P27蛋白在骨肉瘤中表达的意义及其与预后的关系
作者：仲召阳 罗进 王东 陈俐
单位：仲召阳(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所病理科，重庆 400042)；罗进(武警四川总队医院病理科，乐山 614000)；王东(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所病理科，重庆 400042)；陈俐(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所病理科，重庆 400042)
关键词：骨肉瘤；P27蛋白；免疫组化；预后
第三军医大学学报000523 提 要： 目的 探讨P27蛋白表达与骨肉瘤临床病理、肿瘤细胞增殖活性及其与预后的关系。方法 应用S-P免疫组化法检测80例骨肉瘤P27蛋白及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，计算其标记指数(Labeling index ，LI)。结果 p27 LI在0%～97.5%之间，PCNA LI在9%～98%之间，而在正常骨及良性骨瘤中不见表达。P27蛋白表达与骨肉瘤Dahlin分型、Price分级无关，而与WHO分型、PCNA LI密切相关。生存率分析显示，p27 LI<48.4%的骨肉瘤预后较好，LI>48.4%的骨肉瘤预后较差。结论 骨肉瘤P27蛋白表达与肿瘤细胞增殖活性及生存率密切相关，其表达对骨肉瘤诊断和预后评估可能具有重要价值。
, 百拇医药
中图法分类号： R394.3;R738.1 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)05-0481-03
Expression of P27 protein in osteosarcoma and its prognostic significance
ZHONG Zhao-yang, LUO Jing, WANG Dong, CHEN Li
(Department of Pathology, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)
Abstract： Objective To investigate the P27 protein expression in osteosarcoma and its relation to clinicopathological features, tumor cells proliferation and the prognosis. Methods The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and P27 protein was semiquantitatively analyzed with S-P immunohistochemistry in a consecutive prospective series of 80 cases of osteosarcoma. Meanwhile, the labeling index (LI) was calculated. Results In all the 80 cases, the range of P27 LI was 0%～97.5% and that of PCNA LI 9%～98%. However, the benign bone tumor normal bone tissue were negative in the staining. The expression of P27 protein was not correlated to Dahlin's type and Price's grade but closely correlated with WHO classification as well as PCNA LI. Furthermore, the patients with a P27 LI less than 48.4% showed a better survival rate than those with a P27 LI more than 48.4%. Conclusion P27 protein expression is closely related to survival in osteosarcoma and PCNA, suggesting that P27 protein may serve as a valuable marker for diagnosis and an indicator to predict the prognosis of osteosarcoma.
, 百拇医药
Key words： osteosarcoma; P27 protein; immunohistochemistry; prognosis
p27是新近发现的一种潜在肿瘤抑制基因，属于CDKIS(Cyclin-dependent kinase inhibitos)家族。已有研究表明，p27基因及其表达产物对人体多种恶性肿瘤的增殖和分化有调控作用[1,2]，而在骨肉瘤中的研究，国内外尚未有报道。本研究应用S-P法检测80例人体骨肉瘤中P27蛋白的表达，以探讨其与骨肉瘤细胞增殖活性及其预后的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
