R-型维拉帕米逆转肿瘤细胞多药耐药的实验研究
作者：方刚 侯亚义 杨玉龙 陈龙邦 黎介寿
单位：方刚(南京大学医学院 免疫微生物学教研室，江苏南京210093)；侯亚义(南京大学医学院 免疫微生物学教研室，江苏南京210093)；杨玉龙(南京军区南京总医院药剂科)；陈龙邦(南京军区南京总医院肿瘤科)；黎介寿(南京军区南京总医院 解放军普通外科研究所)；
关键词：维拉帕米；长春新碱；阿霉素；多药耐药性
医学研究生学报000501摘要： 目的：检测R-型维拉帕米(R-Verapamil)体外逆转肿瘤细胞多药耐药的作用及动物毒性，探讨R-型维拉帕米成为未来化疗增敏剂的可能性。 方法：细胞毒性的测定用MTT法，细胞内阿霉素积蓄的测定用荧光分光光度法。动物毒性试验用BALB/c小鼠腹腔注射法。 结果：1.25 μmol/L的R-型维拉帕米即可显著增加耐药KBv 200细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性(P<0.01)，其效应与作用浓度有关。在增敏和增加细胞内阿霉素积蓄方面，R-型维拉帕米与混旋维拉帕米效果一样，但R-型维拉帕米的动物毒性低于混旋维拉帕米。 结论：1.25 μmol/L的R-型维拉帕米能部分逆转耐药KBv 200细胞的多药耐药性。此浓度能被人体所接受。R-型维拉帕米有望成为未来的化疗增敏剂。
, 百拇医药
中图分类号： R979.1 文献标识码： A 文章编号： 1008-8199(2000)05-0285-03
R-Verapamil reverses multidrug resistance of tumor cells
FANG Gang HOU Ya-yi
(Division of Immunology and Microbiology, the Medical College of Nanjing University, Nanjing 210093,Jiangsu China)
YANG Yu-long
(Department of Pharmaticeutics,Jinling Hospital,Nanjing 210002)
, 百拇医药
CHEN Long-ban
(Department of Oncology, Jinling Hospital)
LI Jie-shou
(Research Institute of General Surgery, Jinling Hospital)
Abstract: Objectives: To study the reversal of multidrug resistance (MDR) by R-verapamil (R-VPM) in vitro and the animal toxicity of R-VPM. Methods: Cytotoxicity was determined by tetrazolium(MTT) assay. Cellular accumulation of Dox was measured by fluorescence spectrophotometry. Animal toxicity was tested by i.p drug administration in BALB/c mice. Results: R-VPM 1.25 μmol/L increased the sensitivity of KBv 200 cells to VCR and Dox (P<0.01). This effect was dose-related. R-VPM reversed MDR and increased cellular Dox accumulation of KBv 200 cells as effectively as VPM, but possessed lower acute toxicity in BALB/c (P<0.05). Conclusions: R-VPM reversed the MDR to VCR and Dox at a clinically tolerable concentration, and is a good candidate as chemosensitizer in clinic.
