应用于激光扫描共聚焦显微镜的活细胞标本制作方法
作者：徐虹 夏雨
单位：徐虹(汕头大学医学院法医教研室，广东 汕头 515031)；夏雨(汕头大学医学院法医教研室，广东 汕头 515031)
关键词：激光扫描共聚焦显微镜；急性分离神经元；吖啶橙；RNA；DNA
现代诊断与治疗000505 摘要：目的 介绍急性神经元贴壁的简易方法和应用激光扫描 共聚焦显微镜观察药物作用后神经元内核酸代谢的方法。方法 以双重荧 光染料吖啶橙(Acridine orange，AO)进行染色。在36°C孵育箱内孵育15分钟。激光扫描 共聚焦显微镜对染色后的细胞进行光束扫描，以观测细胞内核酸代谢变化的规律。 结果 皮层神经元RNA有显著改变。结论 本方法的建立可以成功 地应用于激光扫描共聚焦显微镜对胞内核酸代谢变化的研究。
中图分类号：Q189 文献标识码：A 文章编号：1001-8174(200 0)05-0266-02
, http://www.100md.com
Method of Developing Live Cell Sample with Laser Scanning Confocal Microscope
XU Hong，XIA Yu
(Department of Forensic Medicine，The Medical C ollege of Shantou University,Shantou 515031,China)
Abstract：Objective To introduce the simple method for acute-separated neuron adhibitting and the method to investigate the alteration of nuclear acid metabolism after drugs action with Laser scanning confocal micr oscope(LSCM).Method The cell was dyed with fluorescent dying AO ,and scanned with LSCM to observe the alteration rule of nuclear acid.Re sults The RNA has significant alteration in morphine depended animals t han that in control group.Conclusion The establishment of this method can be successfully used to study the alteration of nuclear acid with Las er scanning confocal microscope.
, 百拇医药
Key words：Laser scanning confocal microscope;Acute-separated n euron;Acridine Orange;RNA;DNA
一些神经毒性药物，如吗啡、鸦片等可以与神经细胞膜上的 阿片受体结合，从而导致神经元内的核酸代谢发生变化[1]。利用双重染料吖啶橙 (Arcridine orange,AO)在1∶500与1∶10000之间可以对活细胞内RNA和DNA进行双重染色 ，并使RNA发出橘黄色荧光，DNA发出绿色荧光的特性[2]，结合激光扫描共聚焦显 微镜(Laser scanning confocal microscope,LSCM)对细胞进行非创伤性扫描的特点，可以 观察药物作用后神经元核酸代谢变化的规 律，从而实现了亚细胞水平观察细胞内物质代谢的变化[3]。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验动物 新生SD大鼠，体重9～10克，雌雄不拘，由汕头大学医学院实验动 物中心提供。
1.2 药品与试剂 (1)盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂，批号：941103)；(2)吖啶橙(Sigm a公司)配成1∶100的溶液。
1.3 仪器 ACAS-Ultima-312型激光扫描共聚焦显微镜系统(Meridian Inc.美国)。
1.4 方法
1.4.1 吗啡依赖动物模型的建立[4] 实验动物从出生后第12小时起于背部皮下 注射吗啡，剂量由5mg/(kg.d)逐日递增至25mg/(kg.d)，tid，连续注射5天，使其成瘾， 以后给予维持剂量25mg/kg，对照动物在此期间给予相等剂量的生理盐水。
, 百拇医药
1.4.2 急性分离神经元的制备 以小脑皮层为例，在末次注射维持量吗啡后1小时，将动物 快速断头处死，取出小脑分离出小脑皮层，用刀片切碎，放入一10ml的离心管中，加入2ml 无Ca2+的人工脑脊液(ACSF)，放入36℃孵育箱孵育1小时后，人工脑脊液漂洗2～3 次，洗去血迹和杂质。将脑组织移入2ml含0.25%胰蛋白酶的人工脑脊液中，通以含95%O2 和5%CO2的混合气，在36℃恒温水浴中消化15分钟后，用含有Ca2+的人工脑脊液反 复冲洗，直至胰蛋白酶灭活。然后用口径500μm、300μm、150μm的钝口玻璃管轻轻吹打组 织块，直至成为云雾状细胞悬液。将细胞悬液静置20分钟后，取中上部悬液2～3滴滴于涂有 明胶的Petri培养皿中，培养皿中央有一容积100μl小池。培养皿经过10%的新洁尔灭溶液 浸泡过夜后经蒸馏水冲洗、烘干，滴3%的明胶于小池底部，干燥后备用。