80例骨肉瘤选自1968～1993年附属大坪医院存档病例。其中男性52例，女性28例，肿瘤侵犯软组织74例(92.5%)，肿瘤直径5～25 cm，平均10 cm，组织学分级参照Price分级法，织学分型参照Dahlin标准和1993年WHO分型。全部病例均随访，总体2年存活率33.8%，5年存活率18.3%。此外选用15例骨瘤，12例骨软骨瘤，10例正常骨作对照组。
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1.2 免疫组化染色
全部标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片，增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和P27单克隆抗体均为Dako公司产品，加强型S-P法进行免疫组化染色。用已知P27阳性的直肠癌作阳性对照，PBS液取代第一抗作阴性对照。
1.3 结果判定及统计学处理
每张切片观察5个具有代表性的高倍视野(×400)，计数400个细胞P27阳性细胞数。PCNA标记计数(Labeling index，LI)=PCNA阳性细胞数/观察的肿瘤细胞数×100%；P27 LI=p27阳性细胞数/观察的肿瘤细胞数×100%，根据p27 LI 将标记结果分为0～Ⅲ级：0级阴性(<10%)；Ⅰ级(10%～30%)；Ⅱ级(30%～66%)；Ⅲ级(>66%)。P27蛋白表达与骨肉瘤临床病理的关系，应用Pearson χ2检验进行统计学分析，P27 LI与PCNA LI相关性采用Spearman秩和相关检验，以中位数将P27染色结果分为高表达与低表达两组，统计两组骨肉瘤存活期，并行Long-rank检验。
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2 结果
2.1 P27蛋白免疫组化染色结果
P27阳性产物呈棕褐色细颗粒状，主要位于胞核，部分可见于胞浆内。阳性细胞呈弥漫或灶性分布，见图1。P27标记指数在0%～97.5%，平均指数51.5%，中位数48.4%,80例骨肉瘤免疫组化染色结果阴性14例(17.5%)，Ⅰ级24例(30%)，Ⅱ级14例(17.5%) Ⅲ级28例(35%)。正常骨、骨肉瘤边缘反应性新生骨和良性骨肿瘤未见着色。
图1 骨肉瘤P27蛋白免疫组化染色，阳性反应主要定位于细胞核
，部分可见与胞浆 (S-P×200)
Fig 1 Immunohistochemical staining of P27 protein
, 百拇医药
in osteosarcoma, The positive product is most localized
in nuclear of tumor cell, a little in cytoplasm (S-P×200) 2.2 PCNA免疫组化染色结果
PCNA的表达呈颗粒状阳性，定位于细胞核，见图2。骨肉瘤中骨母细胞、纤维母细胞、软骨母细胞、小圆细胞、多核巨细胞，对PCNA均呈阳性表达。随着骨肉瘤分化程度不同，PCNA表达亦呈显著异质性。PCNA的标记指数为9%～98%，平均指数为54.5%。
图2 骨肉瘤PCNA免疫组化染色，阳性反应主要定位于细胞核(S-P×200)
Fig 2 Immunohistochemical staining of P27 protein in
, http://www.100md.com
osteosarcoma, the positive product is most localized
in nuclear of tumor cell (S-P×200) 2.3 P27蛋白表达与骨肉瘤临床病理关系
P27蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤的大小，Price分级和Dahlin氏分型无关，而与WHO分型密切相关，即WHO分型中高分化型P27蛋白表达明显低于其它类型(P<0.05)，见表。
表1 P27蛋白表达与骨肉瘤临床病理关系
Tab 1 The relationship between the expression of p27 protein
and clinicopathological data in osteosarcoma Parameter
, http://www.100md.com
n
P27
negative
P27 positive
P
-
Ⅱ
Ⅲ
Sex
male
52
9
16
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10
17
>0.05
female
28
5
8
4
11
Tmor size (cm)
<10
39
6
, 百拇医药
11
8
14
>0.05
≥10
41
8
13
6
14
Invade the soft tissue
Invasion
74
, http://www.100md.com
13
22
13
26
>0.05
Uninvasion
6
1
2
1
2
Price's grading
Ⅰ
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12
2
3
3
4
Ⅱ
30
5
11
5
9
>0.05
Ⅲ
38
, http://www.100md.com
7
10
6
15
Dahlin's classification
Osteoblastic
24
3
6