, 百拇医药
Key words: Multidrug resistance; Verapamil; VCR; Dox
0 引 言
化疗是目前治疗肿瘤的主要方法之一，但肿瘤的耐药性阻碍了化疗药物高效率杀死肿瘤细胞。其中最主要的耐药机制为肿瘤细胞的多药耐药机制(multidrug resistance，MDR)。逆转肿瘤细胞的多药耐药性成为提高化疗疗效的一个努力方向。目前尝试逆转多药耐药的方法有使用钙离子通道阻滞剂、抗P-170单抗等。但钙通道阻滞剂由于对心脏的影响，限制了它在体内发挥增敏作用。R-型维拉帕米(R-Verapamil，R-VPM)的心脏作用仅为混旋维拉帕米(VPM)的1/10[1]，有可能成为未来的化疗增敏剂。本文从国产混旋维拉帕米中拆分出R-VPM，对其理化性质，药效学及增敏机制、动物毒性进行了初步的研究。
1 材料和方法
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1.1 材料 混旋维拉帕米盐酸盐由连云港制药厂惠赠。R-VPM系作者采用拆分方法制备[2]。长春新碱(VCR)和阿霉素(Dox)均为国产药品。KB细胞和耐药KBv 200细胞由中国医学科学院药物研究所惠赠，KBv 200细胞在含VCR 200 nmol/L的全1640培养液中生长良好[3]。BALB/c小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，由南京军区实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 毛细管电泳分析拆分产物R-VPM Bio-Rad 2000型高效毛细管电泳仪，毛细管柱50 μm×50 cm，柱温20℃，检测波长UV 200 nm，压差进样，运行电压15 kV，R-VPM、S-VPM标准品由美国Dr.Longstreth(Searle, Skokie, IL, USA)提供，作为电泳对照[4]，进样浓度分别为1.73 μg/ml，0.975 μg/ml。待测的拆分产物R-VPM的进样浓度为25 μg/ml。
, 百拇医药
1.2.2 R-VPM逆转肿瘤细胞多药耐药的实验方法 采用改良MTT法[5]。取对数生长的KB和KBv 200细胞，按每孔含3×103个细胞，接种至96孔平底细胞培养板，培养48 h，换成含不同药物(VCR或Dox和R-VPM或VPM)的全1640液继续培养3天，每孔加5 mg/ml的MTT 50 μl，37℃避光作用4 h，弃去孔内液，每孔加DMSO 150 μl，甘氨酸缓冲液25 μl(pH 10.5)，充分溶解后于DG3022A型酶联免疫检测仪570 nm处测吸收值。实验对照为不含药物的全1640液培养的相应细胞。实验孔细胞生存率按公式：(实验孔的吸收值)/(对照孔的吸收值)×100%计算。IC50是细胞生存率为50%时孔内药物浓度，即杀伤一半细胞所需药物浓度，增敏倍数=(对照组的IC50)/(R-VPM或VPM同时作用时的IC50)。统计学处理采用t检验。
1.2.3 细胞内阿霉素积蓄实验 KB细胞和KBv 200细胞分别接种于5 ml培养液中，细胞浓度为1.3×109个/L。加入Dox，终浓度为10 μmol/L，加入R-VPM或VPM，终浓度为5 μmol/L，对照组不加R-VPM和VPM。在37℃药物作用细胞3 h。离心弃上清，用冷PBS洗细胞3次。用含HCl 0.3 mol/L的60%的乙醇悬浮裂解细胞，离心，取上清，用荧光分光光度法检测Dox。激发光波长λex 470 nm，发出光波长λem 585 nm[6]。
, 百拇医药
1.2.4 动物毒性试验 BALB/c小鼠，腹腔注射R-VPM和VPM，观察7天。R-VPM注射剂量范围为102～250 mg/kg，VPM注射剂量为38.4～93.8 mg/kg。剂量间比值为0.8。采用Bliss加权回归法计算半数致死量LD50。
2 结 果
2.1 毛细管电泳 拆分产物R-VPM为白色粉剂，右侧旋光。其质谱分析，红外线吸收，元素分析，溶点测定显示拆分产物为R-VPM[2]。毛细管电泳显示出一个R-VPM峰，无S-VPM峰及其他杂质成分(图1)。拆分产物R-VPM的纯度良好。
图1 R-VPM的毛细管电泳图
Figure 1 Electropherogram of R-VPM
, 百拇医药
2.2 R-VPM逆转KBv 200细胞的多药耐药性 VCR对KBv 200细胞的IC50为1 083 nmol/L。加入浓度为1.25 μmol/L的R-VPM，使IC50降至127 nmol/L，与VCR单独作用的IC50相比，差异显著(P<0.01)，KBv 200细胞对VCR的敏感性增加8.5倍。1.25 μmol/L的R-VPM同样有效降低Dox对KBv 200细胞的IC50(P<0.01)，使KBv 200细胞对Dox的敏感性增加2.7倍。VPM与R-VPM在增敏效应上差异不显著(P>0.05)，二者均不能使KB细胞对VCR和Dox的敏感性增加(表1、表2)。
