哮喘豚鼠支气管肺组织IL-5及GM-CSFmRNA表达
作者：郭晓明 郭爱云 王长征 钱桂生
单位：郭晓明 郭爱云(075000 河北省张家口市，中国人民解放军第二五一医院)；王长征 钱桂生(400037 重庆市，第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所)
关键词：
实用医学杂志000507 摘 要 目的：探讨白介素-5(IL-5)及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在哮喘豚鼠支气管肺组织中的表达。方法：实验分为哮喘组和对照组，每组各15只豚鼠。采用原位杂交方法检测两组豚鼠支气管肺组织的IL-5和GM-CSFmRNA表达。结果：哮喘组支气管肺组织IL-5和GM-CSFmRNA表达强度(细胞数/HP)分别为36.00±8.00和32.00±9.00，对照组分别为14.00±5.00和18.00±7.00，哮喘组IL-5和GM-CSFmRNA表达强度显著高于对照组(P<0.01)。哮喘组肺组织嗜酸细胞(EOS)浸润密度(细胞数/HP)为48.00±26.00，对照组为19.00±6.00，哮喘组显著高于对照组(P<0.01)。结论：哮喘豚鼠支气管肺组织IL-5和GM-CSFmRNA高表达可能在气道炎症中发挥重要作用。
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支气管哮喘是由T淋巴细胞等参与的气道慢性炎症性疾病。哮喘时活化的T淋巴细胞增加[1]使IL-3，IL-5，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等分泌增多，从而促进嗜酸细胞(EOS)在骨髓的生成增多，以及在气道局部的募集、活化，并延长EOS存活时间。本实验观察了哮喘豚鼠和正常豚鼠肺组织IL-5及GM-CSFmRNA的表达。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 IL-5，GM-CSF探针由重庆第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所赖克方博士合成并惠赠。IL-5探针序列为3’-CACTCGGTGTTCATTACAVCCAAGAAACTCT-5’；GM-CSF探针序列为3’-CTGACGACCCTCGCTGGTCAGGTCC-5’。
1.2 哮喘豚鼠模型 雄性健康豚鼠400～500 g，30只随机分为哮喘组和对照组。第1天腹腔注射2%卵白蛋白(OA)生理盐水1 ml致敏豚鼠，第8天重复注射以加强致敏，第21天吸入2% OA生理盐水至出现哮喘样发作为止。吸入前腹腔注射抗组胺药苯海拉明(5 mg/kg)，对照组豚鼠按以上方法应用生理盐水代替OA。
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1.3 留取肺组织 分别留取哮喘豚鼠和正常豚鼠的肺组织，液氮速冻后制成5 μ m厚冰冻切片，置于-70°保存备用。
1.4 支气管肺组织IL-5，GM-CSFmRNA原位杂交检测 取支气管肺组织冰冻切片，0.1 M PBS漂洗5 min，0.3% Triton X-100 20 min，蛋白酶K(2 ng/ml)37℃下，30 min，4%多聚甲醛5 min，(1.33%三乙醇胺+0.25%乙酸酐)/0.1 M Tris-HCl，pH 8.0 10 min，2×SSC漂洗10 min，杂交液(每片加含有IL-5，GM-CSF探针标记液20 μ l)45℃下20 h，4×SSC 37℃下15 min，2×SSC 37℃下30 min，依次转入1×SSC，0.5×SSC中37℃下各10 min，0.05 M PBS漂洗15 min，加Anti-Dig-AP抗体(1∶1 000)37℃下1 h，转入4℃下20 h，TSM1及TSM2各10 min，NBT/BCIP显色3～4 h，0.05 M PBS漂洗终止反应，中性树胶封片。杂交前所需液体及试剂均需DEPC无RNAase处理。
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1.5 统计分析 支气管肺组织IL-5，GM-CSFmRNA表达强度和EOS浸润密度，在高倍视野(×400)下，随机选择10个视野计数IL-5或GM-CSFmRNA表达及EOS的阳性细胞数，单位面积内的表达强度用10个高倍视野下IL-5mRNA或GM-CSFmRNA及EOS阳性细胞数的平均值表示(细胞数/HP)。资料采用非配对资料t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 结果判定 IL-5，GM-CSFmRNA阳性信号为紫蓝色或棕蓝色颗粒，主要集中在胞核区及核周边区域。