5
10
Chondroblastic
25
, 百拇医药
6
7
4
8
>0.05
Fibroblastic
24
4
8
4
8
mixed type
7
, 百拇医药
1
3
1
2
WHO classification
Well-differentiated
14
6
4
3
1
<0.05
Classic
, 百拇医药
59
8
17
11
23
Telangiectatic
4
0
0
3
Small type
3
0
, 百拇医药
2
0
2.4 P27蛋白表达与PCNA的关系
本组骨肉瘤中PCNA高表达者P27多显示为高表达，经Spearman秩和相关检验，等级相关系rs=0.445(P<0.01)，提示PCNA和P27之间存在显著正相关。
2.5 P27蛋白表达与骨肉瘤病人预后的关系
本组肿瘤P27蛋白LI中位数为48.4%，以此将骨肉瘤分为高表达组和低表达组，行log-rank检验。Log-rank检验结果：χ2=7.37，两者相差显著(P<0.05)，表明P27高表达组骨肉瘤患者的生存期较低表达组显著缩短。
3 讨论
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本研究P27蛋白在良性肿瘤及正常骨中不表达，而在骨肉瘤中表达率高达82.5%，提示P27蛋白可作为骨肉瘤诊断和鉴别诊断的标记物，具有一定的临床实用价值。
p27基因是最近发现的CDKIS家族成员之一，在细胞的增殖和分化调控中起着非常重要作用。人p27Kip 1由198个氨基酸组成的热稳定蛋白，与p27Kip 1在N端具有高度同源性，其N端28～87位的60个氨基酸具有2个Ser磷酸化点，具有Cdk激酶抑制作用，153～169位的17个氨基酸序列为核定位序列，与细胞周期的调控功能密切相关[3]。p27对肿瘤细胞、上皮细胞、胚胎成纤维细胞及接近体内状态的实质性细胞的原代培养物均表现为抑制作用，使细胞滞留于G1期[4]。在前列腺[5]、乳腺、结直肠癌[6]及肺部恶性肿瘤[1]中p27表达越低，肿瘤的分级越高，恶性程度越大，预后越差，复发的可能性越大，而且转移的肿瘤P27蛋白表达的强度及数量显著低于原发灶肿瘤。本研究结果则与此相反，显示骨肉瘤分化越低，增殖指数越高，p27的表达越强。有作者在对软骨肉瘤的研究也出现类似结果[7]，提示上述差异可能与癌和肉瘤的组织异质性有关。另一方面在有些肿瘤中发现p27Kip 1的突变，沉默突变构成了p27基因的局部位点的多态现象[8] ，Morosetti等[9]提出了野生型p27(wild-type p27)概念，这也可能是上述结果的原因之一。
, 百拇医药
PCNA是DNA聚合酶δ的一种辅助蛋白，分子量为3.6×104，主要合成于G1/S期，可作为组织学原位G1/S期的标记物。本研究显示p27和PCNA呈显著正相关。已知p27是CDKIS家庭成员之一，是一种潜在的抑制基因，上述免疫组化检测结果的矛盾性，可能是p27Kip 1基因结构和调控复杂性的反映，其机制有待于今后进一步研究。此外，P27蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小及Dahlin分型、Price分级均无关，而与WHO骨肉瘤新分型密切相关，同时我们通过对80例随防资料的骨肉瘤病例进行研究，结果表明P27 LI>48.4%比P27 LI<48.4%的骨肉瘤预后差,提示P27蛋白检测可能是一项判估骨肉瘤病人预后有价值的指标。
作者简介：仲召阳(1977-)，男，江苏省连云港市人，医师，主要从事骨肉瘤与血管的关系方面的研究。电话：(023)68757384
参考文献：
, 百拇医药
[1] Kawana H, Tamaru J, Tanaka T,et al. Role of P27 Kip 1 and cyclin-dependent kinase 2 in the proliferation of non-small cell lung cancer[J]. Am J Pathol，1998,153(2):505-513.
[2] Yasui W, Kudo Y, Semba S,et al. Reduced expression of cyclin-dependent kinase inhibitor P27Kip 1 is associated with advanced stage and invasiveness of gastric carcinoma[J]. Jpn J Cancer Res, 1997,88(7):625-629.
[3] Luo Y, Huorwitz J, Massagu J. Cell-cycle inhibitor by independent CDK and PCNA binding domains in p21Kip 1[J]. Nature，1995,375(6 529):159-161.
, http://www.100md.com
[4] Bullrich F, Maclachlan T K, Sang N,et al. Chromosomal mapping of members of the cdc2 family of protein kinases ,cdk3,cdk6,PISSLRE and PITALRE, and a cdk inhibitor,p27Kip 1,toregions involved in human cancer[J]. Cancer Res,1995,55(6):1 199-1 205.
