils.J Exp Med,1996,183(6):2437, http://www.100md.com