抗白念珠菌胞壁外膜单克隆抗体的制备
作者：王鲁 张雪 刘荣卿
单位：第三军医大学西南医院皮肤科 重庆 400038
关键词：白念珠菌；单克隆抗体
重庆医学000504 摘 要 目的 为进一步研究白念珠菌保护性抗体免疫以及系统性念珠菌病早期诊断奠定基础。方法 运用细胞融合、间接ELISA、IIF等技术，制备抗白念珠菌胞壁外膜单克隆抗体。结果 建立了三株分泌抗白念珠菌胞壁外膜成分单克隆抗体杂交瘤细胞株-IB5、3E8、4C7；单抗亚类分析显示1B5为IgM，3E8、4C7为IgG1；这三株单抗不仅能使白念珠菌孢子表面染上荧光，也能使芽管表面带上荧光。结论 制备成功三株抗白念珠菌胞壁外膜成分单克隆抗体。
Preparation of Monoclonal Antibody Against Outer Membrane of Cell Wall of Candida Albicans
, http://www.100md.com
Wang Lu, Zhang Xie, Liu Rongqing
(Department of Dermatology,South-west Hospital.The Third Military Medical University,/Chongqing 400038)
Abstract Objective:To provide a basis for further studying the protective immunity to Candida albicans with antibody and early diagnosis of Candida albicans Methods:Monoclonal antibody (Mab) against outer membrane of cell-wall of Candida albicans was prepared by cell fusion, indirect Elisa and IIF technic. Results:Three strains of hybridoma, IB5,3E8 and 4C7 were established.Analyzing Mab immunoglobulin isotype subclass,we found that 1B5 belonged to IgM,3E8 and 4C7 belonged to IgG.By indirect immunofluorescence assay,all of the three MAbs could stain not only the surface of yeast cell wall but also the surface of germ tuber of Candida albcians.Conclusion:Three monoclonal antibodies against outer membrane of cell wall of Candida albicans were successfully prepared.
, 百拇医药
Key words:Candida albcians Monoclonal antibody
近四十年来，白念珠菌已从一种少见的条件致病菌转变为医源感染中最常见的病原菌之一[1、2]。由该菌所致的系统性感染，死亡率高达38%～59%，严重威胁病人的生命安全[3]，原因一为对该病的诊断困难，二为治疗困难。
在系统性念珠菌病患者中，血培养往往是阴性；检测白念珠菌抗体或代谢产物有一定敏感性，但特异性差；寻求一种抗白念珠菌特异性抗体以检测相应抗原，也许是系统性念珠菌病早期诊断的研究方向。针对白念珠菌所致感染，近来许多实验室及临床研究结果提示了体液免疫在抗系统性念珠菌病中起着重要的作用，这些为抗白念珠菌保护性抗体免疫及其保护性抗体参与系统性白念珠菌感染治疗的研究提供一定理论依据[4]。
本文运用杂交瘤技术，制备出抗白念珠菌胞壁外膜成分单克隆抗体，为进一步抗白念菌保护性抗体的筛选、鉴定、保护机制的探讨以及系统性念珠菌病早期诊断研究打下基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 菌种为我科真菌室保存菌株-白念珠菌19(白19)，重新培养、鉴定[5]。
1.2 静止时相白念珠菌孢子及菌丝相(带芽管的孢子)培养[6]。
1.3 单克隆抗体的制备
1.3.1 动物免疫 参考Sundstrom方法[7]。免疫动物选用6～8周龄BALB/C小鼠，免疫方案包括5次腹腔内菌液注射，每周一次，融合前3天腹腔内加强免疫一次。