1.4.3 神经元的吖啶橙(AO)负载 取1μl 1%的AO滴于小池中，使其终浓度达到1∶10000 ，放入36℃的培养箱孵育15分钟后，用ACSF冲洗2～3次，洗去多余的染料。使小池内保持湿 润状态。将培养皿置于激光扫描共聚焦显微镜下。
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1.4.4 激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行扫描 先用倒置显微镜40×物镜找到细胞层 面，使其处于最清晰的位置。选择波长为488nm的蓝光作为激发光进行光束扫描，每1μm扫 一次，共扫描30次，以获得全细胞图像。将所扫描的图像存于计算机内，分析采用本系统自 带的分析软件进行数据处理和三维构建。
2 结果
用AO标记的细胞激光扫描共聚焦显微镜扫描所得的细胞外形与倒置显微镜下所见相 符合。由于方法的改进，每次实验从细胞样品处理到实验数据收集可以由原来的2～3小时 [5]大大的延长，并且保持细胞处于存活状态，从而使实验结果精确可靠。本实验观 察到：吗啡成瘾动物的小脑皮层神经元与对照组动物相比较，可以直观的看到RNA合成显著 增多。
3 讨论
吗啡可以与神经元上的三种阿片受体[1]呈非特异性结合，从而可以导致 细胞核酸代谢发生变化。激光共聚焦显微镜技术与荧光探针技术结合可以使单一细胞核酸变 化的观测更为直观、快速、简便。该仪器是在荧光显微镜成像的基础上，加强了激光扫描装 置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光和可见光作为激发光源，可以得到细胞或组织内 部细微激光的荧光图像。激光扫描共聚焦显微镜是近代生物医学图像仪器的最重要发展之一 ，它具有高灵敏度和能够观察空间结构的独特优点[6]。本实验采用的扫描方式为 光束扫描，即保持细胞固定，激光光束作扫描式移动。由于沿Z-轴扫描获得的细胞连续“ 光学切片”图像及重组的细胞三维图像要求扫描过程中细胞固定在同一位置上，因此必须对 急性分离细胞进行贴壁处理后，才能用激光扫描共聚焦显微镜技术进行扫描。
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本实验在本院中心实验室的方法上[5]做了较大的改进：(1)细胞悬液直接滴于培养 皿上，贴壁后，以AO染色，大大增加了染色面积，而且液体不易干燥且直接与空气相接触， 缩短染色时间。(2)利用AO在1∶500至1∶10000之间可以对活组织细胞进行染色的特点，此 方法的运用便于估算AO的浓度，以及所加药物的终浓度。(3)染色后的细胞，可用不同的试 剂处理；也试用于检测其他荧光染料染色的其他细胞代谢的变化。(4)尽管是非培养细胞， 而且是人为的使其固定，但其固定很好，对于进行细胞代谢的动态分析，加入5～10μl诱导 试剂，不致使其受到冲击而浮动。实验观察到细胞固定好，完全可用于激光的断层扫描，重 组图像效果好。整个实验过程中细胞固定在同一位置上，可以具体反映单个细胞内的生理代 谢变化。本实验由扫描所得的图像可以清晰直观的看到吗啡成瘾动物的小脑皮层神经元的RN A水平显著高于对照动物。本方法的建立有着较为广泛的用途，它可用于临床上不同药物、 毒物对脑作用部位的筛选，用此方法可检测吗啡成瘾及戒断状态动物的受累脑区，为临床研 究与基础研究开创了新的实验方法。
, 百拇医药
(吴 旻院士审)
作者简介：徐 虹(1970-)，女，四川省人，1999年获汕头 大学医学院病理与病理生理学硕士学位。现为该院法医病理学博士。主要从事颅脑外伤的研 究。
参考文献：
[1]范少光，汤 浩，张 衡.人体生理学[M].北京：北京医科大 学与中国协和医科大学联合出版社，1996.217-292.
[2]杨景山.医用细胞化学与细胞生物技术[M].北京：北京医科大学与中国 协和医科大学联合出版社，1990.119-120.
[3]李 楠，尹 岭，苏振伦.激光扫描共聚焦显微术[M].北京：人民军医 出版社.1997.5-12.
[4]Baeyens JM.Effects of peripheral and central administration of calc ium channel blockers in naloxoneprocipitated abstinence syndrome in morphine-de pendent rats[J].Eur J Pharmacol,1987,137:9-13.
[5]林珏珑，陈耀文.非培养细胞的贴壁方法及细胞内Ca2+观测[J]. 激光生物学报，1998，7(3)：220-222.
[6]陈耀文，林珏珑，赖效莹，等.激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学 中的作用[J].激光生物学报，1998，7(2)：131-134.
