大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞体外培养和鉴定
作者：郝嘉 李永旺 肖颖彬
单位：郝嘉(第三军医大学附属新桥医院心血管外科)；李永旺(麻醉科，重庆 400037)；肖颖彬(第三军医大学附属新桥医院心血管外科)
关键词：大鼠；肺泡Ⅱ型上皮细胞；培养；鉴定
第三军医大学学报000530 提 要： 目的 建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(简称AT-Ⅱ)的改良体外原代培养法，并比较其鉴定方法的优劣。方法 AT-Ⅱ分离、用胰蛋白酶消化法并用IgG包被的培养瓶粘附纯化，原代培养后通过鞣酸多彩、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)免疫组化三种染色法和电镜鉴定 AT-Ⅱ。结果 胰酶消化加IgG粘附纯化后所得的 AT-Ⅱ纯度为90%,AKP染色鉴定最好。结论 采用IgG粘附纯化能提高 AT-Ⅱ纯度，AKP染色简便实用。
中图法分类号： R329 文献标识码： B
, 百拇医药
文章编号：1000-5404(2000)05-0500-02
Culture and identification of rat alveolar type Ⅱ cell in vitro
AT-Ⅱ对维持正常的肺功能发挥着极重要的作用。体外培养AT-Ⅱ是研究其特性的重要手段，由于它培养后表型丧失快，基本不传代，并且培养难度较大，不易获得较高纯度，故本研究采用一种改良方法培养并比较了四种鉴定方法的优劣。
1 材料和方法
1.1 原代培养
参照Dobbs[1]的方法加以改进。Wistar大鼠麻醉、抗凝，气管插管，放血活杀。经肺动脉用溶液Ⅱ(液Ⅰ、Ⅱ配法见文献[1])灌洗肺,气管通气8次，用溶液Ⅰ、Ⅱ分别经气管插管灌洗肺，用溶液Ⅱ灌洗胸腔。取出心肺、气管，经气管插管注入0.25%胰蛋白酶20 ml, 37℃水浴20 min。去大气道、心脏，在含有4 ml DNase的小烧杯中剪碎肺。5 ml小牛血清灭活胰酶，补足溶液Ⅱ20 ml后倒入烧瓶，37℃水浴并晃动5 min。120、200目滤网过滤，离心后弃上清，细胞重悬并计数。将悬液加入已用大鼠IgG包被的培养瓶中培养。1 h后倒出培养液，离心后弃上清，取少量细胞行电镜鉴定。培养23 h换培养液。
, 百拇医药
1.2 细胞鉴定
1.2.1鞣酸多彩染色 参照Mason等[2]的方法略加改进：取出培养有AT-Ⅱ的盖玻片，PBS冲洗，1.5%戊二醛固定15 min,PBS(pH 6.8)冲洗2次,1%锇酸(校电镜室)固定1.5 h,PBS(pH 6.8)冲洗2次,1%鞣酸中过夜,用PBS(pH 6.8)和水各洗涤2次,将蓝染液(蓝染液和红染液配法见文献[2])与水按1∶4稀释后染色8 s。1%NaOH 洗涤30 s，红染液染色2 s,酸乙醇液洗涤3次,用红染液染2 s,水洗3次,干燥后封片。
1.2.2 AKP染色 参照Cunningham等[3]的方法略加改进：取出盖玻片后用TBS液洗涤5 min×4次；在1 mlTBS浓缩缓冲液中加20 μl BCIP/NBT显色盒(博士德公司)并混匀,待标本风干后加至标本上，室温避光显色20 min，水洗后核固红复染1 min，梯度脱水，干燥封片。
, 百拇医药
1.2.3 肺表面活性物质相关蛋白A(Pulmonary surfactant A,SP-A)免疫组化染色 按中山公司SP免疫组化试剂盒说明书操作，SP-A抗体浓度为1∶800(美国Sheldon I.Feinsein教授惠赠)。
1.2.4 电镜 用3%戊二醛固定细胞后行透射电镜检查。
2 结果
2.1 细胞产量、纯度
原代培养AT-Ⅱ可收获3×107个/鼠，纯度可达90%。
2.2 细胞鉴定
鞣酸多彩染色、AKP染色和SP-A免疫组化染色结果见图1、2。
, 百拇医药
图1 培养5 d的AT-Ⅱ(鞣酸染色×400)
可见不均匀地分布在核周的大小不一的褐色的嗜锇
小体(板层小体)，细胞聚集成小岛状
图2 培养2 d的AT-Ⅱ(AKP染色×400)
胞浆中有较多分布不均，大小不一的蓝色颗粒3 讨论
尽管国外对AT-Ⅱ分离和培养的报道较多，但国内此方面的工作仍较少。较常用的密度梯度离心法因细胞间密度重叠使细胞产量下降。我们的体会如下：①使用IgG后细胞纯度可提高10%，产量提高12%。由于IgG可与含IgGFc受体的淋巴细胞、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞牢固结合，因此绝大多数杂细胞被粘附清除。但此方法清除肺泡Ⅰ型细胞和支气管上皮细胞仍较困难;②培养时用小牛或胎牛血清培养效果类似;③有人在过滤肺剪碎块时先用四层纱布过滤[4]，然后用铜网过滤，我们认为纱布吸收过多细胞悬液而造成细胞量损失，本研究定做了120、200目不锈钢滤网，效果好且易操作。鉴定方法少有使用SP-A免疫组化鉴定该细胞的报道[5]。电镜鉴定仍为最可靠方法，但因其价格贵而应用受限。鞣酸多彩染色法最常用，其嗜锇小体较为特异,但AM也可着色，且该法耗时长，试剂繁多且价格与AKP染色相似。SP-A免疫组化鉴定法为一种新颖的方法，国内尚无类似报道。因AT-Ⅱ中SP-A含量最多，易于检出，但该抗体来源困难，故而推广受限。AKP是Ⅱ型细胞分化的特异标志物，也是膜标志酶。AKP染色明显优点是耗时短,BCIP/NBT显色盒还可在本实验的原位杂交中综合利用，从而节约试剂，值得推荐。