1.3.2 细胞融合、克隆筛选、克隆化培养参考徐志凯方法[8]。
1.3.3 抗体检测方法 采用间接ELISA法。(1)步骤：一定浓度活的静止相白19孢子悬液加入酶联板中(0.1ml/孔)，37℃干燥；甲醇固定10分钟，拍干后用洗涤缓冲液洗1次；再加入封闭液(0.1ml/孔)4℃过夜。以下按常规ELISA法操作步骤进行。阳性对照为免疫小鼠血清，阴性对照为1640培养液。显色后于酶联仪上测定光密度OD值。(2)方阵滴定：用包被缓冲液配制四种不同浓度的白19孢子悬液：4×107/ml、2×107/ml、1×107/ml、5×106/ml；阴性血清来自正常BALB/C小鼠血清，阳性血清为免疫后小鼠血清；阳性和阴性血清分别倍比稀释成1：200、1：400、1：800、1：1600。实验操作步骤同上。
, 百拇医药
1.3.4 单克隆抗体的生产及效价测定 间接ELISA检测单抗效价。
1.4 间接免疫荧光染色 静止时相白19孢子和带芽管的孢子分别做抗原，已制备的抗白19孢壁外膜单克隆抗体做为Ⅰ抗，Ⅱ抗为羊抗兔荧光抗体。按常规间接免疫荧光染色步骤进行荧光染色，于荧光显微镜下观察。
1.5 核型分析及单抗亚类鉴定。
2 结 果
2.1 冷藏的白19于沙氏固体培养基上长出乳白色菌落，似奶酪样，在沙氏液体培养基中为管底生长，于米粉吐温琼脂培养基中形成厚壁孢子。血清芽管试验(+)，糖发酵试验对葡萄糖和麦芽糖产酸产气，对蔗糖产酸，对乳糖无作用。同化试验对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和半乳糖呈现阳性反应。静注白19菌悬液5天后兔子死亡，其肾脏肿胀，表面有播散粟粒大小脓肿形成，因此我们确定该菌为白念珠菌。
, http://www.100md.com
2.2 抗白念珠菌胞壁外膜单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 2次成功融合，8块板获得483个克隆生长孔。检测出阳性孔3个，连续克隆化培养3次，3株杂交瘤细胞仍持续分泌抗体。经反复冻存复苏后，仍保持分泌抗体的能力。我们将这3株杂交瘤细胞分别命名为IB5、3E8、4C7。
2.3 单抗效价测定 间接ELISA法测定抗体效价，已知抗原仍用活的白19孢子悬液，1B5效价为1：3200，3EB和4C7分别为1：6400和1：800。
2.4 单抗的鉴定
2.4.1 核型分析 杂交瘤细胞株1B5染色体数目为96条，3E8为83条，4C7为91条。
2.4.2 亚类分析 琼脂扩散试验结果显示1B5单抗为IgM，3E8和4C7为IgG1。
2.4.3 IIF 3株杂交瘤细胞的腹水单抗IB5、3E8和4C7皆能使白念珠菌孢子和芽管表面产生很强荧光。
, http://www.100md.com
3 讨 论
3.1 免疫原的选择问题 目前，白念珠菌已成为医源感染中最重要的致病性真菌，其致病性大致可以归纳为以下几点[4、9]：(1)对宿主细胞、基质的粘附作用；(2)产生和分泌释放各种蛋白水解酶；(3)相变及其表型、基因型的转换；(4)以及其表面具有的疏水性特征等。其中白念珠菌对宿主组织的粘附，被认为是该菌致病的起始环节，具有非常重要的意义。这种粘附的发生，是白念珠菌胞壁外层特殊成分与其“靶子”表面的特殊结构相互作用的结果。白念珠菌胞壁通常分为三层[10]，其中胞壁外层则由甘露聚糖和蛋白质组成，其功能主要是介导粘附和提供表面抗原。因此，尽管国外学者多以提取白念珠菌胞壁特定成分制备出相应单克隆抗体，本文则直接用活的白念珠菌孢子作为免疫原，以制备抗白念珠菌胞壁外层(外膜)成分的单克隆抗体。这样，既可以有目的地为本文以下研究打下基础，又可以避免因提取特定胞壁成份所需的特殊仪器、试剂和方法，减少实验步骤以及胞壁成分在提取过程中某些特性发生改变或者丧失的可能性。就免疫原性而言，活的白念珠菌孢子作为颗粒性抗原，要比可溶性胞壁抗原好。不足之处是为单抗的检测、筛选带来工作量大，融合后阳性检测率低等一定困难。
, 百拇医药
3.2 ELISA检测系统 本文采用间接ELISA检测系统，检测、筛选阳性单抗克隆孔，遇到以下困难：(1)用以检测单抗的已知抗原为活的白念珠菌孢子，属颗粒性抗原，按一般方法将其包备于酶联板后易被洗脱，从而影响检测系统的敏感性；(2)不知该检测系统的最适检测单抗用已知抗原浓度和最适检测用阳性抗体的工作效价；(3)该检测系统的检测可靠性如何。我们通过将已加入菌悬液的酶联板37℃干燥过夜，再于酶联孔中加入甲醇100μl/孔室温放置10分钟，以后步骤按常规间接ELISA法进行实验，这样就基本上解决了酶联孔中已包备白念珠菌易被洗脱的问题。再者，我们对本研究采用的间接ELISA法检测系统，先进行方阵滴定(见表1)，求得该检测系统的最适检测用已知抗原浓度(白19孢子悬液浓度为1×107/ml)和最适检测用阳性抗体工作效价(1：800)；同时在实验中，检测板中各孔的OD值随抗体、抗原稀释度的增高而呈阶梯形降低，无“花板”出现，因此，我们能确定该检测系统检测效果好，可信度高。