表1 R-VPM逆转KBv 200细胞对VCR的耐药性
Table 1 Reversal of MDR of KBv 200 cells to VCR Drug(μmol/L)
, 百拇医药
IC50 of VCR/nmol/L
Potentiation fold
KB
KBv 200
KB
KBv 200
Control
0
6.2±0.6
1 083±16
R-VPM
1.25
, http://www.100md.com
6.5±0.5*
127±11**
0.95
8.5
2.5
5.9±0.4*
76±8**
1.05
14.3
5
6.7±0.8*
, http://www.100md.com
42±6**
0.93
25.8
VPM
5
6.4±0.6*
41±6**
0.97
26.4
IC50：
±s,3 times independent experiments.*Differnece is not significant as compared with the control(P>0.05);**Difference is significant as compared with the control(P<0.01)表2 R-VPM逆转KBv 200细胞对Dox的耐药性
, 百拇医药
Table 2 Reversal of MDR of KBv 200 cells to Dox Drug(μmol/L)
IC50 of Dox/nmol/L
Potentiation fold
KB
KBv 200
KB
KBv 200
Control
0
6.7±0.7
61±8
, http://www.100md.com
R-VPM
1.25
7.2±0.8*
23±3**
0.9
2.7
2.5
6.1±0.8*
18±2**
1.1
3.4
5
, 百拇医药
6.6±0.5*
13±2**
1.0
4.7
VPM
5
6.7±0.9*
12±2**
1.0
5.1
IC50：±s,3 times independent experiments.*Differnece is not significant as compared with the control(P>0.05);**Difference is significant as compared with the control(P<0.01)
, 百拇医药
2.3 R-VPM增加KBv 200细胞内Dox的积蓄 10 μmol/L的Dox作用细胞后，KB细胞内Dox含量是KBv 200细胞内Dox含量的4.2倍。R-VPM和VPM同样有效地增加KBv 200细胞内Dox的含量(P<0.01)，但对KB细胞无作用(表3)。表3 R-VPM对细胞内Dox积蓄的影响
Table 3 Effect of R-VPM on Dox accumulation Drug(μmol/L)
Dox(nmol/106cells)
Accumulation fold
KB
KBv 200
KB
, 百拇医药
KBv 200
Control
0
5.13±0.19
1.22±0.07
1.0
1.0
R-VPM
5
5.15±0.26*
2.79±0.12**
1.0
, 百拇医药
2.3
VPM
5
5.16±0.24*
2.83±0.18**
1.0
2.3
Dox accumulation:±s，3 times experiments.*Differnece is not significant as compared with the control(P>0.05)；**Differnece is significant as compared with the control(P<0.01)。
, 百拇医药
2.4 R-VPM的动物毒性 R-VPM对BALB/c小鼠的急性毒性作用低于VPM(P<0.05)(表4)。
表4 R-VPM和VPM对BALB/c小鼠的急性毒性作用
Table 4 Acute toxicity of R-VPM and VPM in BALB/c mice Drug
LD50(mg/kg)
R-VPM
166 (145～191)*
VPM
60(52～69)*
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* 95% confidence limit is shown in the parenthesis.