, http://www.100md.com
作者简介：郝 嘉(1973-)，男，四川省荣县人，硕士研究生，医师，助教，主要从事体外循环肺保护方面的研究。电话：(023)65218768
参考文献：
[1] Dobbs L G, Gonzalez R, Williams M C. An improved method for isolating type Ⅱ cells high yield and purity[J]. Am Rev Respir Dis,1986,134(1):141-145.
[2] Mason R J, Walker S R, Shields B A, et al.Identification of rat alveolar type Ⅱ epithelial cells with a tannic acid and polychrome stain[J]. Am Rev Respir Dis, 1985，131(5):786-788.
, 百拇医药
[3] Cunningham A C, Milne D S, Wilkes J, et al. Constitutive expression of MHC and adhesion molecules by alveolar epithelials(type II pneumocytes)isolated from human lung and comparison with immunocytochemical findings[J]. J Cell Sci,1994,107(Pt 2):443-447.
[4] 崔社怀，郭先健，钱桂生.鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、鉴定和培养[J].第三军医大学学报，1997,19(6):548-550.
[5] 刘新民.肺泡上皮AT-Ⅱ研究进展[J].国外医学：呼吸系统分册，1994,14(2):88-91.
收稿日期：1999-10-05；修回日期：2000-01-03, 百拇医药
单位：郝嘉(第三军医大学附属新桥医院心血管外科)；李永旺(麻醉科，重庆 400037)；肖颖彬(第三军医大学附属新桥医院心血管外科)
关键词：大鼠；肺泡Ⅱ型上皮细胞；培养；鉴定
第三军医大学学报000530 提 要： 目的 建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(简称AT-Ⅱ)的改良体外原代培养法，并比较其鉴定方法的优劣。方法 AT-Ⅱ分离、用胰蛋白酶消化法并用IgG包被的培养瓶粘附纯化，原代培养后通过鞣酸多彩、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)免疫组化三种染色法和电镜鉴定 AT-Ⅱ。结果 胰酶消化加IgG粘附纯化后所得的 AT-Ⅱ纯度为90%,AKP染色鉴定最好。结论 采用IgG粘附纯化能提高 AT-Ⅱ纯度，AKP染色简便实用。
中图法分类号： R329 文献标识码： B
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文章编号：1000-5404(2000)05-0500-02
Culture and identification of rat alveolar type Ⅱ cell in vitro
AT-Ⅱ对维持正常的肺功能发挥着极重要的作用。体外培养AT-Ⅱ是研究其特性的重要手段，由于它培养后表型丧失快，基本不传代，并且培养难度较大，不易获得较高纯度，故本研究采用一种改良方法培养并比较了四种鉴定方法的优劣。
1 材料和方法
1.1 原代培养
参照Dobbs[1]的方法加以改进。Wistar大鼠麻醉、抗凝，气管插管，放血活杀。经肺动脉用溶液Ⅱ(液Ⅰ、Ⅱ配法见文献[1])灌洗肺,气管通气8次，用溶液Ⅰ、Ⅱ分别经气管插管灌洗肺，用溶液Ⅱ灌洗胸腔。取出心肺、气管，经气管插管注入0.25%胰蛋白酶20 ml, 37℃水浴20 min。去大气道、心脏，在含有4 ml DNase的小烧杯中剪碎肺。5 ml小牛血清灭活胰酶，补足溶液Ⅱ20 ml后倒入烧瓶，37℃水浴并晃动5 min。120、200目滤网过滤，离心后弃上清，细胞重悬并计数。将悬液加入已用大鼠IgG包被的培养瓶中培养。1 h后倒出培养液，离心后弃上清，取少量细胞行电镜鉴定。培养23 h换培养液。
, 百拇医药
1.2 细胞鉴定