表1 方阵滴定 AbCDAg
, http://www.100md.com
包补缓冲液
阳性Ab
阴性Ab
抗体稀释液
1：200
1：400
1：800
1：1600
1：200
1：400
1：800
1：1600
A
, 百拇医药
4×107/ml
1.49
1.46
1.36
1.18
0.97
0.67
0.53
0.47
0.33
B
2×107/ml
, http://www.100md.com
1.45
1.38
1.12
0.96
0.63
0.49
0.35
0.24
0.07
C
1×107/ml
1.26
1.24
, 百拇医药
1.01
0.65
0.83
0.56
0.22
0.14
0.07
D
5×106/ml
1.15
0.96
0.61
0.37
, 百拇医药
0.74
0.40
0.21
0.14
0.07
E
包被缓冲液
0
0
0
0
0
0
, 百拇医药 0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
注：(1)第1列和第E行为包被缓冲液替代白19菌液包被酶联孔
, 百拇医药
(2)第1列和第10列皆用抗体稀释液作为Ⅰ抗
(3)第1列为空白对照
3.3 抗白念珠菌胞壁外膜成分单克隆抗体的制备 我们用活的白念珠孢子作为抗原，免疫BALB/C小鼠，应用细胞融合技术，建立了3株分泌抗白念珠菌胞壁外膜成分的单克隆抗体杂交瘤细胞株-4C7、3E8、1B5。用白念珠菌孢子作已知抗原，通过间接ELISA法测定三株腹水单抗的效价，1B5为1：3200，3E8为1：6400，4C7为1：800。而用白念珠菌DTT胞壁提取物[6](一种白念珠菌胞壁外膜可溶性抗原)替代白念珠菌孢子包备酶联板，这三株杂交瘤腹水单抗的效价均超过1：25600(结果中未写出)，从而一方面说明DTT胞壁提取物中含有与这三株单抗发生反应的相应抗原成分，为下一步保护性单抗的进一步鉴定打基础，另一方面显示该检测系统改用已知可溶性抗原，检测抗体的敏感性要比用颗粒性抗原好得多，原因是颗粒性抗原在实验中仍不可避免的出现抗原的脱落丢失，导致抗体检测的敏感性降低。单抗亚类分析显示1B5为IgM、3E8和4C7为IgG1。
, 百拇医药
3.4 IIF 作为抗白念珠菌胞壁外膜成分的单克隆抗体，通过间接免疫荧光技术，能使白念珠菌胞壁表面染上荧光。本文用这3株腹水单抗，分别对白念珠菌19孢子及菌丝(带芽管的孢子)进行间接免疫荧光染色，皆使孢子和芽管表面产生很强的荧光。这也进一步证实了三株单抗是抗白念珠菌胞壁外膜成分的单克隆抗体。
3.5 融合用SP2/0细胞直接影响融合的成功 支原体污染常常是导致SP2/0细胞融合失败的主要原因之一。我们曾将SP2/0细胞在BALB/C小鼠体内连续传代，通过生物体的过滤作用，清除SP2/0细胞中可能存在的支原体污染，提高融合用SP2/0细胞活性，台盼兰拒染活细胞由过滤前的80%上升到90%以上，但仍然连续出现融合失败。在排除血清、水、培养器皿等可能存在问题以外，我们怀疑SP2/0细胞发生变异。在改用本校免疫教研室近期融合成功用的SP2/0细胞后，首次细胞融合就获得成功，以后连续数次细胞融合皆成功。因此，我们认为可能存在的SP2/0细胞变异同样是直接影响细胞融合成功的因素之一。
, 百拇医药
参考文献
1，Jarvis WR.Epidemiolgy of nosocomial fungal infection,with emphasis on candida species.Clin Infect Dis,1995,20:1526
2，Voss A,Le-Noble J,Verdugn F,et al.Candidemiain in intensive care unit patients:risk factor for moratality.Infection,1997,25:8
3，Wey SB.Hospital-acquired candidemia:the attributable mortality and excess longth of stay.Arcb Intem Med,1988,148:2642