3 讨 论
肿瘤细胞的MDR是由于肿瘤细胞膜上P170蛋白过度表达的结果。P170蛋白具有药泵功能，能将细胞内的抗癌药泵出细胞外，降低细胞内药物含量，使肿瘤细胞对生物碱类和蒽环类抗癌药变得不敏感。VPM能与P170蛋白相互作用，减少这两类抗癌药的“泵出”，提高抗癌药的杀伤力。但由于VPM对心脏的作用，限制了它在体内达到化疗增敏所需的药物浓度。R-VPM的心脏作用仅为VPM的1/10[1]，有可能以体内所能承受的药物浓度及药物作用时间实现R-VPM的化疗增敏作用。
我们用化学拆分的方法，在国内首先制备了R-VPM。毛细管电泳显示拆分产物R-VPM中不含S-VPM及其他杂质。R-VPM的急性动物毒性低于VPM。国外使用R-VPM的化疗增敏实验，作用时间为7天[7]。考虑到以后的临床应用，我们将药物作用时间缩短至3天。实验结果表明，R-VPM的增敏效应与其浓度成正相关。1.25 μmol/L的R-VPM可使耐药的KBv 200细胞对VCR的敏感性增加8.5倍，对Dox的敏感性增加2.7倍，具有明显增敏作用。而R-VPM在体内可以安全达到2～3 μmol/L的浓度[7，8]，因此R-VPM在实现临床化疗增敏作用方面具有可行性，R-VPM有望成为未来的化疗增敏剂。
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R-VPM的增敏机制同样是与P170蛋白相互作用，使细胞内Dox等化疗药物积蓄增加，提高了杀癌细胞效应。因亲代敏感KB细胞不存在“过度”的药泵作用，因此，R-VPM和VPM对KB细胞无化疗增敏作用。已有资料表明，化疗增敏剂与化疗药合用并不增加化疗药对白细胞的毒性作用。
(致谢!感谢南京军区南京总医院药理科芮建中博士帮助完成用毛细管电泳检测拆分产物R-VPM。)
方刚(1960-),男,江苏南通人,讲师,医学硕士,从事肿瘤免疫生物学专业.
参考文献：
[1] Keilhauer G, Emiling F, Raschack M，et al. The use of R-VPM is superior to rasmic VPM in breaking multidrug resistance of malignant cells [J]. Proc Am Assoc Cancer Res, 1989, 30:503.
, 百拇医药
[2] 杨玉龙，方 刚，宋炳生.R-(+)-盐酸维拉帕米的制备[J].中国医药工业杂志，1997, 28:537.
[3] 张晓红，张福荣，籍秀娟，等.KB细胞耐药株的建立及其耐药机制的探讨[J].药学学报，1994, 29: 246.
[4] 芮建中，袁倚盛，凌树森，等.毛细管区带电泳同时分离维拉帕米和去甲维拉帕米对映体[J].中国药学杂志，1998, 33: 553.
[5] Jane AP, Wishart GC, Setanoians A,et al. Identification of a multidrug resistance modulator with clinical potential by analysis of synergistic activity in vitro, toxicity in vivo and growth delay in a solid human tumour xenograft [J]. Biochemical Pharmacology, 1994, 47: 257.
, http://www.100md.com
[6] Ford JM, Bruggemann EP, Pastan I ,et al. Cellular and biochemical characterization of thioxanthenes for reversal of multidrug resistance in human and murine cell lines[J]. Cancer Res, 1990, 50: 1748.
[7] Daniela D, Mariagrazia M, Angla M ,et al. D-Verapamil downmodulaes P170-associated resistance to doxorubicin, daunorubicin and idarubicin[J]. Anticancer Drugs, 1993, 4: 173.
[8] Bissett D, Kerr DJ, Cassidy J ,et al. Phase I and Pharmacokinetic study of D-VPM and doxorubicin [J]. Br J Cancer, 1991, 64: 1168.
