尿脱落细胞端粒酶活性表达对尿路上皮癌的诊断价值
作者：吴逵 诸禹平 舒启安 张祖明 朱明 沈法林 祝怀平 凌斌 戴海明 吴竞生
单位：吴逵 诸禹平 舒启安 张祖明 朱明 沈法林(安徽省立医院泌尿外科 合肥，230001)；祝怀平 戴海明 凌斌 吴竞生(安徽省立医院中心实验室)
关键词：端粒酶；尿液；脱落细胞；泌尿系肿瘤
临床泌尿外科杂志000511 摘要 目的：探讨尿脱落细胞端粒酶活性表达对尿路上皮癌的诊断价值。方法；采用PCR-ELISA法检测尿液中脱落的肿瘤细胞端粒酶活性，并以肾癌及非肿瘤患者的尿标本作对照。结果： 59例尿路上皮癌患者尿脱落细胞端粒酶活性表达率为88.1%，而肾癌患者为10.0%，非肿瘤患者为20.0%，前者与后两者比较，有极显著性差异(P<0.01)；不同分化程度及不同临床分期膀胱癌患者尿脱落细胞端粒酶活性表达率无显著性差异(P>0.05)。结论：检测尿脱落细胞端粒酶活性表达可作为尿路上皮癌早期诊断、疗效评估和术后监测的一种有效手段。
, 百拇医药
Telomerase activity in urine exfoliurothelial cancer
WU Kui ZHU Yu-ping SHU Qi-an
ZHANG Zhu-ming ZHU Ming SHEN Fa-ling
(Department of Urology,Anhui Provincial Hospital ,Hefei, 230001)
ZHU Huai-pingLING Bin DAI Hai-ming WU Jing-sheng
(Laboratory Center Anhui Provincial Hospital)
, 百拇医药 Abstract Purpose: In order to find a more sensitive and noninvasive assay for the diagnosis of urothelia cancer. Methods: It was analyzed by Polymerase chain reaction- Enzyme linked immunosorbent assay (PCR-ELISA) that telomerase activity in urine-neoplasitic patients. Results: The positive rate of telomerase in urine exfoliated cells between urothelial cancer and renal cancer or nonneoplasia diseases existed significant difference (P<0.01).There was no correlation between the expression of telomerase activity and differentiation of the tumor or clinical stage (P>0.05). Conclusions: PCR-ELISA assay to detect telomerase positive cells in urine exfoliated cells might be a useful tool in identification and monitoring of patients with urothelial neoplasm.
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Key words Telomerase Urine Exfoliated cells Urologic neoplasms
端粒酶通过合成端粒重复序列(TTAGGG)以维持真核细胞染色体末端的长度而影响细胞的存亡，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。近年来随着分子生物学技术的迅速发展，人们对肿瘤组织中端粒酶的研究更为深入，发现98%的肿瘤组织端粒酶为阳性〔1〕，而且抑制端粒酶的活性可抑制肿瘤细胞的生长，因而指出端粒酶活性可作为特异的肿瘤标记用于诊断。本研究通过检测尿脱落细胞端粒酶活性表达，旨在寻求一种敏感、特异、无创伤的诊断尿路上皮癌的方法。
1 材料与方法
1.1 临床资料
受检患者为1997年9月～1998年12月在我院经病理证实的膀胱癌54例，其中变移上皮癌53例，腺上皮癌1例；高分化者(G1)12例，中分化者(G2)34例，低分化者(G3)8例；T1期21例，T2期26例，T3期6例，T4期1例。原发性输尿管癌2例，均为变移上皮癌，属G2、T2期。肾盂癌3例，其中变移上皮癌2例，鳞状上皮癌1例。对照组：肾癌10例(其中有2例病理证实侵及肾盂)，非泌尿系肿瘤10例(其中胃癌4例，肺癌2例，肝癌2例，急性粒细胞白血病2例)，正常人10例，前列腺增生症5例，尿路感染10例，泌尿系结石5例，泌尿系结核5例，肾小球肾炎8例。
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1.2 主要试剂