, 百拇医药
4，Matthews RC.Pathogenicity determinants of Candida albcans:potential angets for immunotherapy.Microbiology,1994,140:1505
5，廖万清.真菌病学.第一版，北京：人民卫生出版社，1989：74
6，王鲁，叶庆佾.白念珠菌芽管特异性抗原初步研究.中华皮肤科杂志，1994，27：136
7，Sundstrom PM,Tam M,Nichols E,et al.Antigenic differences in the surface mannoproteins of Candida albicans as revealed by monoclonal antibodies.Infect Immun,1988,56:601
8，徐志凯.实用单克隆抗体技术.第一版，陕西：科学技术出版社，1992：1
9，Hobden C.Hydrophobioproperties of the cell surface of Candidaalbicans:a roleon aggregation. Microbiotogy,1995,141:1875
10，Poulain D.Antigen variability of Candida albicans.Crit Rev Microbiol,1985,12:223, 百拇医药
单位：第三军医大学西南医院皮肤科 重庆 400038
关键词：白念珠菌；单克隆抗体
重庆医学000504 摘 要 目的 为进一步研究白念珠菌保护性抗体免疫以及系统性念珠菌病早期诊断奠定基础。方法 运用细胞融合、间接ELISA、IIF等技术，制备抗白念珠菌胞壁外膜单克隆抗体。结果 建立了三株分泌抗白念珠菌胞壁外膜成分单克隆抗体杂交瘤细胞株-IB5、3E8、4C7；单抗亚类分析显示1B5为IgM，3E8、4C7为IgG1；这三株单抗不仅能使白念珠菌孢子表面染上荧光，也能使芽管表面带上荧光。结论 制备成功三株抗白念珠菌胞壁外膜成分单克隆抗体。
Preparation of Monoclonal Antibody Against Outer Membrane of Cell Wall of Candida Albicans
, http://www.100md.com
Wang Lu, Zhang Xie, Liu Rongqing
(Department of Dermatology,South-west Hospital.The Third Military Medical University,/Chongqing 400038)
Abstract Objective:To provide a basis for further studying the protective immunity to Candida albicans with antibody and early diagnosis of Candida albicans Methods:Monoclonal antibody (Mab) against outer membrane of cell-wall of Candida albicans was prepared by cell fusion, indirect Elisa and IIF technic. Results:Three strains of hybridoma, IB5,3E8 and 4C7 were established.Analyzing Mab immunoglobulin isotype subclass,we found that 1B5 belonged to IgM,3E8 and 4C7 belonged to IgG.By indirect immunofluorescence assay,all of the three MAbs could stain not only the surface of yeast cell wall but also the surface of germ tuber of Candida albcians.Conclusion:Three monoclonal antibodies against outer membrane of cell wall of Candida albicans were successfully prepared.