[5] Yang R M, Naitoh J, Murphy M,et al. Low p27 experssion predicts poor disease-free survival in patients with prostate cancer[J]. J Urol,1998,159(3):941-945.
[6] Thomas G V, Szigeti K, Murphy M, et al. Down-regulation of p27 is associated with development of colorectal adenoma metastases[J]. Am J Pathol,1998,153(3):681-687.
, 百拇医药
[7] 龙汉安, 张贤良，魏于全，等. P27蛋白在软骨肉瘤中表达的意义[J]. 癌症，1998，17(4):257-258.
[8] Ferrando A A， Balb M, Pend A M,et al. Mutational analysis of the human cycle-dependent kinase inhibitor p27Kip 1 in primary breast carcinoma[J]. Science,1996,97(1):91-94.
[9] Morosetti R, Kawamata N, Gombart A F, et al. Alterations of the p27Kip 1 gene in non-Hodgkin’s lymphoma and adult T-cell leukemia/lymphoma[J]. Blood,1995,86(5):1 924-1 930.
收稿日期：1999-10-05；修回日期：2000-01-03, 百拇医药
单位：仲召阳(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所病理科，重庆 400042)；罗进(武警四川总队医院病理科，乐山 614000)；王东(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所病理科，重庆 400042)；陈俐(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所病理科，重庆 400042)
关键词：骨肉瘤；P27蛋白；免疫组化；预后
第三军医大学学报000523 提 要： 目的 探讨P27蛋白表达与骨肉瘤临床病理、肿瘤细胞增殖活性及其与预后的关系。方法 应用S-P免疫组化法检测80例骨肉瘤P27蛋白及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，计算其标记指数(Labeling index ，LI)。结果 p27 LI在0%～97.5%之间，PCNA LI在9%～98%之间，而在正常骨及良性骨瘤中不见表达。P27蛋白表达与骨肉瘤Dahlin分型、Price分级无关，而与WHO分型、PCNA LI密切相关。生存率分析显示，p27 LI<48.4%的骨肉瘤预后较好，LI>48.4%的骨肉瘤预后较差。结论 骨肉瘤P27蛋白表达与肿瘤细胞增殖活性及生存率密切相关，其表达对骨肉瘤诊断和预后评估可能具有重要价值。
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中图法分类号： R394.3;R738.1 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)05-0481-03
Expression of P27 protein in osteosarcoma and its prognostic significance
ZHONG Zhao-yang, LUO Jing, WANG Dong, CHEN Li
(Department of Pathology, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)
Abstract： Objective To investigate the P27 protein expression in osteosarcoma and its relation to clinicopathological features, tumor cells proliferation and the prognosis. Methods The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and P27 protein was semiquantitatively analyzed with S-P immunohistochemistry in a consecutive prospective series of 80 cases of osteosarcoma. Meanwhile, the labeling index (LI) was calculated. Results In all the 80 cases, the range of P27 LI was 0%～97.5% and that of PCNA LI 9%～98%. However, the benign bone tumor normal bone tissue were negative in the staining. The expression of P27 protein was not correlated to Dahlin's type and Price's grade but closely correlated with WHO classification as well as PCNA LI. Furthermore, the patients with a P27 LI less than 48.4% showed a better survival rate than those with a P27 LI more than 48.4%. Conclusion P27 protein expression is closely related to survival in osteosarcoma and PCNA, suggesting that P27 protein may serve as a valuable marker for diagnosis and an indicator to predict the prognosis of osteosarcoma.
