家兔颅脑创伤后内皮素及其A受体在脑血流量变化中的作用
作者：张云东 邹咏文 许民辉 朱佩芳 王正国
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所神经外科 重庆 400042
关键词：内皮素；内皮素A受体；脑创伤；脑血流量
重庆医学000505 摘 要 目的 了解家兔颅脑创伤后内皮素及其A受体在脑血流量变化中的作用及意义。方法 家兔致以左额顶叶为着力部位的加速性撞击伤，动态观察脑组织内皮素含量变化、内皮素A受体mRNA表达和定位变化，内皮素A受体拮抗剂BQ123的作用，及上述变化对脑血流量变化的影响。结果 脑创伤后局部脑组织内皮素含量显著升高；内皮素A受体mRNA主要分布于脑血管内皮细胞，表达显著增强；创伤后局部脑血流量显著降低，应用BQ123治疗的动物，脑血流量下降被明显抑制。结论 内皮素通过其A受体的调节在颅脑创伤后脑缺血的形成中具有重要作用；应用内皮素A受体拮抗剂可防治颅脑创伤后脑缺血。
, 百拇医药
The Role and Significance of Endothelin and Its A Receptor in the Changes of Cerebral Blood Flow after Traumatic Brain Injury in Rabbits
Zhang Yundong,Zuo Yongwen,Xu Minhui. et.al
(Department of Neurosurgery, Daping Hospital,Research Institute of Field
Surgery,Third Military Medical University, Chongqing 400042)
Abstract Objective:To investigate the role of endothelin and its A receptor in cerebral blood flow(CBF) change after traumatic brain injury(TBI).Methods:The changes of endothlin-1 content,the expression and locatioin of messenger ribonucleic acid (mRNA) of endothelin A receptor,the function of endothelin A receptor antagonist BQ123,and the effects caused by all above to regional CBF were dynamically observed on the models of TBI of adult rabbits.Results:After trauma,the production of endothelin-1 incresed significantly in regional brain tissues;mRNA expression of endothlin A receptor predominantly distributed on cerebal endothelial cells and incresed apparently; Regional CBF delined significently,but by using selective endothelin A receptor antagonist BQ123 to treat the rabbits, the decrease of CBF could be apparently prevented.Conclusion:Endithelin-1 may primarily contribute to CBF decrease after TBI,and the effects of endothelin-1 is mediated through endothelin A receptor;Endothelin A receptor antagonist can prevent CBF decrease after TBI.
, http://www.100md.com
Key words:Endothelin-1 Endothelin A receptor Traumatic brain injury Cerebral blood flow
笔者研究颅脑创伤后内皮素及其A受体在局部脑组织的含量变化，以探讨其对局部脑血流量变化的影响。
1 材料和方法
1.1 动物分组及处理 健康4～5月龄雄性家兔130只，体重2.7±0.5kg，随机分为：假伤对照组35只，颅脑撞击伤组45只，颅脑撞击伤治疗组25只和治疗对照组25只。除假伤对照组外，其余各组又分成伤后30分钟、2小时、8小时和24小时。治疗组：以Brures图谱[1]定位，参照Feuerstein[2]方法，伤后立即从脑室给予拮抗剂BQ125 18μg体积5μl。治疗对照组则给予载体磷酸缓冲液(pH7.5)5μl。3%戊巴比妥钠静脉注射麻醉(30mg/kg)后，用BIM-2型生物撞击机，以左侧额顶部为着力部位，调节高压气舱压力为0.7MPa，二次锤撞击速度8m/s，撞击幅度为0.4cm。
, 百拇医药
1.2 局部脑组织ET-1含量的测定 按301医院长城免疫技术研究所提供的ET放免药盒说明书进行。
1.3 脑组织ETA受体mRNA的检测 用地高辛标记ETA受体cDNA探针，采用漂浮法行原位杂交[3]，于光镜200倍下任选10个视野对阳性细胞定量计数。
1.4 局部脑血流量的测定 固定头部，按Brures图谱确定皮层、基底节和海马坐标，依伤后各时相点用POG-200型末梢循环血流量测定仪测量血流量。
1.5 病理学观察。
1.6 数据处理 依不同情况单因素和双因素方差分析。
2 结 果