, 百拇医药
Key words:Candida albcians Monoclonal antibody
近四十年来，白念珠菌已从一种少见的条件致病菌转变为医源感染中最常见的病原菌之一[1、2]。由该菌所致的系统性感染，死亡率高达38%～59%，严重威胁病人的生命安全[3]，原因一为对该病的诊断困难，二为治疗困难。
在系统性念珠菌病患者中，血培养往往是阴性；检测白念珠菌抗体或代谢产物有一定敏感性，但特异性差；寻求一种抗白念珠菌特异性抗体以检测相应抗原，也许是系统性念珠菌病早期诊断的研究方向。针对白念珠菌所致感染，近来许多实验室及临床研究结果提示了体液免疫在抗系统性念珠菌病中起着重要的作用，这些为抗白念珠菌保护性抗体免疫及其保护性抗体参与系统性白念珠菌感染治疗的研究提供一定理论依据[4]。
本文运用杂交瘤技术，制备出抗白念珠菌胞壁外膜成分单克隆抗体，为进一步抗白念菌保护性抗体的筛选、鉴定、保护机制的探讨以及系统性念珠菌病早期诊断研究打下基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 菌种为我科真菌室保存菌株-白念珠菌19(白19)，重新培养、鉴定[5]。
1.2 静止时相白念珠菌孢子及菌丝相(带芽管的孢子)培养[6]。
1.3 单克隆抗体的制备
1.3.1 动物免疫 参考Sundstrom方法[7]。免疫动物选用6～8周龄BALB/C小鼠，免疫方案包括5次腹腔内菌液注射，每周一次，融合前3天腹腔内加强免疫一次。
1.3.2 细胞融合、克隆筛选、克隆化培养参考徐志凯方法[8]。
1.3.3 抗体检测方法 采用间接ELISA法。(1)步骤：一定浓度活的静止相白19孢子悬液加入酶联板中(0.1ml/孔)，37℃干燥；甲醇固定10分钟，拍干后用洗涤缓冲液洗1次；再加入封闭液(0.1ml/孔)4℃过夜。以下按常规ELISA法操作步骤进行。阳性对照为免疫小鼠血清，阴性对照为1640培养液。显色后于酶联仪上测定光密度OD值。(2)方阵滴定：用包被缓冲液配制四种不同浓度的白19孢子悬液：4×107/ml、2×107/ml、1×107/ml、5×106/ml；阴性血清来自正常BALB/C小鼠血清，阳性血清为免疫后小鼠血清；阳性和阴性血清分别倍比稀释成1：200、1：400、1：800、1：1600。实验操作步骤同上。
, 百拇医药
1.3.4 单克隆抗体的生产及效价测定 间接ELISA检测单抗效价。
1.4 间接免疫荧光染色 静止时相白19孢子和带芽管的孢子分别做抗原，已制备的抗白19孢壁外膜单克隆抗体做为Ⅰ抗，Ⅱ抗为羊抗兔荧光抗体。按常规间接免疫荧光染色步骤进行荧光染色，于荧光显微镜下观察。
1.5 核型分析及单抗亚类鉴定。
2 结 果
2.1 冷藏的白19于沙氏固体培养基上长出乳白色菌落，似奶酪样，在沙氏液体培养基中为管底生长，于米粉吐温琼脂培养基中形成厚壁孢子。血清芽管试验(+)，糖发酵试验对葡萄糖和麦芽糖产酸产气，对蔗糖产酸，对乳糖无作用。同化试验对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和半乳糖呈现阳性反应。静注白19菌悬液5天后兔子死亡，其肾脏肿胀，表面有播散粟粒大小脓肿形成，因此我们确定该菌为白念珠菌。
, http://www.100md.com
2.2 抗白念珠菌胞壁外膜单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 2次成功融合，8块板获得483个克隆生长孔。检测出阳性孔3个，连续克隆化培养3次，3株杂交瘤细胞仍持续分泌抗体。经反复冻存复苏后，仍保持分泌抗体的能力。我们将这3株杂交瘤细胞分别命名为IB5、3E8、4C7。
2.3 单抗效价测定 间接ELISA法测定抗体效价，已知抗原仍用活的白19孢子悬液，1B5效价为1：3200，3EB和4C7分别为1：6400和1：800。
2.4 单抗的鉴定
2.4.1 核型分析 杂交瘤细胞株1B5染色体数目为96条，3E8为83条，4C7为91条。