2.2 豚鼠支气管肺组织IL-5mRNA和GM-CSFmRNA表达强度 哮喘组IL-5和GM-CSFmRNA单位面积内的阳性细胞数显著高于对照组，见表1。
2.3 豚鼠肺组织EOS浸润密度 即阳性细胞数/HP，哮喘组肺组织EOS为48.00±26.00，对照组是19.00±6.00，两组比较，P<0.01。
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表1 两组豚鼠支气管肺组织IL-5和GM-CSFmRNA表达强度(细胞数/HP) 项目
哮喘组
对照组
IL-5mRNA
36.00±8.00△
14.00±5.00
GM-CSFmRNA
32.00±9.00△
18.00±7.00
注：与对照组比较△P<0.01
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3 讨论
哮喘时支气管粘膜、痰及支气管肺泡灌洗液中均表达高水平IL-5，GM-CSF等，而正常对照组则表达很低[2]。同样，哮喘动物模型，哮喘患者支气管肺组织及支气管肺泡灌洗液中均有EOS数量增多，且与气道高反应性呈正相关。这种EOS增多是由机体接触抗原触发的，其主要途径为抗原进入机体，活化Th2样淋巴细胞，产生大量细胞因子(IL-5，IL-3，GM-CSF等)，促进EOS在骨髓分化、成熟，增加EOS的存活时间，还有促EOS趋化作用，使大量EOS在气道局部募集。其中IL-5特异性作用于EOS的生成与分化的各个阶段，从而活化和延长EOS的生存时间，EOS在肺组织内浸润与活化引起气道炎症和气道高反应性的过程受IL-5调控[3]。IL-5，GM-CSF本身并不损伤气道，但通过促进EOS的产生、活化及介质释放等作用在哮喘气道炎症中发挥重要作用。给豚鼠模型的气道内滴入IL-5可诱导EOS增多及气道高反应性发生[4]，而抗IL-5抗体可抑制这些作用[5]。IL-5、GM-CSF可延长EOS的存活时间，使正常密度的EOS转化为低密度表型，增强EOS对趋化因子的反应[6]。本实验哮喘豚鼠肺组织中既有IL-5和GM-CSFmRNA表达显著升高，又有EOS的明显升高，揭示可能在哮喘的发病中起重要作用。
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参考文献
1 Corrigan CJ,Kay AB. CD4 T-lymphocyte activation in acute severe asthma：relationship to disease severity and atopic status. Am Rve Respir Dis,1990,141(4 Pt 1)：970.
2，Gelder GM,Morrison JFJ,Southoott SM,et al. Cytokine mRNA profiles in asthmatic endobronchial biopsies. Am Rev Respir Dis,1993,147:A786.
3，Walker C,Kaegi MK,Braun P,et al. Activaed T cells and eosinophilia in bronchoalveolar lavages from subjects with asthma correlated with disease severity. J Allergy Clin Immunol,1991,88(6):935～942.
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4，Iwama T,Nagai H,Tsuruoka N,et al. Effect of murine recombinant interleukin-5 on bronchial reactivity in guinea pigs. Clin Eep Allergy,1993,23(1):32～38.
5，Shi H,Qin S,Huang G,et al. Infiltration of eosinophils into the asthmatic airways caused by interleulin-5. Am J Respir Cell Mol Biol,1997,16(3):220～224.
