培养细胞牵张刺激装置的建立及初步应用
作者：冯兵 何作云 王德文 罗惠兰
单位：冯兵(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；何作云(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；王德文(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)；罗惠兰(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)
关键词：牵张刺激；细胞培养
第三军医大学学报000529
提 要：目的 为进一步探讨细胞机构感受机制，建立一套实用的培养细胞牵张刺激模拟装置。方法 用有机玻璃和可变形膜设计制作一套培养细胞牵张刺激模拟装置，并用同位素标记氨基酸和核苷酸掺入法作初步应用评价。结果 应用自行设计制作的两个模型，对培养细胞进行较强的牵张刺激，发现20%的拉长或12 kPa负压的球面牵张对培养心肌细胞的数量和乳酸脱轻酶释放均无影响；但可显著刺激培养心肌细胞3H-亮氨酸及成纤维细胞3H-TdR的掺入。结论 初步应用说明该装置结构简单实用。
, http://www.100md.com
中图法分类号： R-331 文献标识码： B
文章编号：1000-5404(2000)05-0498-03
Establishment and preliminary application of a strectch device for cell culture
1979年Vanderburg等[1]首次应用弹性基底膜(Elastic substrate)培养骨胳肌细胞获得成功，并证实肌细胞可直接感受静态牵张引起的机械刺激，引起细胞蛋白质合成速率显著增加。90年代初期，Banes等[2]首先建立了一套计算机控制的循环牵张模型，较好地解决了自动控制及力学参数量化难题，但其售价昂贵。我们建立了一套培养细胞牵张刺激装置，初步应用，证明其简单实用，现报告如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 牵张刺激装置的制作
如模式图1、2，制作模型1，模型2。所用材料为有机玻璃，真空橡胶，不锈钢板、管及蝶型螺丝。
1.2 细胞培养
参照Simpson[3]方法进行心肌细胞和成纤维细胞的培养。硅酮膜事先涂上0.25 mg/ml的鼠尾胶原作为粘附基质。
图1 平面牵张模型 图2 球面牵张模型
1.3 牵张实验
使用模型时，先精确测量出静止状态下两夹板间硅酮膜的长度，在按20%牵张拉长[3]。使用模型2时，用三通管一端与不锈钢管连接，一端与水银血压计连接，一端与50 ml注射器连接，反复抽气达到负压12 kPa[2]，使硅酮膜呈半球形均匀伸长20%。
, 百拇医药
1.3.1 乳酸脱氢酶测定 分别在牵张后24、48、72、96 h收集培养上清，按常规生化方法测定乳酸脱氢酶活性。
1.3.2 3H-亮氨酸掺入实验 原代培养第4天的心肌细胞换以无血清DMEM培养24 h后，按1 μCi/ml培养基加入3H-亮氨酸。分别牵张培养24、48、72、96 h后，用0.01 mol/L pH7.4的PBS冲洗去游离同位素，加0.1%胰酶-0.02%EDTA混合消化液使细胞脱离培养膜，PBS洗涤后计数，再用1%SDS破碎细胞，20%三氯醋酸沉淀蛋白，将此混悬液抽滤在玻璃纤维滤膜上，取下膜于80°C 30 min烘干。然后进行液闪测量。
1.3.3 3H-TdR掺入实验 同上述程序测定成纤维细胞制成细胞3H-TdR掺入能力。每时相点重复四次实验。
1.4 统计学处理
, 百拇医药
所有数据均以
±s表示，用t检验作组间显著性检验。
2 结果
2.1 牵张对培养心肌细胞数量和代谢的影响
用涂贴附基质胶原的方法限制细胞生长范围，实验发现相同培养面积，牵张组与对照组比较，不仅心肌细胞数量差异无显著性(2.13×105/ml∶2.12×105/ml)，而且培养上清中乳酸脱氢酶活性差异也不显著，见图3。提示，模拟生理状态的牵张参数对培养心肌细胞无明显损伤。
2.2 牵张刺激对培养心肌细胞形态的影响
硅酮膜涂以鼠尾胶原显著增加细胞贴壁能力，提高接种成活率。非牵张对照组培养的心肌细胞与普通培养瓶培养的形态基本一致即成纤维细胞型，排列方向各异。20%牵张后，顺牵张方向细胞明显被拉长、宽度变窄，同时垂直牵张方向的细胞长度变短、宽度增大。牵张2～3d的细胞排列方向趋向于顺牵张方向生长。
, 百拇医药
图3 牵张刺激对心肌细胞乳酸脱氢酶释放的影响
2.3 心肌细胞3H-亮氨酸掺入变化
20%牵张后，心肌细胞3H-亮氨酸掺入逐渐增多，24、48、72、96 h时点与对照组比较差异均有显著性，见图4，即表明心肌细胞蛋白质合成速率显著提高，提示牵张刺激可快速诱导心肌细胞肥大。
图4 牵张刺激对心肌细胞亮氨酸掺入的影响
**：P<0.01与对照组比较
2.4 成纤维细胞3H-TdR掺入实验