2.4.2 亚类分析 琼脂扩散试验结果显示1B5单抗为IgM，3E8和4C7为IgG1。
2.4.3 IIF 3株杂交瘤细胞的腹水单抗IB5、3E8和4C7皆能使白念珠菌孢子和芽管表面产生很强荧光。
, http://www.100md.com
3 讨 论
3.1 免疫原的选择问题 目前，白念珠菌已成为医源感染中最重要的致病性真菌，其致病性大致可以归纳为以下几点[4、9]：(1)对宿主细胞、基质的粘附作用；(2)产生和分泌释放各种蛋白水解酶；(3)相变及其表型、基因型的转换；(4)以及其表面具有的疏水性特征等。其中白念珠菌对宿主组织的粘附，被认为是该菌致病的起始环节，具有非常重要的意义。这种粘附的发生，是白念珠菌胞壁外层特殊成分与其“靶子”表面的特殊结构相互作用的结果。白念珠菌胞壁通常分为三层[10]，其中胞壁外层则由甘露聚糖和蛋白质组成，其功能主要是介导粘附和提供表面抗原。因此，尽管国外学者多以提取白念珠菌胞壁特定成分制备出相应单克隆抗体，本文则直接用活的白念珠菌孢子作为免疫原，以制备抗白念珠菌胞壁外层(外膜)成分的单克隆抗体。这样，既可以有目的地为本文以下研究打下基础，又可以避免因提取特定胞壁成份所需的特殊仪器、试剂和方法，减少实验步骤以及胞壁成分在提取过程中某些特性发生改变或者丧失的可能性。就免疫原性而言，活的白念珠菌孢子作为颗粒性抗原，要比可溶性胞壁抗原好。不足之处是为单抗的检测、筛选带来工作量大，融合后阳性检测率低等一定困难。
, 百拇医药
3.2 ELISA检测系统 本文采用间接ELISA检测系统，检测、筛选阳性单抗克隆孔，遇到以下困难：(1)用以检测单抗的已知抗原为活的白念珠菌孢子，属颗粒性抗原，按一般方法将其包备于酶联板后易被洗脱，从而影响检测系统的敏感性；(2)不知该检测系统的最适检测单抗用已知抗原浓度和最适检测用阳性抗体的工作效价；(3)该检测系统的检测可靠性如何。我们通过将已加入菌悬液的酶联板37℃干燥过夜，再于酶联孔中加入甲醇100μl/孔室温放置10分钟，以后步骤按常规间接ELISA法进行实验，这样就基本上解决了酶联孔中已包备白念珠菌易被洗脱的问题。再者，我们对本研究采用的间接ELISA法检测系统，先进行方阵滴定(见表1)，求得该检测系统的最适检测用已知抗原浓度(白19孢子悬液浓度为1×107/ml)和最适检测用阳性抗体工作效价(1：800)；同时在实验中，检测板中各孔的OD值随抗体、抗原稀释度的增高而呈阶梯形降低，无“花板”出现，因此，我们能确定该检测系统检测效果好，可信度高。
表1 方阵滴定 AbCDAg
, http://www.100md.com
包补缓冲液
阳性Ab
阴性Ab
抗体稀释液
1：200
1：400
1：800
1：1600
1：200
1：400
1：800
1：1600
A
, 百拇医药
4×107/ml
1.49
1.46
1.36
1.18
0.97
0.67
0.53
0.47
0.33
B
2×107/ml
, http://www.100md.com
1.45
1.38
1.12
0.96
0.63
0.49
0.35
0.24
0.07
C
1×107/ml
1.26
1.24
, 百拇医药
1.01
0.65
0.83
0.56
0.22
0.14
0.07
D
5×106/ml
1.15
0.96
0.61
0.37
, 百拇医药
0.74
0.40
0.21
0.14
0.07
E
包被缓冲液
0
0
0
0
0
0
, 百拇医药 0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
注：(1)第1列和第E行为包被缓冲液替代白19菌液包被酶联孔
, 百拇医药
(2)第1列和第10列皆用抗体稀释液作为Ⅰ抗
(3)第1列为空白对照