2.1 伤后ET-1含量的变化 伤后30分钟即发现大脑皮质、基底节、海马处ET-1含量较假伤对照组显著升高(P<0.05)，三部位组织均于伤后2小时达高峰。
, 百拇医药
2.2 伤后脑组织ETA受体mRNA原位杂交结果 正常ETA受体mRNA在血管内皮细胞有少量表达，伤后ETA受体mRNA在血管内皮细胞明显增强，在皮质、基底节和海马可见较多阳性染色的血管内皮细胞。
2.3 局部脑血流量变化 伤后0.5小时大脑皮质、基底节、海马血流量即迅速下降，2小时下降至最低点，24小时仍较伤前明显降低。使用ET受体拮抗剂BQ123的动物，脑组织血流量下降明显被抑制，但仍显著低于伤前水平(见表1)。
2.4 病理改变 光镜：伤后2小时脑实质呈点、片状出血，神经细胞呈缺血性改变，血管周围间隙增宽。电镜：撞击伤后2小时可见血管内皮细胞内腔面出现膨出样小泡指状突起，胞饮小泡数量明显增多，血管周围的神经细胞或其它触突肿胀，空泡形成，神经细胞胞浆变性水肿、空泡化。治疗组上述改变明显减轻。
3 讨 论
家兔颅脑撞击伤后30分钟，脑组织ET-1含量即显著升高，伤后2小时达高峰，24小时仍然处于较高水平，伤后ETA受体mRNA在脑血管内皮细胞上的表达迅速增加；同时测定了脑组织血流量，在伤后30分钟即迅速下降，伤后2小时降致最低点，为伤前的35%，24小时仍显著低于伤前水平。脑创伤后ET含量迅速升高，与脑血管内皮细胞上上调的ETA受体结合，使脑血流量下降，致脑缺血。BQ123治疗的动物，脑血流量下降被显著抑制。推测伤后脑血流的变化，可能是由于伤后脑微血管周围的神经细胞和血管壁细胞合成和释放ET-1显著增加，同时ETA受体在脑血管内皮细胞上的表达迅速增加，ET-1与其A受体结合，激活血管壁ETA受体，发生血管收缩，引起局部血流显著减少[4]。大量释放的ET可能参与脑血管痉挛和脑梗塞的病理过程。有研究发现：蛛网膜下腔出血病人的脑脊液中ET-1含量升高，同时有脑血管痉挛；颅脑撞击伤后常有脑缺血存在，且有血浆和脑脊液ET含量升高，说明ET-1与其A受体结合在脑血管痉挛中可能起重要作用。
, 百拇医药
表1 家兔颅脑撞击伤后脑局部血流量变化(x±s ml/分/100g) 部位
分组
假伤对照组
伤后0.1小时
伤后2小时
伤后8小时
伤后24小时
皮
撞击伤组
62.84±12.74
36.12±8.44△△*
, 百拇医药 23.76±4.46△△**
27.40±10.04△△*
33.31±8.46△△**
质
治疗组
63.74±11.31
48.63±6.08△
44.60±7.60△△
47.50±9.77△
50.04±6.35△
, 百拇医药
治疗组
63.16±15.00
38.52±10.04△
24.22±4.61△△☆☆
28.62±10.14△△☆
33.91±8.94△△☆
基
撞击伤组
62.78±13.27
37.03±8.34△△
, 百拇医药
21.99±9.38△△**
22.65±5.99△△**
29.97±8.94△△**
底
治疗组
62.61±9.94
49.14±11.20
45.55±9.38△
48.36±5.88△
50.80±9.09
, 百拇医药
节
治疗对照
60.79±14.60
37.38±8.56△
22.05±8.16△△☆☆
23.97±6.27△△☆☆
30.48±7.43△△☆☆
海
撞击伤组
55.75±11.67
33.87±5.53△△
, http://www.100md.com
20.62±7.84△△**
22.22±6.26△△**
28.76±7.66△△**
马
治疗组
56.00±9.48
44.77±9.64△
42.82±6.92△
43.13±5.49△
43.74±10.88
, 百拇医药
治疗对照
52.45±13.25
33.76±5.45△
20.38±6.54△△☆☆
22.13±7.16△△☆☆
28.74±7.81△△☆
与同部位假伤对照组比较：△P<0.05 △△P<0.01
同部位同时相点撞击伤组与治疗组比较：P<0.05 P<0.01
, 百拇医药
同部位同时相点治疗组与治疗对照组比较：☆P<0.05 ☆☆P<0.01
近年以来的研究表明，在脑血管内皮细胞、平滑肌细胞、神经元和胶质细胞均可产生ET，而这些细胞都存在ET特异性受体。ET的真正作用只有在使用ET特异性受体拮抗剂后才会明确。ETA受体的特异性拮抗剂BQ123是一种多肽，BQ123抑制ET-1与ETA受体结合的作用比对ETB受体的作用强2500倍[5]。使用BQ123治疗后，脑池内注入自体血引起的脑血流量下降可被显著抑制。在颅脑撞击伤后使用ETA受体特异性拮抗剂BQ123，可显著阻止脑血流量下降，表明ETA受体参与了脑血管收缩，脑组织血流量下降主要是由脑组织增加的ET-1通过ETA受体引起[6]。
ET-1致脑血流量减少的机制可能为：在脑组织的毛细血管内皮细胞，ET-1与其A受体结合激活磷脂酰肌醇水解和促进DNA的合成[7]。由于三磷酸肌醇(IP3)的形成，IP3可作用于光面内质网和肌浆网，使细胞内贮钙池中Ca2+释放入胞浆，增加细胞内游离Ca2+浓度[8]，而激活细胞内的收缩蛋白，导致血流量下降。伤后脑血流量、脑组织ET-1含量和ETA受体发生了异常改变，由于ET-1对脑血流动力学的严重影响，必然导致脑组织细胞损伤。由此，对ET及其受体各亚型的深入研究，将对颅脑创伤后继发性脑损害的预防和治疗有一定意义。
, 百拇医药
参考文献
1，范进藩，江振裕译.电生理学方法.第一版，上海：科学技术出版社，1963：348
2，Peuerstein G,Gu JL,Ohlstein EH, et al.Peptidic endothelin-1 receptor antagonist BQ123,and neuroprotection. Peptides,1994,15(3):467
3，蔡文琴，王柏主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.第一版，四川：科学技术出版社，1994：415