成纤维细胞在受到牵张刺激后，3H-TdR掺入逐渐增多，牵张后24、48、72、96 h3H-TdR掺入率均显著高于对照组，细胞计数也提示牵张刺激能显著诱导成纤维细胞增殖，见图5。
, 百拇医药
图5 牵张刺激对成纤维细胞3H-TdR掺入的影响
*:P<0.05，* *：P<0.01与对照组比较
3 讨论
随着细胞生物力学的发展，人们逐渐发现许多哺乳动物细胞均具有机械感受功能——即将力学刺激转变为细胞内的电化学信号的机制[4]，但目前对于细胞机械感受器或称机械受体的本质了解甚少。90年代以来，国外在模拟装置研究方面有较大进展[2]，但其仪器价格昂贵。
我们参照国外报道自行设计建立了一套培养细胞牵张刺激装置，即可作细胞线性拉长实验，也可作球面牵张。与国外装置比较，该装置结构简单，制作方便，不仅价格低廉，而且操作定量化。初步应用表明，模拟心脏生理情况的20%牵张对培养细胞贴壁及存活均无影响，而且证实这种牵张刺激可显著诱导心肌细胞蛋白质合成(即心肌细胞肥大反应)和成纤维细胞的增殖反应。该装置为一次性静态牵张，若需进一步改为循环牵张，只需加装一个负压发生器和时间控制电路即可达到目的。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600041)
作者简介：冯 兵(1967-)，男，四川省遂宁市人，博士，主治医师，主要从事心肌肥大方面的研究，发表论文20篇。电话：68755114-74603
参考文献：
[1] Vandenburg H H, Kaufman S. In vitro model for stretch-induced hypertrophy of skeletsl muscle[J]. Science,1979,203(4 377):265-268.
[2] Banse A J, Gilbert J, Taylor D, et al. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro[J]. J Cell Sci,1985,75(1):35-42.
[3] Simpson P, McGrath A, Savion S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines[J]. Circ Res,1982,51(6):787-801.
[4] 冯 兵.心肌肥大的细胞外信号机制[J].心血管病学进展，1997，18(1)：24-26.;
收稿日期：1999-06-30；修回日期：2000-03-20, 百拇医药
单位：冯兵(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；何作云(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)；王德文(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)；罗惠兰(第三军医大学附属新桥医院心血管内科，重庆 400037)
关键词：牵张刺激；细胞培养
第三军医大学学报000529
提 要：目的 为进一步探讨细胞机构感受机制，建立一套实用的培养细胞牵张刺激模拟装置。方法 用有机玻璃和可变形膜设计制作一套培养细胞牵张刺激模拟装置，并用同位素标记氨基酸和核苷酸掺入法作初步应用评价。结果 应用自行设计制作的两个模型，对培养细胞进行较强的牵张刺激，发现20%的拉长或12 kPa负压的球面牵张对培养心肌细胞的数量和乳酸脱轻酶释放均无影响；但可显著刺激培养心肌细胞3H-亮氨酸及成纤维细胞3H-TdR的掺入。结论 初步应用说明该装置结构简单实用。
, http://www.100md.com
中图法分类号： R-331 文献标识码： B
文章编号：1000-5404(2000)05-0498-03
Establishment and preliminary application of a strectch device for cell culture
1979年Vanderburg等[1]首次应用弹性基底膜(Elastic substrate)培养骨胳肌细胞获得成功，并证实肌细胞可直接感受静态牵张引起的机械刺激，引起细胞蛋白质合成速率显著增加。90年代初期，Banes等[2]首先建立了一套计算机控制的循环牵张模型，较好地解决了自动控制及力学参数量化难题，但其售价昂贵。我们建立了一套培养细胞牵张刺激装置，初步应用，证明其简单实用，现报告如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 牵张刺激装置的制作
如模式图1、2，制作模型1，模型2。所用材料为有机玻璃，真空橡胶，不锈钢板、管及蝶型螺丝。
1.2 细胞培养
参照Simpson[3]方法进行心肌细胞和成纤维细胞的培养。硅酮膜事先涂上0.25 mg/ml的鼠尾胶原作为粘附基质。
图1 平面牵张模型 图2 球面牵张模型
1.3 牵张实验