收稿日期：2000-02-15
修回日期：2000-03-21, http://www.100md.com
单位：徐虹(汕头大学医学院法医教研室，广东 汕头 515031)；夏雨(汕头大学医学院法医教研室，广东 汕头 515031)
关键词：激光扫描共聚焦显微镜；急性分离神经元；吖啶橙；RNA；DNA
现代诊断与治疗000505 摘要：目的 介绍急性神经元贴壁的简易方法和应用激光扫描 共聚焦显微镜观察药物作用后神经元内核酸代谢的方法。方法 以双重荧 光染料吖啶橙(Acridine orange，AO)进行染色。在36°C孵育箱内孵育15分钟。激光扫描 共聚焦显微镜对染色后的细胞进行光束扫描，以观测细胞内核酸代谢变化的规律。 结果 皮层神经元RNA有显著改变。结论 本方法的建立可以成功 地应用于激光扫描共聚焦显微镜对胞内核酸代谢变化的研究。
中图分类号：Q189 文献标识码：A 文章编号：1001-8174(200 0)05-0266-02
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Method of Developing Live Cell Sample with Laser Scanning Confocal Microscope
XU Hong，XIA Yu
(Department of Forensic Medicine，The Medical C ollege of Shantou University,Shantou 515031,China)
Abstract：Objective To introduce the simple method for acute-separated neuron adhibitting and the method to investigate the alteration of nuclear acid metabolism after drugs action with Laser scanning confocal micr oscope(LSCM).Method The cell was dyed with fluorescent dying AO ,and scanned with LSCM to observe the alteration rule of nuclear acid.Re sults The RNA has significant alteration in morphine depended animals t han that in control group.Conclusion The establishment of this method can be successfully used to study the alteration of nuclear acid with Las er scanning confocal microscope.
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Key words：Laser scanning confocal microscope;Acute-separated n euron;Acridine Orange;RNA;DNA
一些神经毒性药物，如吗啡、鸦片等可以与神经细胞膜上的 阿片受体结合，从而导致神经元内的核酸代谢发生变化[1]。利用双重染料吖啶橙 (Arcridine orange,AO)在1∶500与1∶10000之间可以对活细胞内RNA和DNA进行双重染色 ，并使RNA发出橘黄色荧光，DNA发出绿色荧光的特性[2]，结合激光扫描共聚焦显 微镜(Laser scanning confocal microscope,LSCM)对细胞进行非创伤性扫描的特点，可以 观察药物作用后神经元核酸代谢变化的规 律，从而实现了亚细胞水平观察细胞内物质代谢的变化[3]。
1 材料与方法
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1.1 实验动物 新生SD大鼠，体重9～10克，雌雄不拘，由汕头大学医学院实验动 物中心提供。
1.2 药品与试剂 (1)盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂，批号：941103)；(2)吖啶橙(Sigm a公司)配成1∶100的溶液。
1.3 仪器 ACAS-Ultima-312型激光扫描共聚焦显微镜系统(Meridian Inc.美国)。
1.4 方法
1.4.1 吗啡依赖动物模型的建立[4] 实验动物从出生后第12小时起于背部皮下 注射吗啡，剂量由5mg/(kg.d)逐日递增至25mg/(kg.d)，tid，连续注射5天，使其成瘾， 以后给予维持剂量25mg/kg，对照动物在此期间给予相等剂量的生理盐水。
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1.4.2 急性分离神经元的制备 以小脑皮层为例，在末次注射维持量吗啡后1小时，将动物 快速断头处死，取出小脑分离出小脑皮层，用刀片切碎，放入一10ml的离心管中，加入2ml 无Ca2+的人工脑脊液(ACSF)，放入36℃孵育箱孵育1小时后，人工脑脊液漂洗2～3 次，洗去血迹和杂质。将脑组织移入2ml含0.25%胰蛋白酶的人工脑脊液中，通以含95%O2 和5%CO2的混合气，在36℃恒温水浴中消化15分钟后，用含有Ca2+的人工脑脊液反 复冲洗，直至胰蛋白酶灭活。然后用口径500μm、300μm、150μm的钝口玻璃管轻轻吹打组 织块，直至成为云雾状细胞悬液。将细胞悬液静置20分钟后，取中上部悬液2～3滴滴于涂有 明胶的Petri培养皿中，培养皿中央有一容积100μl小池。培养皿经过10%的新洁尔灭溶液 浸泡过夜后经蒸馏水冲洗、烘干，滴3%的明胶于小池底部，干燥后备用。