4，Fuxe K,Kurosawa N,Cintra A,et al.Involvement of local ischemia in endothelin-1 induced lesions of the neostriatum of the anaesthetized rat.Exp Brain Res,1992,88:131
, 百拇医药
5，Inara M,Noguchi K,Saeki T,et al.Biological profiles of highly potent novel endothelin antagonists selective for the ETA receptor.Life Sci,1991,50:247
6，Adner M,You J,Edvinsson L,et al.Characterization of endothelin-A receptors in the cerebral circulation.NeuroReport,1993,4:441
7，Vigne P, Marsault R, Breittmayer PJ, et al.Endothelin stimulates phosphatidy linositol hydrolysis and DNA synthesisin brain caillary endothelial cells.Biochem J,1990,266:415
8，Masaki T.Molecular and cellular mechanism of endothelin fegulation:implications for vascular function.Circulation,1991,84:1457, http://www.100md.com
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所神经外科 重庆 400042
关键词：内皮素；内皮素A受体；脑创伤；脑血流量
重庆医学000505 摘 要 目的 了解家兔颅脑创伤后内皮素及其A受体在脑血流量变化中的作用及意义。方法 家兔致以左额顶叶为着力部位的加速性撞击伤，动态观察脑组织内皮素含量变化、内皮素A受体mRNA表达和定位变化，内皮素A受体拮抗剂BQ123的作用，及上述变化对脑血流量变化的影响。结果 脑创伤后局部脑组织内皮素含量显著升高；内皮素A受体mRNA主要分布于脑血管内皮细胞，表达显著增强；创伤后局部脑血流量显著降低，应用BQ123治疗的动物，脑血流量下降被明显抑制。结论 内皮素通过其A受体的调节在颅脑创伤后脑缺血的形成中具有重要作用；应用内皮素A受体拮抗剂可防治颅脑创伤后脑缺血。
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The Role and Significance of Endothelin and Its A Receptor in the Changes of Cerebral Blood Flow after Traumatic Brain Injury in Rabbits
Zhang Yundong,Zuo Yongwen,Xu Minhui. et.al
(Department of Neurosurgery, Daping Hospital,Research Institute of Field
Surgery,Third Military Medical University, Chongqing 400042)
Abstract Objective:To investigate the role of endothelin and its A receptor in cerebral blood flow(CBF) change after traumatic brain injury(TBI).Methods:The changes of endothlin-1 content,the expression and locatioin of messenger ribonucleic acid (mRNA) of endothelin A receptor,the function of endothelin A receptor antagonist BQ123,and the effects caused by all above to regional CBF were dynamically observed on the models of TBI of adult rabbits.Results:After trauma,the production of endothelin-1 incresed significantly in regional brain tissues;mRNA expression of endothlin A receptor predominantly distributed on cerebal endothelial cells and incresed apparently; Regional CBF delined significently,but by using selective endothelin A receptor antagonist BQ123 to treat the rabbits, the decrease of CBF could be apparently prevented.Conclusion:Endithelin-1 may primarily contribute to CBF decrease after TBI,and the effects of endothelin-1 is mediated through endothelin A receptor;Endothelin A receptor antagonist can prevent CBF decrease after TBI.