收稿日期：2000-04-22
修稿日期：2000-06-05, 百拇医药
单位：方刚(南京大学医学院 免疫微生物学教研室，江苏南京210093)；侯亚义(南京大学医学院 免疫微生物学教研室，江苏南京210093)；杨玉龙(南京军区南京总医院药剂科)；陈龙邦(南京军区南京总医院肿瘤科)；黎介寿(南京军区南京总医院 解放军普通外科研究所)；
关键词：维拉帕米；长春新碱；阿霉素；多药耐药性
医学研究生学报000501摘要： 目的：检测R-型维拉帕米(R-Verapamil)体外逆转肿瘤细胞多药耐药的作用及动物毒性，探讨R-型维拉帕米成为未来化疗增敏剂的可能性。 方法：细胞毒性的测定用MTT法，细胞内阿霉素积蓄的测定用荧光分光光度法。动物毒性试验用BALB/c小鼠腹腔注射法。 结果：1.25 μmol/L的R-型维拉帕米即可显著增加耐药KBv 200细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性(P<0.01)，其效应与作用浓度有关。在增敏和增加细胞内阿霉素积蓄方面，R-型维拉帕米与混旋维拉帕米效果一样，但R-型维拉帕米的动物毒性低于混旋维拉帕米。 结论：1.25 μmol/L的R-型维拉帕米能部分逆转耐药KBv 200细胞的多药耐药性。此浓度能被人体所接受。R-型维拉帕米有望成为未来的化疗增敏剂。
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中图分类号： R979.1 文献标识码： A 文章编号： 1008-8199(2000)05-0285-03
R-Verapamil reverses multidrug resistance of tumor cells
FANG Gang HOU Ya-yi
(Division of Immunology and Microbiology, the Medical College of Nanjing University, Nanjing 210093,Jiangsu China)
YANG Yu-long
(Department of Pharmaticeutics,Jinling Hospital,Nanjing 210002)
, 百拇医药
CHEN Long-ban
(Department of Oncology, Jinling Hospital)
LI Jie-shou
(Research Institute of General Surgery, Jinling Hospital)
Abstract: Objectives: To study the reversal of multidrug resistance (MDR) by R-verapamil (R-VPM) in vitro and the animal toxicity of R-VPM. Methods: Cytotoxicity was determined by tetrazolium(MTT) assay. Cellular accumulation of Dox was measured by fluorescence spectrophotometry. Animal toxicity was tested by i.p drug administration in BALB/c mice. Results: R-VPM 1.25 μmol/L increased the sensitivity of KBv 200 cells to VCR and Dox (P<0.01). This effect was dose-related. R-VPM reversed MDR and increased cellular Dox accumulation of KBv 200 cells as effectively as VPM, but possessed lower acute toxicity in BALB/c (P<0.05). Conclusions: R-VPM reversed the MDR to VCR and Dox at a clinically tolerable concentration, and is a good candidate as chemosensitizer in clinic.
, 百拇医药
Key words: Multidrug resistance; Verapamil; VCR; Dox
0 引 言
化疗是目前治疗肿瘤的主要方法之一，但肿瘤的耐药性阻碍了化疗药物高效率杀死肿瘤细胞。其中最主要的耐药机制为肿瘤细胞的多药耐药机制(multidrug resistance，MDR)。逆转肿瘤细胞的多药耐药性成为提高化疗疗效的一个努力方向。目前尝试逆转多药耐药的方法有使用钙离子通道阻滞剂、抗P-170单抗等。但钙通道阻滞剂由于对心脏的影响，限制了它在体内发挥增敏作用。R-型维拉帕米(R-Verapamil，R-VPM)的心脏作用仅为混旋维拉帕米(VPM)的1/10[1]，有可能成为未来的化疗增敏剂。本文从国产混旋维拉帕米中拆分出R-VPM，对其理化性质，药效学及增敏机制、动物毒性进行了初步的研究。
1 材料和方法