3.3 抗白念珠菌胞壁外膜成分单克隆抗体的制备 我们用活的白念珠孢子作为抗原，免疫BALB/C小鼠，应用细胞融合技术，建立了3株分泌抗白念珠菌胞壁外膜成分的单克隆抗体杂交瘤细胞株-4C7、3E8、1B5。用白念珠菌孢子作已知抗原，通过间接ELISA法测定三株腹水单抗的效价，1B5为1：3200，3E8为1：6400，4C7为1：800。而用白念珠菌DTT胞壁提取物[6](一种白念珠菌胞壁外膜可溶性抗原)替代白念珠菌孢子包备酶联板，这三株杂交瘤腹水单抗的效价均超过1：25600(结果中未写出)，从而一方面说明DTT胞壁提取物中含有与这三株单抗发生反应的相应抗原成分，为下一步保护性单抗的进一步鉴定打基础，另一方面显示该检测系统改用已知可溶性抗原，检测抗体的敏感性要比用颗粒性抗原好得多，原因是颗粒性抗原在实验中仍不可避免的出现抗原的脱落丢失，导致抗体检测的敏感性降低。单抗亚类分析显示1B5为IgM、3E8和4C7为IgG1。
, 百拇医药
3.4 IIF 作为抗白念珠菌胞壁外膜成分的单克隆抗体，通过间接免疫荧光技术，能使白念珠菌胞壁表面染上荧光。本文用这3株腹水单抗，分别对白念珠菌19孢子及菌丝(带芽管的孢子)进行间接免疫荧光染色，皆使孢子和芽管表面产生很强的荧光。这也进一步证实了三株单抗是抗白念珠菌胞壁外膜成分的单克隆抗体。
3.5 融合用SP2/0细胞直接影响融合的成功 支原体污染常常是导致SP2/0细胞融合失败的主要原因之一。我们曾将SP2/0细胞在BALB/C小鼠体内连续传代，通过生物体的过滤作用，清除SP2/0细胞中可能存在的支原体污染，提高融合用SP2/0细胞活性，台盼兰拒染活细胞由过滤前的80%上升到90%以上，但仍然连续出现融合失败。在排除血清、水、培养器皿等可能存在问题以外，我们怀疑SP2/0细胞发生变异。在改用本校免疫教研室近期融合成功用的SP2/0细胞后，首次细胞融合就获得成功，以后连续数次细胞融合皆成功。因此，我们认为可能存在的SP2/0细胞变异同样是直接影响细胞融合成功的因素之一。
, 百拇医药
参考文献
1，Jarvis WR.Epidemiolgy of nosocomial fungal infection,with emphasis on candida species.Clin Infect Dis,1995,20:1526
2，Voss A,Le-Noble J,Verdugn F,et al.Candidemiain in intensive care unit patients:risk factor for moratality.Infection,1997,25:8
3，Wey SB.Hospital-acquired candidemia:the attributable mortality and excess longth of stay.Arcb Intem Med,1988,148:2642
, 百拇医药
4，Matthews RC.Pathogenicity determinants of Candida albcans:potential angets for immunotherapy.Microbiology,1994,140:1505
5，廖万清.真菌病学.第一版，北京：人民卫生出版社，1989：74
6，王鲁，叶庆佾.白念珠菌芽管特异性抗原初步研究.中华皮肤科杂志，1994，27：136
7，Sundstrom PM,Tam M,Nichols E,et al.Antigenic differences in the surface mannoproteins of Candida albicans as revealed by monoclonal antibodies.Infect Immun,1988,56:601
8，徐志凯.实用单克隆抗体技术.第一版，陕西：科学技术出版社，1992：1
9，Hobden C.Hydrophobioproperties of the cell surface of Candidaalbicans:a roleon aggregation. Microbiotogy,1995,141:1875
10，Poulain D.Antigen variability of Candida albicans.Crit Rev Microbiol,1985,12:223, 百拇医药