端粒酶检测的主要试剂购于Boehringer Mannheim。
1.3 方法
取受检者(行手术治疗者于术前)任意时间排出的尿液100 ml，即刻离心沉淀获得脱落细胞，用生理盐水洗涤2次，-80℃保存，待测。应用PCR-ELISA法检测端粒酶的活性。①细胞提取物的制备：取尿脱落细胞(0.5～1.0)×106加入裂解液200 μl，混匀，冰浴30 min，4℃，12 000 r/min，离心15 min，取上清液供检测。②TRAP反应：PCR反应体(含有生物标记的引物、Taq酶、dNTP等)20 μl加入2 μl抽提液，加入23 μl DEPC水，混匀，封石蜡，25℃ 1 h，94℃ 5 min；然后进行PCR扩增：94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，循环30次，72℃ 10 min。③扩增产物的检测：取扩增产物5 μl加变性液20 μl，变性10 min，加入225 μl杂交液(含有地高辛标记的特异探针)，充分混匀，吸取100 μl混合液进行ELISA检测，结果用OPD显色，1 mol/L硫酸终止反应。测吸光度A450～690值。④阳性标准：A>0.2为阳性。
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1.4 统计学方法
对实验所获得的数据采用方差分析和四表格的确切概率法进行检验。
2 结果
2.1 尿路上皮癌患者与对照组尿脱落细胞端粒酶活性检测结果
尿路上皮癌患者尿脱落细胞端粒酶活性表达率为88.1%，肾癌患者中的1例尿脱落细胞端粒酶表达阳性系肾癌组织侵及肾盂者，而各良性疾病的对照者中仅1例泌尿系结核患者尿脱落细胞端粒酶表达为阳性(表1)。
表1 尿路上皮癌患者与对照组尿脱落细胞端粒酶活性检测结果 分组
检测例数
阳性例数
百分率/%
, 百拇医药
尿路上皮癌
59
52
88.1
对照组
肾癌
10
1
10.0
非泌尿系肿瘤
10
0
0
, 百拇医药 前列腺增生症
5
0
0
尿路感染
10
0
0
泌尿系结核
5
1
20.0
泌尿系结石
5
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0
0
肾小球肾炎
8
0
0
正常人
10
0
0
2.2 不同临床分期膀胱癌患者尿脱落细胞端粒酶活性检测结果
癌细胞浸润深度对检测结果无明显的影响(表2)。
, 百拇医药 表2 不同临床分期膀胱癌患者尿脱落细胞端粒酶活性检测结果 分组
检测例数
阳性例数
百分率/%
T1
21
18
85.7
T2
26
23
88.5
, 百拇医药
T3
6
6
100
T4
1
1
100
2.3 不同细胞分化程度膀胱癌患者尿脱落细胞端粒酶活性检测结果
癌细胞分化程度对检测结果无明显影响(表3)。
表3 不同癌细胞分化程度膀胱癌患者尿脱落细胞端粒酶活性检测结果 分组
, 百拇医药
检测例数
阳性例数
百分率/%
G1
12
10
83.3
G2
34
30
88.2
G3
, http://www.100md.com 8
8
100
3 讨论
端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，是由端粒DNA和与端粒DNA特异结合的端粒结合蛋白组成的核糖核酸蛋白质复合物。而端粒酶则是由具有模板功能的mRNA和催化活性蛋白组成的核糖核酸蛋白酶，是一种RNA特异的DNA聚合酶，其作用是通过合成端粒DNA阻止端粒的丧失以防止细胞的老化和死亡，从而获得永生。因此端粒和端粒酶具有重要的生物学功能，在肿瘤的形成过程中发挥着重要作用。一组资料表明，恶性肿瘤组织端粒酶阳性率为90%～100%，故而人们将端粒酶作为特异的标记用于肿瘤的诊断〔1，2〕。尿路上皮癌的诊断方法虽然很多，但都存在着一些局限性：影像学检查乃间接征象；腔内器械检查配合活组织病理诊断虽很准确，但给患者带来了巨大的痛苦，无疑不适宜作为肿瘤的筛选和普查；传统的尿脱落细胞病理检查虽然无创伤，然而阳性率仅为8%～46%〔3〕，而且感染、结石等均可影响细胞的形态而造成假阳性。因此，建立敏感、特异且无创伤的肿瘤检测方法对尿路上皮癌尤为重要。1997年Yoshida等率先报道采用TRAP法检测22例尿路上皮癌的尿脱落细胞之端粒酶活性，结果阳性表达为62%(16/26)，而且敏感度可达10个细胞水平，特异性96%(80/85)〔2〕。继之Kinoshita等报道了一组尿端粒酶研究，89%为阳性〔4〕。本组尿路上皮癌尿脱落细胞端粒酶的活性表达率为88.1%(52/59)，特异性92.6%(113/122)，与文献报道相仿。对照组的1例假阳性(即1例泌尿系结核患者)可能与结核之破坏和增殖共同存在的特殊病理学行为有关，表明该方法有很强的特异性与敏感性。况且研究采用的PCR-ELISA法〔5〕不仅操作简便，而且敏感、无放射线污染、实验周期短、24 h内即可完成。所用标本乃患者排出的新鲜尿液，取材方便，无创伤。因此认为此种基因诊断方法可作为尿路上皮癌早期诊断、疗效评估和术后监测的一种有效手段，具有广阔的前景。