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Key words： osteosarcoma; P27 protein; immunohistochemistry; prognosis
p27是新近发现的一种潜在肿瘤抑制基因，属于CDKIS(Cyclin-dependent kinase inhibitos)家族。已有研究表明，p27基因及其表达产物对人体多种恶性肿瘤的增殖和分化有调控作用[1,2]，而在骨肉瘤中的研究，国内外尚未有报道。本研究应用S-P法检测80例人体骨肉瘤中P27蛋白的表达，以探讨其与骨肉瘤细胞增殖活性及其预后的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
80例骨肉瘤选自1968～1993年附属大坪医院存档病例。其中男性52例，女性28例，肿瘤侵犯软组织74例(92.5%)，肿瘤直径5～25 cm，平均10 cm，组织学分级参照Price分级法，织学分型参照Dahlin标准和1993年WHO分型。全部病例均随访，总体2年存活率33.8%，5年存活率18.3%。此外选用15例骨瘤，12例骨软骨瘤，10例正常骨作对照组。
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1.2 免疫组化染色
全部标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片，增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和P27单克隆抗体均为Dako公司产品，加强型S-P法进行免疫组化染色。用已知P27阳性的直肠癌作阳性对照，PBS液取代第一抗作阴性对照。
1.3 结果判定及统计学处理
每张切片观察5个具有代表性的高倍视野(×400)，计数400个细胞P27阳性细胞数。PCNA标记计数(Labeling index，LI)=PCNA阳性细胞数/观察的肿瘤细胞数×100%；P27 LI=p27阳性细胞数/观察的肿瘤细胞数×100%，根据p27 LI 将标记结果分为0～Ⅲ级：0级阴性(<10%)；Ⅰ级(10%～30%)；Ⅱ级(30%～66%)；Ⅲ级(>66%)。P27蛋白表达与骨肉瘤临床病理的关系，应用Pearson χ2检验进行统计学分析，P27 LI与PCNA LI相关性采用Spearman秩和相关检验，以中位数将P27染色结果分为高表达与低表达两组，统计两组骨肉瘤存活期，并行Long-rank检验。
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2 结果
2.1 P27蛋白免疫组化染色结果
P27阳性产物呈棕褐色细颗粒状，主要位于胞核，部分可见于胞浆内。阳性细胞呈弥漫或灶性分布，见图1。P27标记指数在0%～97.5%，平均指数51.5%，中位数48.4%,80例骨肉瘤免疫组化染色结果阴性14例(17.5%)，Ⅰ级24例(30%)，Ⅱ级14例(17.5%) Ⅲ级28例(35%)。正常骨、骨肉瘤边缘反应性新生骨和良性骨肿瘤未见着色。
图1 骨肉瘤P27蛋白免疫组化染色，阳性反应主要定位于细胞核
，部分可见与胞浆 (S-P×200)
Fig 1 Immunohistochemical staining of P27 protein
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in osteosarcoma, The positive product is most localized
in nuclear of tumor cell, a little in cytoplasm (S-P×200) 2.2 PCNA免疫组化染色结果
PCNA的表达呈颗粒状阳性，定位于细胞核，见图2。骨肉瘤中骨母细胞、纤维母细胞、软骨母细胞、小圆细胞、多核巨细胞，对PCNA均呈阳性表达。随着骨肉瘤分化程度不同，PCNA表达亦呈显著异质性。PCNA的标记指数为9%～98%，平均指数为54.5%。
图2 骨肉瘤PCNA免疫组化染色，阳性反应主要定位于细胞核(S-P×200)
Fig 2 Immunohistochemical staining of P27 protein in
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osteosarcoma, the positive product is most localized
in nuclear of tumor cell (S-P×200) 2.3 P27蛋白表达与骨肉瘤临床病理关系
P27蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤的大小，Price分级和Dahlin氏分型无关，而与WHO分型密切相关，即WHO分型中高分化型P27蛋白表达明显低于其它类型(P<0.05)，见表。
表1 P27蛋白表达与骨肉瘤临床病理关系
Tab 1 The relationship between the expression of p27 protein
and clinicopathological data in osteosarcoma Parameter
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n
P27
negative
P27 positive
P
-
Ⅱ
Ⅲ
Sex
male
52
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Tmor size (cm)