1.4.3 神经元的吖啶橙(AO)负载 取1μl 1%的AO滴于小池中，使其终浓度达到1∶10000 ，放入36℃的培养箱孵育15分钟后，用ACSF冲洗2～3次，洗去多余的染料。使小池内保持湿 润状态。将培养皿置于激光扫描共聚焦显微镜下。
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1.4.4 激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行扫描 先用倒置显微镜40×物镜找到细胞层 面，使其处于最清晰的位置。选择波长为488nm的蓝光作为激发光进行光束扫描，每1μm扫 一次，共扫描30次，以获得全细胞图像。将所扫描的图像存于计算机内，分析采用本系统自 带的分析软件进行数据处理和三维构建。
2 结果
用AO标记的细胞激光扫描共聚焦显微镜扫描所得的细胞外形与倒置显微镜下所见相 符合。由于方法的改进，每次实验从细胞样品处理到实验数据收集可以由原来的2～3小时 [5]大大的延长，并且保持细胞处于存活状态，从而使实验结果精确可靠。本实验观 察到：吗啡成瘾动物的小脑皮层神经元与对照组动物相比较，可以直观的看到RNA合成显著 增多。
3 讨论
吗啡可以与神经元上的三种阿片受体[1]呈非特异性结合，从而可以导致 细胞核酸代谢发生变化。激光共聚焦显微镜技术与荧光探针技术结合可以使单一细胞核酸变 化的观测更为直观、快速、简便。该仪器是在荧光显微镜成像的基础上，加强了激光扫描装 置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光和可见光作为激发光源，可以得到细胞或组织内 部细微激光的荧光图像。激光扫描共聚焦显微镜是近代生物医学图像仪器的最重要发展之一 ，它具有高灵敏度和能够观察空间结构的独特优点[6]。本实验采用的扫描方式为 光束扫描，即保持细胞固定，激光光束作扫描式移动。由于沿Z-轴扫描获得的细胞连续“ 光学切片”图像及重组的细胞三维图像要求扫描过程中细胞固定在同一位置上，因此必须对 急性分离细胞进行贴壁处理后，才能用激光扫描共聚焦显微镜技术进行扫描。
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本实验在本院中心实验室的方法上[5]做了较大的改进：(1)细胞悬液直接滴于培养 皿上，贴壁后，以AO染色，大大增加了染色面积，而且液体不易干燥且直接与空气相接触， 缩短染色时间。(2)利用AO在1∶500至1∶10000之间可以对活组织细胞进行染色的特点，此 方法的运用便于估算AO的浓度，以及所加药物的终浓度。(3)染色后的细胞，可用不同的试 剂处理；也试用于检测其他荧光染料染色的其他细胞代谢的变化。(4)尽管是非培养细胞， 而且是人为的使其固定，但其固定很好，对于进行细胞代谢的动态分析，加入5～10μl诱导 试剂，不致使其受到冲击而浮动。实验观察到细胞固定好，完全可用于激光的断层扫描，重 组图像效果好。整个实验过程中细胞固定在同一位置上，可以具体反映单个细胞内的生理代 谢变化。本实验由扫描所得的图像可以清晰直观的看到吗啡成瘾动物的小脑皮层神经元的RN A水平显著高于对照动物。本方法的建立有着较为广泛的用途，它可用于临床上不同药物、 毒物对脑作用部位的筛选，用此方法可检测吗啡成瘾及戒断状态动物的受累脑区，为临床研 究与基础研究开创了新的实验方法。
, 百拇医药
(吴 旻院士审)
作者简介：徐 虹(1970-)，女，四川省人，1999年获汕头 大学医学院病理与病理生理学硕士学位。现为该院法医病理学博士。主要从事颅脑外伤的研 究。
参考文献：
[1]范少光，汤 浩，张 衡.人体生理学[M].北京：北京医科大 学与中国协和医科大学联合出版社，1996.217-292.
[2]杨景山.医用细胞化学与细胞生物技术[M].北京：北京医科大学与中国 协和医科大学联合出版社，1990.119-120.
[3]李 楠，尹 岭，苏振伦.激光扫描共聚焦显微术[M].北京：人民军医 出版社.1997.5-12.
[4]Baeyens JM.Effects of peripheral and central administration of calc ium channel blockers in naloxoneprocipitated abstinence syndrome in morphine-de pendent rats[J].Eur J Pharmacol,1987,137:9-13.
[5]林珏珑，陈耀文.非培养细胞的贴壁方法及细胞内Ca2+观测[J]. 激光生物学报，1998，7(3)：220-222.
[6]陈耀文，林珏珑，赖效莹，等.激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学 中的作用[J].激光生物学报，1998，7(2)：131-134.
收稿日期：2000-02-15
修回日期：2000-03-21, http://www.100md.com