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参考文献
1,Shore D. Telomerase: Different means to common ends. Nature, 1997，385: 676～682
2,Holt S E, Shay J W, Wright W E. Refining the telomere-telomerase hypothesis of aging and cancer. Nature Biotechnol, 1996，14: 836～839
3,Kinoshita H, Ogawa O, Kakehi Y, et al. Detection of telomerase activity in exfoliated cells in urine from patients with bladder cancer. J Natl Cancer Inst, 1997，89: 724～730
4,Yoshida K, Sugino T, Tahara H, et al. Telomerase activity in bladder carcinoma and its implication for noninvasive diagnosis by detection of exfoliated cancer cells in urine. Cancer, 1997,79: 362～369
5,卫立辛，郭亚军，阎振林，等. 检测人端粒酶活性的端粒酶TRAP-ELISA法的建立.中华肿瘤杂志， 1998，20：264～266
(收稿 1999-07-05), http://www.100md.com
单位：吴逵 诸禹平 舒启安 张祖明 朱明 沈法林(安徽省立医院泌尿外科 合肥，230001)；祝怀平 戴海明 凌斌 吴竞生(安徽省立医院中心实验室)
关键词：端粒酶；尿液；脱落细胞；泌尿系肿瘤
临床泌尿外科杂志000511 摘要 目的：探讨尿脱落细胞端粒酶活性表达对尿路上皮癌的诊断价值。方法；采用PCR-ELISA法检测尿液中脱落的肿瘤细胞端粒酶活性，并以肾癌及非肿瘤患者的尿标本作对照。结果： 59例尿路上皮癌患者尿脱落细胞端粒酶活性表达率为88.1%，而肾癌患者为10.0%，非肿瘤患者为20.0%，前者与后两者比较，有极显著性差异(P<0.01)；不同分化程度及不同临床分期膀胱癌患者尿脱落细胞端粒酶活性表达率无显著性差异(P>0.05)。结论：检测尿脱落细胞端粒酶活性表达可作为尿路上皮癌早期诊断、疗效评估和术后监测的一种有效手段。
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Telomerase activity in urine exfoliurothelial cancer
WU Kui ZHU Yu-ping SHU Qi-an
ZHANG Zhu-ming ZHU Ming SHEN Fa-ling
(Department of Urology,Anhui Provincial Hospital ,Hefei, 230001)
ZHU Huai-pingLING Bin DAI Hai-ming WU Jing-sheng
(Laboratory Center Anhui Provincial Hospital)
, 百拇医药 Abstract Purpose: In order to find a more sensitive and noninvasive assay for the diagnosis of urothelia cancer. Methods: It was analyzed by Polymerase chain reaction- Enzyme linked immunosorbent assay (PCR-ELISA) that telomerase activity in urine-neoplasitic patients. Results: The positive rate of telomerase in urine exfoliated cells between urothelial cancer and renal cancer or nonneoplasia diseases existed significant difference (P<0.01).There was no correlation between the expression of telomerase activity and differentiation of the tumor or clinical stage (P>0.05). Conclusions: PCR-ELISA assay to detect telomerase positive cells in urine exfoliated cells might be a useful tool in identification and monitoring of patients with urothelial neoplasm.