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1.1 材料 混旋维拉帕米盐酸盐由连云港制药厂惠赠。R-VPM系作者采用拆分方法制备[2]。长春新碱(VCR)和阿霉素(Dox)均为国产药品。KB细胞和耐药KBv 200细胞由中国医学科学院药物研究所惠赠，KBv 200细胞在含VCR 200 nmol/L的全1640培养液中生长良好[3]。BALB/c小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，由南京军区实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 毛细管电泳分析拆分产物R-VPM Bio-Rad 2000型高效毛细管电泳仪，毛细管柱50 μm×50 cm，柱温20℃，检测波长UV 200 nm，压差进样，运行电压15 kV，R-VPM、S-VPM标准品由美国Dr.Longstreth(Searle, Skokie, IL, USA)提供，作为电泳对照[4]，进样浓度分别为1.73 μg/ml，0.975 μg/ml。待测的拆分产物R-VPM的进样浓度为25 μg/ml。
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1.2.2 R-VPM逆转肿瘤细胞多药耐药的实验方法 采用改良MTT法[5]。取对数生长的KB和KBv 200细胞，按每孔含3×103个细胞，接种至96孔平底细胞培养板，培养48 h，换成含不同药物(VCR或Dox和R-VPM或VPM)的全1640液继续培养3天，每孔加5 mg/ml的MTT 50 μl，37℃避光作用4 h，弃去孔内液，每孔加DMSO 150 μl，甘氨酸缓冲液25 μl(pH 10.5)，充分溶解后于DG3022A型酶联免疫检测仪570 nm处测吸收值。实验对照为不含药物的全1640液培养的相应细胞。实验孔细胞生存率按公式：(实验孔的吸收值)/(对照孔的吸收值)×100%计算。IC50是细胞生存率为50%时孔内药物浓度，即杀伤一半细胞所需药物浓度，增敏倍数=(对照组的IC50)/(R-VPM或VPM同时作用时的IC50)。统计学处理采用t检验。
1.2.3 细胞内阿霉素积蓄实验 KB细胞和KBv 200细胞分别接种于5 ml培养液中，细胞浓度为1.3×109个/L。加入Dox，终浓度为10 μmol/L，加入R-VPM或VPM，终浓度为5 μmol/L，对照组不加R-VPM和VPM。在37℃药物作用细胞3 h。离心弃上清，用冷PBS洗细胞3次。用含HCl 0.3 mol/L的60%的乙醇悬浮裂解细胞，离心，取上清，用荧光分光光度法检测Dox。激发光波长λex 470 nm，发出光波长λem 585 nm[6]。
, 百拇医药
1.2.4 动物毒性试验 BALB/c小鼠，腹腔注射R-VPM和VPM，观察7天。R-VPM注射剂量范围为102～250 mg/kg，VPM注射剂量为38.4～93.8 mg/kg。剂量间比值为0.8。采用Bliss加权回归法计算半数致死量LD50。
2 结 果
2.1 毛细管电泳 拆分产物R-VPM为白色粉剂，右侧旋光。其质谱分析，红外线吸收，元素分析，溶点测定显示拆分产物为R-VPM[2]。毛细管电泳显示出一个R-VPM峰，无S-VPM峰及其他杂质成分(图1)。拆分产物R-VPM的纯度良好。
图1 R-VPM的毛细管电泳图
Figure 1 Electropherogram of R-VPM
, 百拇医药
2.2 R-VPM逆转KBv 200细胞的多药耐药性 VCR对KBv 200细胞的IC50为1 083 nmol/L。加入浓度为1.25 μmol/L的R-VPM，使IC50降至127 nmol/L，与VCR单独作用的IC50相比，差异显著(P<0.01)，KBv 200细胞对VCR的敏感性增加8.5倍。1.25 μmol/L的R-VPM同样有效降低Dox对KBv 200细胞的IC50(P<0.01)，使KBv 200细胞对Dox的敏感性增加2.7倍。VPM与R-VPM在增敏效应上差异不显著(P>0.05)，二者均不能使KB细胞对VCR和Dox的敏感性增加(表1、表2)。
表1 R-VPM逆转KBv 200细胞对VCR的耐药性
Table 1 Reversal of MDR of KBv 200 cells to VCR Drug(μmol/L)
, 百拇医药
IC50 of VCR/nmol/L
Potentiation fold
KB
KBv 200
KB
KBv 200
Control
0
6.2±0.6
1 083±16
R-VPM
1.25
, http://www.100md.com
6.5±0.5*
127±11**
0.95
8.5
2.5
5.9±0.4*
76±8**
1.05
14.3
5
6.7±0.8*
, http://www.100md.com
42±6**
0.93
25.8
VPM
5
6.4±0.6*
41±6**
0.97
26.4
IC50：
±s,3 times independent experiments.*Differnece is not significant as compared with the control(P>0.05);**Difference is significant as compared with the control(P<0.01)表2 R-VPM逆转KBv 200细胞对Dox的耐药性, 百拇医药