6，Warringa RA,Koenderman L,Kok PT,et al. Modulation and induction of eosinophil chemotaxis by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3. Blood,1991,77(12):2694～2700., http://www.100md.com
单位：郭晓明 郭爱云(075000 河北省张家口市，中国人民解放军第二五一医院)；王长征 钱桂生(400037 重庆市，第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所)
关键词：
实用医学杂志000507 摘 要 目的：探讨白介素-5(IL-5)及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在哮喘豚鼠支气管肺组织中的表达。方法：实验分为哮喘组和对照组，每组各15只豚鼠。采用原位杂交方法检测两组豚鼠支气管肺组织的IL-5和GM-CSFmRNA表达。结果：哮喘组支气管肺组织IL-5和GM-CSFmRNA表达强度(细胞数/HP)分别为36.00±8.00和32.00±9.00，对照组分别为14.00±5.00和18.00±7.00，哮喘组IL-5和GM-CSFmRNA表达强度显著高于对照组(P<0.01)。哮喘组肺组织嗜酸细胞(EOS)浸润密度(细胞数/HP)为48.00±26.00，对照组为19.00±6.00，哮喘组显著高于对照组(P<0.01)。结论：哮喘豚鼠支气管肺组织IL-5和GM-CSFmRNA高表达可能在气道炎症中发挥重要作用。
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支气管哮喘是由T淋巴细胞等参与的气道慢性炎症性疾病。哮喘时活化的T淋巴细胞增加[1]使IL-3，IL-5，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等分泌增多，从而促进嗜酸细胞(EOS)在骨髓的生成增多，以及在气道局部的募集、活化，并延长EOS存活时间。本实验观察了哮喘豚鼠和正常豚鼠肺组织IL-5及GM-CSFmRNA的表达。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 IL-5，GM-CSF探针由重庆第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所赖克方博士合成并惠赠。IL-5探针序列为3’-CACTCGGTGTTCATTACAVCCAAGAAACTCT-5’；GM-CSF探针序列为3’-CTGACGACCCTCGCTGGTCAGGTCC-5’。
1.2 哮喘豚鼠模型 雄性健康豚鼠400～500 g，30只随机分为哮喘组和对照组。第1天腹腔注射2%卵白蛋白(OA)生理盐水1 ml致敏豚鼠，第8天重复注射以加强致敏，第21天吸入2% OA生理盐水至出现哮喘样发作为止。吸入前腹腔注射抗组胺药苯海拉明(5 mg/kg)，对照组豚鼠按以上方法应用生理盐水代替OA。
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1.3 留取肺组织 分别留取哮喘豚鼠和正常豚鼠的肺组织，液氮速冻后制成5 μ m厚冰冻切片，置于-70°保存备用。
1.4 支气管肺组织IL-5，GM-CSFmRNA原位杂交检测 取支气管肺组织冰冻切片，0.1 M PBS漂洗5 min，0.3% Triton X-100 20 min，蛋白酶K(2 ng/ml)37℃下，30 min，4%多聚甲醛5 min，(1.33%三乙醇胺+0.25%乙酸酐)/0.1 M Tris-HCl，pH 8.0 10 min，2×SSC漂洗10 min，杂交液(每片加含有IL-5，GM-CSF探针标记液20 μ l)45℃下20 h，4×SSC 37℃下15 min，2×SSC 37℃下30 min，依次转入1×SSC，0.5×SSC中37℃下各10 min，0.05 M PBS漂洗15 min，加Anti-Dig-AP抗体(1∶1 000)37℃下1 h，转入4℃下20 h，TSM1及TSM2各10 min，NBT/BCIP显色3～4 h，0.05 M PBS漂洗终止反应，中性树胶封片。杂交前所需液体及试剂均需DEPC无RNAase处理。
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1.5 统计分析 支气管肺组织IL-5，GM-CSFmRNA表达强度和EOS浸润密度，在高倍视野(×400)下，随机选择10个视野计数IL-5或GM-CSFmRNA表达及EOS的阳性细胞数，单位面积内的表达强度用10个高倍视野下IL-5mRNA或GM-CSFmRNA及EOS阳性细胞数的平均值表示(细胞数/HP)。资料采用非配对资料t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 结果判定 IL-5，GM-CSFmRNA阳性信号为紫蓝色或棕蓝色颗粒，主要集中在胞核区及核周边区域。