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Key words Telomerase Urine Exfoliated cells Urologic neoplasms
端粒酶通过合成端粒重复序列(TTAGGG)以维持真核细胞染色体末端的长度而影响细胞的存亡，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。近年来随着分子生物学技术的迅速发展，人们对肿瘤组织中端粒酶的研究更为深入，发现98%的肿瘤组织端粒酶为阳性〔1〕，而且抑制端粒酶的活性可抑制肿瘤细胞的生长，因而指出端粒酶活性可作为特异的肿瘤标记用于诊断。本研究通过检测尿脱落细胞端粒酶活性表达，旨在寻求一种敏感、特异、无创伤的诊断尿路上皮癌的方法。
1 材料与方法
1.1 临床资料
受检患者为1997年9月～1998年12月在我院经病理证实的膀胱癌54例，其中变移上皮癌53例，腺上皮癌1例；高分化者(G1)12例，中分化者(G2)34例，低分化者(G3)8例；T1期21例，T2期26例，T3期6例，T4期1例。原发性输尿管癌2例，均为变移上皮癌，属G2、T2期。肾盂癌3例，其中变移上皮癌2例，鳞状上皮癌1例。对照组：肾癌10例(其中有2例病理证实侵及肾盂)，非泌尿系肿瘤10例(其中胃癌4例，肺癌2例，肝癌2例，急性粒细胞白血病2例)，正常人10例，前列腺增生症5例，尿路感染10例，泌尿系结石5例，泌尿系结核5例，肾小球肾炎8例。
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1.2 主要试剂
端粒酶检测的主要试剂购于Boehringer Mannheim。
1.3 方法
取受检者(行手术治疗者于术前)任意时间排出的尿液100 ml，即刻离心沉淀获得脱落细胞，用生理盐水洗涤2次，-80℃保存，待测。应用PCR-ELISA法检测端粒酶的活性。①细胞提取物的制备：取尿脱落细胞(0.5～1.0)×106加入裂解液200 μl，混匀，冰浴30 min，4℃，12 000 r/min，离心15 min，取上清液供检测。②TRAP反应：PCR反应体(含有生物标记的引物、Taq酶、dNTP等)20 μl加入2 μl抽提液，加入23 μl DEPC水，混匀，封石蜡，25℃ 1 h，94℃ 5 min；然后进行PCR扩增：94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，循环30次，72℃ 10 min。③扩增产物的检测：取扩增产物5 μl加变性液20 μl，变性10 min，加入225 μl杂交液(含有地高辛标记的特异探针)，充分混匀，吸取100 μl混合液进行ELISA检测，结果用OPD显色，1 mol/L硫酸终止反应。测吸光度A450～690值。④阳性标准：A>0.2为阳性。
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1.4 统计学方法
对实验所获得的数据采用方差分析和四表格的确切概率法进行检验。
2 结果
2.1 尿路上皮癌患者与对照组尿脱落细胞端粒酶活性检测结果
尿路上皮癌患者尿脱落细胞端粒酶活性表达率为88.1%，肾癌患者中的1例尿脱落细胞端粒酶表达阳性系肾癌组织侵及肾盂者，而各良性疾病的对照者中仅1例泌尿系结核患者尿脱落细胞端粒酶表达为阳性(表1)。
表1 尿路上皮癌患者与对照组尿脱落细胞端粒酶活性检测结果 分组
检测例数
阳性例数
百分率/%
, 百拇医药
尿路上皮癌
59
52
88.1
对照组
肾癌
10
1
10.0
非泌尿系肿瘤
10
0
0
, 百拇医药 前列腺增生症
5
0
0
尿路感染
10
0
0
泌尿系结核
5
1
20.0
泌尿系结石
5
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0
0
肾小球肾炎
8
0
0
正常人
10
0
0
2.2 不同临床分期膀胱癌患者尿脱落细胞端粒酶活性检测结果
癌细胞浸润深度对检测结果无明显的影响(表2)。
, 百拇医药 表2 不同临床分期膀胱癌患者尿脱落细胞端粒酶活性检测结果 分组
检测例数
阳性例数
百分率/%
T1
21
18
85.7
T2
26
23
88.5
, 百拇医药
T3
6