Table 2 Reversal of MDR of KBv 200 cells to Dox Drug(μmol/L)
IC50 of Dox/nmol/L
Potentiation fold
KB
KBv 200
KB
KBv 200
Control
0
6.7±0.7
61±8
, http://www.100md.com
R-VPM
1.25
7.2±0.8*
23±3**
0.9
2.7
2.5
6.1±0.8*
18±2**
1.1
3.4
5
, 百拇医药
6.6±0.5*
13±2**
1.0
4.7
VPM
5
6.7±0.9*
12±2**
1.0
5.1
IC50：
±s,3 times independent experiments.*Differnece is not significant as compared with the control(P>0.05);**Difference is significant as compared with the control(P<0.01), 百拇医药
2.3 R-VPM增加KBv 200细胞内Dox的积蓄 10 μmol/L的Dox作用细胞后，KB细胞内Dox含量是KBv 200细胞内Dox含量的4.2倍。R-VPM和VPM同样有效地增加KBv 200细胞内Dox的含量(P<0.01)，但对KB细胞无作用(表3)。表3 R-VPM对细胞内Dox积蓄的影响
Table 3 Effect of R-VPM on Dox accumulation Drug(μmol/L)
Dox(nmol/106cells)
Accumulation fold
KB
KBv 200
KB
, 百拇医药
KBv 200
Control
0
5.13±0.19
1.22±0.07
1.0
1.0
R-VPM
5
5.15±0.26*
2.79±0.12**
1.0
, 百拇医药
2.3
VPM
5
5.16±0.24*
2.83±0.18**
1.0
2.3
Dox accumulation:
±s，3 times experiments.*Differnece is not significant as compared with the control(P>0.05)；**Differnece is significant as compared with the control(P<0.01)。, 百拇医药
2.4 R-VPM的动物毒性 R-VPM对BALB/c小鼠的急性毒性作用低于VPM(P<0.05)(表4)。
表4 R-VPM和VPM对BALB/c小鼠的急性毒性作用
Table 4 Acute toxicity of R-VPM and VPM in BALB/c mice Drug
LD50(mg/kg)
R-VPM
166 (145～191)*
VPM
60(52～69)*
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* 95% confidence limit is shown in the parenthesis.
3 讨 论
肿瘤细胞的MDR是由于肿瘤细胞膜上P170蛋白过度表达的结果。P170蛋白具有药泵功能，能将细胞内的抗癌药泵出细胞外，降低细胞内药物含量，使肿瘤细胞对生物碱类和蒽环类抗癌药变得不敏感。VPM能与P170蛋白相互作用，减少这两类抗癌药的“泵出”，提高抗癌药的杀伤力。但由于VPM对心脏的作用，限制了它在体内达到化疗增敏所需的药物浓度。R-VPM的心脏作用仅为VPM的1/10[1]，有可能以体内所能承受的药物浓度及药物作用时间实现R-VPM的化疗增敏作用。
我们用化学拆分的方法，在国内首先制备了R-VPM。毛细管电泳显示拆分产物R-VPM中不含S-VPM及其他杂质。R-VPM的急性动物毒性低于VPM。国外使用R-VPM的化疗增敏实验，作用时间为7天[7]。考虑到以后的临床应用，我们将药物作用时间缩短至3天。实验结果表明，R-VPM的增敏效应与其浓度成正相关。1.25 μmol/L的R-VPM可使耐药的KBv 200细胞对VCR的敏感性增加8.5倍，对Dox的敏感性增加2.7倍，具有明显增敏作用。而R-VPM在体内可以安全达到2～3 μmol/L的浓度[7，8]，因此R-VPM在实现临床化疗增敏作用方面具有可行性，R-VPM有望成为未来的化疗增敏剂。
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R-VPM的增敏机制同样是与P170蛋白相互作用，使细胞内Dox等化疗药物积蓄增加，提高了杀癌细胞效应。因亲代敏感KB细胞不存在“过度”的药泵作用，因此，R-VPM和VPM对KB细胞无化疗增敏作用。已有资料表明，化疗增敏剂与化疗药合用并不增加化疗药对白细胞的毒性作用。
(致谢!感谢南京军区南京总医院药理科芮建中博士帮助完成用毛细管电泳检测拆分产物R-VPM。)
方刚(1960-),男,江苏南通人,讲师,医学硕士,从事肿瘤免疫生物学专业.
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收稿日期：2000-04-22
修稿日期：2000-06-05, 百拇医药