2.2 豚鼠支气管肺组织IL-5mRNA和GM-CSFmRNA表达强度 哮喘组IL-5和GM-CSFmRNA单位面积内的阳性细胞数显著高于对照组，见表1。
2.3 豚鼠肺组织EOS浸润密度 即阳性细胞数/HP，哮喘组肺组织EOS为48.00±26.00，对照组是19.00±6.00，两组比较，P<0.01。
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表1 两组豚鼠支气管肺组织IL-5和GM-CSFmRNA表达强度(细胞数/HP) 项目
哮喘组
对照组
IL-5mRNA
36.00±8.00△
14.00±5.00
GM-CSFmRNA
32.00±9.00△
18.00±7.00
注：与对照组比较△P<0.01
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3 讨论
哮喘时支气管粘膜、痰及支气管肺泡灌洗液中均表达高水平IL-5，GM-CSF等，而正常对照组则表达很低[2]。同样，哮喘动物模型，哮喘患者支气管肺组织及支气管肺泡灌洗液中均有EOS数量增多，且与气道高反应性呈正相关。这种EOS增多是由机体接触抗原触发的，其主要途径为抗原进入机体，活化Th2样淋巴细胞，产生大量细胞因子(IL-5，IL-3，GM-CSF等)，促进EOS在骨髓分化、成熟，增加EOS的存活时间，还有促EOS趋化作用，使大量EOS在气道局部募集。其中IL-5特异性作用于EOS的生成与分化的各个阶段，从而活化和延长EOS的生存时间，EOS在肺组织内浸润与活化引起气道炎症和气道高反应性的过程受IL-5调控[3]。IL-5，GM-CSF本身并不损伤气道，但通过促进EOS的产生、活化及介质释放等作用在哮喘气道炎症中发挥重要作用。给豚鼠模型的气道内滴入IL-5可诱导EOS增多及气道高反应性发生[4]，而抗IL-5抗体可抑制这些作用[5]。IL-5、GM-CSF可延长EOS的存活时间，使正常密度的EOS转化为低密度表型，增强EOS对趋化因子的反应[6]。本实验哮喘豚鼠肺组织中既有IL-5和GM-CSFmRNA表达显著升高，又有EOS的明显升高，揭示可能在哮喘的发病中起重要作用。
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参考文献
1 Corrigan CJ,Kay AB. CD4 T-lymphocyte activation in acute severe asthma：relationship to disease severity and atopic status. Am Rve Respir Dis,1990,141(4 Pt 1)：970.
2，Gelder GM,Morrison JFJ,Southoott SM,et al. Cytokine mRNA profiles in asthmatic endobronchial biopsies. Am Rev Respir Dis,1993,147:A786.
3，Walker C,Kaegi MK,Braun P,et al. Activaed T cells and eosinophilia in bronchoalveolar lavages from subjects with asthma correlated with disease severity. J Allergy Clin Immunol,1991,88(6):935～942.
, 百拇医药
4，Iwama T,Nagai H,Tsuruoka N,et al. Effect of murine recombinant interleukin-5 on bronchial reactivity in guinea pigs. Clin Eep Allergy,1993,23(1):32～38.
5，Shi H,Qin S,Huang G,et al. Infiltration of eosinophils into the asthmatic airways caused by interleulin-5. Am J Respir Cell Mol Biol,1997,16(3):220～224.
6，Warringa RA,Koenderman L,Kok PT,et al. Modulation and induction of eosinophil chemotaxis by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3. Blood,1991,77(12):2694～2700., http://www.100md.com