6
100
T4
1
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2.3 不同细胞分化程度膀胱癌患者尿脱落细胞端粒酶活性检测结果
癌细胞分化程度对检测结果无明显影响(表3)。
表3 不同癌细胞分化程度膀胱癌患者尿脱落细胞端粒酶活性检测结果 分组
, 百拇医药
检测例数
阳性例数
百分率/%
G1
12
10
83.3
G2
34
30
88.2
G3
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3 讨论
端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，是由端粒DNA和与端粒DNA特异结合的端粒结合蛋白组成的核糖核酸蛋白质复合物。而端粒酶则是由具有模板功能的mRNA和催化活性蛋白组成的核糖核酸蛋白酶，是一种RNA特异的DNA聚合酶，其作用是通过合成端粒DNA阻止端粒的丧失以防止细胞的老化和死亡，从而获得永生。因此端粒和端粒酶具有重要的生物学功能，在肿瘤的形成过程中发挥着重要作用。一组资料表明，恶性肿瘤组织端粒酶阳性率为90%～100%，故而人们将端粒酶作为特异的标记用于肿瘤的诊断〔1，2〕。尿路上皮癌的诊断方法虽然很多，但都存在着一些局限性：影像学检查乃间接征象；腔内器械检查配合活组织病理诊断虽很准确，但给患者带来了巨大的痛苦，无疑不适宜作为肿瘤的筛选和普查；传统的尿脱落细胞病理检查虽然无创伤，然而阳性率仅为8%～46%〔3〕，而且感染、结石等均可影响细胞的形态而造成假阳性。因此，建立敏感、特异且无创伤的肿瘤检测方法对尿路上皮癌尤为重要。1997年Yoshida等率先报道采用TRAP法检测22例尿路上皮癌的尿脱落细胞之端粒酶活性，结果阳性表达为62%(16/26)，而且敏感度可达10个细胞水平，特异性96%(80/85)〔2〕。继之Kinoshita等报道了一组尿端粒酶研究，89%为阳性〔4〕。本组尿路上皮癌尿脱落细胞端粒酶的活性表达率为88.1%(52/59)，特异性92.6%(113/122)，与文献报道相仿。对照组的1例假阳性(即1例泌尿系结核患者)可能与结核之破坏和增殖共同存在的特殊病理学行为有关，表明该方法有很强的特异性与敏感性。况且研究采用的PCR-ELISA法〔5〕不仅操作简便，而且敏感、无放射线污染、实验周期短、24 h内即可完成。所用标本乃患者排出的新鲜尿液，取材方便，无创伤。因此认为此种基因诊断方法可作为尿路上皮癌早期诊断、疗效评估和术后监测的一种有效手段，具有广阔的前景。
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参考文献
1,Shore D. Telomerase: Different means to common ends. Nature, 1997，385: 676～682
2,Holt S E, Shay J W, Wright W E. Refining the telomere-telomerase hypothesis of aging and cancer. Nature Biotechnol, 1996，14: 836～839
3,Kinoshita H, Ogawa O, Kakehi Y, et al. Detection of telomerase activity in exfoliated cells in urine from patients with bladder cancer. J Natl Cancer Inst, 1997，89: 724～730
4,Yoshida K, Sugino T, Tahara H, et al. Telomerase activity in bladder carcinoma and its implication for noninvasive diagnosis by detection of exfoliated cancer cells in urine. Cancer, 1997,79: 362～369
5,卫立辛，郭亚军，阎振林，等. 检测人端粒酶活性的端粒酶TRAP-ELISA法的建立.中华肿瘤杂志， 1998，20：264～266
(收稿 1999-07-05), http://www.100md.com