1.2.1鞣酸多彩染色 参照Mason等[2]的方法略加改进：取出培养有AT-Ⅱ的盖玻片，PBS冲洗，1.5%戊二醛固定15 min,PBS(pH 6.8)冲洗2次,1%锇酸(校电镜室)固定1.5 h,PBS(pH 6.8)冲洗2次,1%鞣酸中过夜,用PBS(pH 6.8)和水各洗涤2次,将蓝染液(蓝染液和红染液配法见文献[2])与水按1∶4稀释后染色8 s。1%NaOH 洗涤30 s，红染液染色2 s,酸乙醇液洗涤3次,用红染液染2 s,水洗3次,干燥后封片。
1.2.2 AKP染色 参照Cunningham等[3]的方法略加改进：取出盖玻片后用TBS液洗涤5 min×4次；在1 mlTBS浓缩缓冲液中加20 μl BCIP/NBT显色盒(博士德公司)并混匀,待标本风干后加至标本上，室温避光显色20 min，水洗后核固红复染1 min，梯度脱水，干燥封片。
, 百拇医药
1.2.3 肺表面活性物质相关蛋白A(Pulmonary surfactant A,SP-A)免疫组化染色 按中山公司SP免疫组化试剂盒说明书操作，SP-A抗体浓度为1∶800(美国Sheldon I.Feinsein教授惠赠)。
1.2.4 电镜 用3%戊二醛固定细胞后行透射电镜检查。
2 结果
2.1 细胞产量、纯度
原代培养AT-Ⅱ可收获3×107个/鼠，纯度可达90%。
2.2 细胞鉴定
鞣酸多彩染色、AKP染色和SP-A免疫组化染色结果见图1、2。
, 百拇医药
图1 培养5 d的AT-Ⅱ(鞣酸染色×400)
可见不均匀地分布在核周的大小不一的褐色的嗜锇
小体(板层小体)，细胞聚集成小岛状
图2 培养2 d的AT-Ⅱ(AKP染色×400)
胞浆中有较多分布不均，大小不一的蓝色颗粒3 讨论
尽管国外对AT-Ⅱ分离和培养的报道较多，但国内此方面的工作仍较少。较常用的密度梯度离心法因细胞间密度重叠使细胞产量下降。我们的体会如下：①使用IgG后细胞纯度可提高10%，产量提高12%。由于IgG可与含IgGFc受体的淋巴细胞、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞牢固结合，因此绝大多数杂细胞被粘附清除。但此方法清除肺泡Ⅰ型细胞和支气管上皮细胞仍较困难;②培养时用小牛或胎牛血清培养效果类似;③有人在过滤肺剪碎块时先用四层纱布过滤[4]，然后用铜网过滤，我们认为纱布吸收过多细胞悬液而造成细胞量损失，本研究定做了120、200目不锈钢滤网，效果好且易操作。鉴定方法少有使用SP-A免疫组化鉴定该细胞的报道[5]。电镜鉴定仍为最可靠方法，但因其价格贵而应用受限。鞣酸多彩染色法最常用，其嗜锇小体较为特异,但AM也可着色，且该法耗时长，试剂繁多且价格与AKP染色相似。SP-A免疫组化鉴定法为一种新颖的方法，国内尚无类似报道。因AT-Ⅱ中SP-A含量最多，易于检出，但该抗体来源困难，故而推广受限。AKP是Ⅱ型细胞分化的特异标志物，也是膜标志酶。AKP染色明显优点是耗时短,BCIP/NBT显色盒还可在本实验的原位杂交中综合利用，从而节约试剂，值得推荐。
, http://www.100md.com
作者简介：郝 嘉(1973-)，男，四川省荣县人，硕士研究生，医师，助教，主要从事体外循环肺保护方面的研究。电话：(023)65218768
参考文献：
[1] Dobbs L G, Gonzalez R, Williams M C. An improved method for isolating type Ⅱ cells high yield and purity[J]. Am Rev Respir Dis,1986,134(1):141-145.
[2] Mason R J, Walker S R, Shields B A, et al.Identification of rat alveolar type Ⅱ epithelial cells with a tannic acid and polychrome stain[J]. Am Rev Respir Dis, 1985，131(5):786-788.
, 百拇医药
[3] Cunningham A C, Milne D S, Wilkes J, et al. Constitutive expression of MHC and adhesion molecules by alveolar epithelials(type II pneumocytes)isolated from human lung and comparison with immunocytochemical findings[J]. J Cell Sci,1994,107(Pt 2):443-447.
[4] 崔社怀，郭先健，钱桂生.鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、鉴定和培养[J].第三军医大学学报，1997,19(6):548-550.
[5] 刘新民.肺泡上皮AT-Ⅱ研究进展[J].国外医学：呼吸系统分册，1994,14(2):88-91.
收稿日期：1999-10-05；修回日期：2000-01-03, 百拇医药