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Key words:Endothelin-1 Endothelin A receptor Traumatic brain injury Cerebral blood flow
笔者研究颅脑创伤后内皮素及其A受体在局部脑组织的含量变化，以探讨其对局部脑血流量变化的影响。
1 材料和方法
1.1 动物分组及处理 健康4～5月龄雄性家兔130只，体重2.7±0.5kg，随机分为：假伤对照组35只，颅脑撞击伤组45只，颅脑撞击伤治疗组25只和治疗对照组25只。除假伤对照组外，其余各组又分成伤后30分钟、2小时、8小时和24小时。治疗组：以Brures图谱[1]定位，参照Feuerstein[2]方法，伤后立即从脑室给予拮抗剂BQ125 18μg体积5μl。治疗对照组则给予载体磷酸缓冲液(pH7.5)5μl。3%戊巴比妥钠静脉注射麻醉(30mg/kg)后，用BIM-2型生物撞击机，以左侧额顶部为着力部位，调节高压气舱压力为0.7MPa，二次锤撞击速度8m/s，撞击幅度为0.4cm。
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1.2 局部脑组织ET-1含量的测定 按301医院长城免疫技术研究所提供的ET放免药盒说明书进行。
1.3 脑组织ETA受体mRNA的检测 用地高辛标记ETA受体cDNA探针，采用漂浮法行原位杂交[3]，于光镜200倍下任选10个视野对阳性细胞定量计数。
1.4 局部脑血流量的测定 固定头部，按Brures图谱确定皮层、基底节和海马坐标，依伤后各时相点用POG-200型末梢循环血流量测定仪测量血流量。
1.5 病理学观察。
1.6 数据处理 依不同情况单因素和双因素方差分析。
2 结 果
2.1 伤后ET-1含量的变化 伤后30分钟即发现大脑皮质、基底节、海马处ET-1含量较假伤对照组显著升高(P<0.05)，三部位组织均于伤后2小时达高峰。
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2.2 伤后脑组织ETA受体mRNA原位杂交结果 正常ETA受体mRNA在血管内皮细胞有少量表达，伤后ETA受体mRNA在血管内皮细胞明显增强，在皮质、基底节和海马可见较多阳性染色的血管内皮细胞。
2.3 局部脑血流量变化 伤后0.5小时大脑皮质、基底节、海马血流量即迅速下降，2小时下降至最低点，24小时仍较伤前明显降低。使用ET受体拮抗剂BQ123的动物，脑组织血流量下降明显被抑制，但仍显著低于伤前水平(见表1)。
2.4 病理改变 光镜：伤后2小时脑实质呈点、片状出血，神经细胞呈缺血性改变，血管周围间隙增宽。电镜：撞击伤后2小时可见血管内皮细胞内腔面出现膨出样小泡指状突起，胞饮小泡数量明显增多，血管周围的神经细胞或其它触突肿胀，空泡形成，神经细胞胞浆变性水肿、空泡化。治疗组上述改变明显减轻。
3 讨 论
家兔颅脑撞击伤后30分钟，脑组织ET-1含量即显著升高，伤后2小时达高峰，24小时仍然处于较高水平，伤后ETA受体mRNA在脑血管内皮细胞上的表达迅速增加；同时测定了脑组织血流量，在伤后30分钟即迅速下降，伤后2小时降致最低点，为伤前的35%，24小时仍显著低于伤前水平。脑创伤后ET含量迅速升高，与脑血管内皮细胞上上调的ETA受体结合，使脑血流量下降，致脑缺血。BQ123治疗的动物，脑血流量下降被显著抑制。推测伤后脑血流的变化，可能是由于伤后脑微血管周围的神经细胞和血管壁细胞合成和释放ET-1显著增加，同时ETA受体在脑血管内皮细胞上的表达迅速增加，ET-1与其A受体结合，激活血管壁ETA受体，发生血管收缩，引起局部血流显著减少[4]。大量释放的ET可能参与脑血管痉挛和脑梗塞的病理过程。有研究发现：蛛网膜下腔出血病人的脑脊液中ET-1含量升高，同时有脑血管痉挛；颅脑撞击伤后常有脑缺血存在，且有血浆和脑脊液ET含量升高，说明ET-1与其A受体结合在脑血管痉挛中可能起重要作用。
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表1 家兔颅脑撞击伤后脑局部血流量变化(x±s ml/分/100g) 部位
分组
假伤对照组
伤后0.1小时
伤后2小时
伤后8小时
伤后24小时
皮
撞击伤组
62.84±12.74
36.12±8.44△△*
, 百拇医药 23.76±4.46△△**
27.40±10.04△△*
33.31±8.46△△**
质
治疗组
63.74±11.31
48.63±6.08△
44.60±7.60△△
47.50±9.77△
50.04±6.35△
, 百拇医药
治疗组
63.16±15.00
38.52±10.04△
24.22±4.61△△☆☆
28.62±10.14△△☆
33.91±8.94△△☆
基
撞击伤组
62.78±13.27
37.03±8.34△△
, 百拇医药
21.99±9.38△△**
22.65±5.99△△**
29.97±8.94△△**
底
治疗组
62.61±9.94
49.14±11.20
45.55±9.38△
48.36±5.88△
50.80±9.09