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Invade the soft tissue
Invasion
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Price's grading
Ⅰ
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Dahlin's classification
Osteoblastic
24
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Chondroblastic
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mixed type
7
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WHO classification
Well-differentiated
14
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Small type
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2.4 P27蛋白表达与PCNA的关系
本组骨肉瘤中PCNA高表达者P27多显示为高表达，经Spearman秩和相关检验，等级相关系rs=0.445(P<0.01)，提示PCNA和P27之间存在显著正相关。
2.5 P27蛋白表达与骨肉瘤病人预后的关系
本组肿瘤P27蛋白LI中位数为48.4%，以此将骨肉瘤分为高表达组和低表达组，行log-rank检验。Log-rank检验结果：χ2=7.37，两者相差显著(P<0.05)，表明P27高表达组骨肉瘤患者的生存期较低表达组显著缩短。
3 讨论
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本研究P27蛋白在良性肿瘤及正常骨中不表达，而在骨肉瘤中表达率高达82.5%，提示P27蛋白可作为骨肉瘤诊断和鉴别诊断的标记物，具有一定的临床实用价值。
p27基因是最近发现的CDKIS家族成员之一，在细胞的增殖和分化调控中起着非常重要作用。人p27Kip 1由198个氨基酸组成的热稳定蛋白，与p27Kip 1在N端具有高度同源性，其N端28～87位的60个氨基酸具有2个Ser磷酸化点，具有Cdk激酶抑制作用，153～169位的17个氨基酸序列为核定位序列，与细胞周期的调控功能密切相关[3]。p27对肿瘤细胞、上皮细胞、胚胎成纤维细胞及接近体内状态的实质性细胞的原代培养物均表现为抑制作用，使细胞滞留于G1期[4]。在前列腺[5]、乳腺、结直肠癌[6]及肺部恶性肿瘤[1]中p27表达越低，肿瘤的分级越高，恶性程度越大，预后越差，复发的可能性越大，而且转移的肿瘤P27蛋白表达的强度及数量显著低于原发灶肿瘤。本研究结果则与此相反，显示骨肉瘤分化越低，增殖指数越高，p27的表达越强。有作者在对软骨肉瘤的研究也出现类似结果[7]，提示上述差异可能与癌和肉瘤的组织异质性有关。另一方面在有些肿瘤中发现p27Kip 1的突变，沉默突变构成了p27基因的局部位点的多态现象[8] ，Morosetti等[9]提出了野生型p27(wild-type p27)概念，这也可能是上述结果的原因之一。
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PCNA是DNA聚合酶δ的一种辅助蛋白，分子量为3.6×104，主要合成于G1/S期，可作为组织学原位G1/S期的标记物。本研究显示p27和PCNA呈显著正相关。已知p27是CDKIS家庭成员之一，是一种潜在的抑制基因，上述免疫组化检测结果的矛盾性，可能是p27Kip 1基因结构和调控复杂性的反映，其机制有待于今后进一步研究。此外，P27蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小及Dahlin分型、Price分级均无关，而与WHO骨肉瘤新分型密切相关，同时我们通过对80例随防资料的骨肉瘤病例进行研究，结果表明P27 LI>48.4%比P27 LI<48.4%的骨肉瘤预后差,提示P27蛋白检测可能是一项判估骨肉瘤病人预后有价值的指标。
作者简介：仲召阳(1977-)，男，江苏省连云港市人，医师，主要从事骨肉瘤与血管的关系方面的研究。电话：(023)68757384
参考文献：
, 百拇医药
[1] Kawana H, Tamaru J, Tanaka T,et al. Role of P27 Kip 1 and cyclin-dependent kinase 2 in the proliferation of non-small cell lung cancer[J]. Am J Pathol，1998,153(2):505-513.
[2] Yasui W, Kudo Y, Semba S,et al. Reduced expression of cyclin-dependent kinase inhibitor P27Kip 1 is associated with advanced stage and invasiveness of gastric carcinoma[J]. Jpn J Cancer Res, 1997,88(7):625-629.
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收稿日期：1999-10-05；修回日期：2000-01-03, 百拇医药