使用模型时，先精确测量出静止状态下两夹板间硅酮膜的长度，在按20%牵张拉长[3]。使用模型2时，用三通管一端与不锈钢管连接，一端与水银血压计连接，一端与50 ml注射器连接，反复抽气达到负压12 kPa[2]，使硅酮膜呈半球形均匀伸长20%。
, 百拇医药
1.3.1 乳酸脱氢酶测定 分别在牵张后24、48、72、96 h收集培养上清，按常规生化方法测定乳酸脱氢酶活性。
1.3.2 3H-亮氨酸掺入实验 原代培养第4天的心肌细胞换以无血清DMEM培养24 h后，按1 μCi/ml培养基加入3H-亮氨酸。分别牵张培养24、48、72、96 h后，用0.01 mol/L pH7.4的PBS冲洗去游离同位素，加0.1%胰酶-0.02%EDTA混合消化液使细胞脱离培养膜，PBS洗涤后计数，再用1%SDS破碎细胞，20%三氯醋酸沉淀蛋白，将此混悬液抽滤在玻璃纤维滤膜上，取下膜于80°C 30 min烘干。然后进行液闪测量。
1.3.3 3H-TdR掺入实验 同上述程序测定成纤维细胞制成细胞3H-TdR掺入能力。每时相点重复四次实验。
1.4 统计学处理
, 百拇医药
所有数据均以
±s表示，用t检验作组间显著性检验。2 结果
2.1 牵张对培养心肌细胞数量和代谢的影响
用涂贴附基质胶原的方法限制细胞生长范围，实验发现相同培养面积，牵张组与对照组比较，不仅心肌细胞数量差异无显著性(2.13×105/ml∶2.12×105/ml)，而且培养上清中乳酸脱氢酶活性差异也不显著，见图3。提示，模拟生理状态的牵张参数对培养心肌细胞无明显损伤。
2.2 牵张刺激对培养心肌细胞形态的影响
硅酮膜涂以鼠尾胶原显著增加细胞贴壁能力，提高接种成活率。非牵张对照组培养的心肌细胞与普通培养瓶培养的形态基本一致即成纤维细胞型，排列方向各异。20%牵张后，顺牵张方向细胞明显被拉长、宽度变窄，同时垂直牵张方向的细胞长度变短、宽度增大。牵张2～3d的细胞排列方向趋向于顺牵张方向生长。
, 百拇医药
图3 牵张刺激对心肌细胞乳酸脱氢酶释放的影响
2.3 心肌细胞3H-亮氨酸掺入变化
20%牵张后，心肌细胞3H-亮氨酸掺入逐渐增多，24、48、72、96 h时点与对照组比较差异均有显著性，见图4，即表明心肌细胞蛋白质合成速率显著提高，提示牵张刺激可快速诱导心肌细胞肥大。
图4 牵张刺激对心肌细胞亮氨酸掺入的影响
**：P<0.01与对照组比较
2.4 成纤维细胞3H-TdR掺入实验
成纤维细胞在受到牵张刺激后，3H-TdR掺入逐渐增多，牵张后24、48、72、96 h3H-TdR掺入率均显著高于对照组，细胞计数也提示牵张刺激能显著诱导成纤维细胞增殖，见图5。
, 百拇医药
图5 牵张刺激对成纤维细胞3H-TdR掺入的影响
*:P<0.05，* *：P<0.01与对照组比较
3 讨论
随着细胞生物力学的发展，人们逐渐发现许多哺乳动物细胞均具有机械感受功能——即将力学刺激转变为细胞内的电化学信号的机制[4]，但目前对于细胞机械感受器或称机械受体的本质了解甚少。90年代以来，国外在模拟装置研究方面有较大进展[2]，但其仪器价格昂贵。
我们参照国外报道自行设计建立了一套培养细胞牵张刺激装置，即可作细胞线性拉长实验，也可作球面牵张。与国外装置比较，该装置结构简单，制作方便，不仅价格低廉，而且操作定量化。初步应用表明，模拟心脏生理情况的20%牵张对培养细胞贴壁及存活均无影响，而且证实这种牵张刺激可显著诱导心肌细胞蛋白质合成(即心肌细胞肥大反应)和成纤维细胞的增殖反应。该装置为一次性静态牵张，若需进一步改为循环牵张，只需加装一个负压发生器和时间控制电路即可达到目的。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600041)
作者简介：冯 兵(1967-)，男，四川省遂宁市人，博士，主治医师，主要从事心肌肥大方面的研究，发表论文20篇。电话：68755114-74603
参考文献：
[1] Vandenburg H H, Kaufman S. In vitro model for stretch-induced hypertrophy of skeletsl muscle[J]. Science,1979,203(4 377):265-268.
[2] Banse A J, Gilbert J, Taylor D, et al. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro[J]. J Cell Sci,1985,75(1):35-42.
[3] Simpson P, McGrath A, Savion S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines[J]. Circ Res,1982,51(6):787-801.
[4] 冯 兵.心肌肥大的细胞外信号机制[J].心血管病学进展，1997，18(1)：24-26.;
收稿日期：1999-06-30；修回日期：2000-03-20, 百拇医药