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节
治疗对照
60.79±14.60
37.38±8.56△
22.05±8.16△△☆☆
23.97±6.27△△☆☆
30.48±7.43△△☆☆
海
撞击伤组
55.75±11.67
33.87±5.53△△
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20.62±7.84△△**
22.22±6.26△△**
28.76±7.66△△**
马
治疗组
56.00±9.48
44.77±9.64△
42.82±6.92△
43.13±5.49△
43.74±10.88
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治疗对照
52.45±13.25
33.76±5.45△
20.38±6.54△△☆☆
22.13±7.16△△☆☆
28.74±7.81△△☆
与同部位假伤对照组比较：△P<0.05 △△P<0.01
同部位同时相点撞击伤组与治疗组比较：P<0.05 P<0.01
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同部位同时相点治疗组与治疗对照组比较：☆P<0.05 ☆☆P<0.01
近年以来的研究表明，在脑血管内皮细胞、平滑肌细胞、神经元和胶质细胞均可产生ET，而这些细胞都存在ET特异性受体。ET的真正作用只有在使用ET特异性受体拮抗剂后才会明确。ETA受体的特异性拮抗剂BQ123是一种多肽，BQ123抑制ET-1与ETA受体结合的作用比对ETB受体的作用强2500倍[5]。使用BQ123治疗后，脑池内注入自体血引起的脑血流量下降可被显著抑制。在颅脑撞击伤后使用ETA受体特异性拮抗剂BQ123，可显著阻止脑血流量下降，表明ETA受体参与了脑血管收缩，脑组织血流量下降主要是由脑组织增加的ET-1通过ETA受体引起[6]。
ET-1致脑血流量减少的机制可能为：在脑组织的毛细血管内皮细胞，ET-1与其A受体结合激活磷脂酰肌醇水解和促进DNA的合成[7]。由于三磷酸肌醇(IP3)的形成，IP3可作用于光面内质网和肌浆网，使细胞内贮钙池中Ca2+释放入胞浆，增加细胞内游离Ca2+浓度[8]，而激活细胞内的收缩蛋白，导致血流量下降。伤后脑血流量、脑组织ET-1含量和ETA受体发生了异常改变，由于ET-1对脑血流动力学的严重影响，必然导致脑组织细胞损伤。由此，对ET及其受体各亚型的深入研究，将对颅脑创伤后继发性脑损害的预防和治疗有一定意义。
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1，范进藩，江振裕译.电生理学方法.第一版，上海：科学技术出版社，1963：348
2，Peuerstein G,Gu JL,Ohlstein EH, et al.Peptidic endothelin-1 receptor antagonist BQ123,and neuroprotection. Peptides,1994,15(3):467
3，蔡文琴，王柏主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.第一版，四川：科学技术出版社，1994：415
4，Fuxe K,Kurosawa N,Cintra A,et al.Involvement of local ischemia in endothelin-1 induced lesions of the neostriatum of the anaesthetized rat.Exp Brain Res,1992,88:131
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5，Inara M,Noguchi K,Saeki T,et al.Biological profiles of highly potent novel endothelin antagonists selective for the ETA receptor.Life Sci,1991,50:247
6，Adner M,You J,Edvinsson L,et al.Characterization of endothelin-A receptors in the cerebral circulation.NeuroReport,1993,4:441
7，Vigne P, Marsault R, Breittmayer PJ, et al.Endothelin stimulates phosphatidy linositol hydrolysis and DNA synthesisin brain caillary endothelial cells.Biochem J,1990,266:415
8，Masaki T.Molecular and cellular mechanism of endothelin fegulation:implications for vascular function.Circulation,1991,84:1457, http://www.100md.com