血小板自身抗体的流式细胞仪检测与意义
作者：韩悦 王兆钺 朱明清 王爱青 张威 阮长耿
单位：韩悦(苏州医学院附属第一医院 江苏省血 液病研究所 江苏苏州，215006)；王兆钺(苏州医学院附属第一医院 江苏省血 液病研究所 江苏苏州，215006)；朱明清(苏州医学院重点实验室)；王爱青(苏州医学院重点实验室)；张威(苏州医学院附属第一医院 江苏省血 液病研究所 江苏苏州，215006)；阮长耿(苏州医学院附属第一医院 江苏省血 液病研究所 江苏苏州，215006)(苏州医学院重点实验室)
关键词：紫癜；血小板减少性；特发性 血小板；自身抗体；流式细胞术；酶联免疫吸附试验
临床血液学杂志000511 摘要 目的：应用流式细胞术(FCM)测定血小板自身抗体P AIgG，研究其对特发性血小板减少性紫癜(ITP)诊断的意义。方法：应用FCM检测20例ITP患者血小板膜表面及血浆中的抗血小板抗体， 并与ELISA所测结果进行比较。结果：FCM测得14例(70%)ITP患者血小板膜自身抗体PAIgG阳性，9例(45 %)血浆抗血小板抗体阳性。ELISA显示12例(60%)患者PAIgG阳性，7例(35%)血浆抗血小 板抗体阳性。FCM所测结果阳性率稍高于ELISA。结论：FCM可成为血小板自身抗体检测的一项新的快速简便的方法，与ELI SA等方法同时应用可进一步提高ITP患者抗血小板抗体检测的阳性率与可靠性。
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Flowcytometry study of platelet associated antibody
in patient s with idiopathic thrombocytopenic pupura
HAN Yue WANG Zhao-yue ZHA NG Wei RUAN Chang-gen
(Jiangsu Institute of Hematology,the First Affiliated Hospi tal of
Suzhou Medical College,Suzhou,215006)
ZHU Ming-qing WANG Ai-qing RUAN Chang-gen
, 百拇医药
(The Suzhou Medical College Key Laboratory of Nuclear Medicine and Bi ological)
Abstract Objective:Set up a method of measuring plate let associated antibody PAIgG by flowcytometry and investigate its significance in the diagnosis of idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP). Method:With flowcytometry, PAIgG on the platelet membrane and in plasma were measured in 20 patients with ITP, which were compared with th e result of ELISA.Result:By flowcytometry, the PAIgG on platelet membrane wa s positive in 14 ITP cases(70%), but in plasma, the PAIgG was positive in 9 case s(45%).The samples of theses patients were also measured with ELISA, which idica ted positive platelet PAIgG in 12 cases (60%)and positive plasma PAIgG positive in 7 cases(35%). Compared with the results of ELISA, the positive percentage of PAIgG measured by FCM in ITP patients seems higher. Conclusion:FCM can be used as a new, rapid and simple meth od in detecting platelet autoantibody. FCM, in combination with ELISA, would imp rove the reliability and the positive percentage of PAIgG measurement in ITP pat ients.
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Key words Purpura,thrombocytopenic,idiopathic Blood plat elets Autoantibodies Flow cytometry Enzyme linked immunosorbent assay
特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种免疫性疾病，患者体 内产生抗血小板自身抗体与血小板抗原结合，导致血小板迅速从循环中清除。检测血小板自 身抗体已成为ITP诊断的一个重要指标。人们已建立了各种抗血小板抗体的检测方法〔 1〕，即以直接法测定血小板结合的Ig，或用间接法测定血浆中能与正常人血小板结合的I g，其中ELISA是最常用的检查方法。流式细胞术(FCM)是一种单细胞定量分析的新技术， 具有快速、灵敏的特点，已广泛应用于基础医学与临床研究。90年代以来，国外开始将FCM 用于ITP自身抗体的研究〔2，3〕。最近，我们建立了ITP自身抗体FCM检测方法，并 与ELISA方法对比，研究其对ITP诊断的价值和意义。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 研究对象
20例ITP患者均为本院初诊患者，诊断符合
1986年全国血栓止血会议制定的标准，其中男6例，女14例，年龄20～62岁(中位年龄33岁) ，均未用过激素、免疫抑制剂及脾切除术等治疗。正常对照组为20例健康志愿者，性别和年 龄与患者匹配。
1.2 标本制备
采肘静脉血，以EDTA(Na2)抗凝用200 g离心力离心8 min，上层富血小板血浆(PRP )以TEN洗涤2次，余血以800 g离心力离心15 min，分离取血浆。
1.3 检测方法
FCM直接法检测血小板表面抗体：按Macchi等〔4〕方法改进。洗涤血小板以0.01 mol/L PBS悬浮，调整血小板浓度至200×109/L,每管50 μl细胞悬液中分别加等量FITC -羊抗鼠IgG及FITC-羊抗人IgG(上海华美生物公司产品)稀释液，温育30 min，以TEN洗 涤2遍后再加入1 ml PBS重悬。采用EPICS-XL型FCM(Coulter公司产品)，选择488 nm波长 的氦氖激发光，根据前向角散射与侧向角散射设定血小板门，测定5 000～10 000个血小板的 荧光阳性百分率及平均荧光强度(MFI)。
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FCM间接法检测血浆中血小板自身抗体：按Stockelberg等〔5〕方法改进。用PBS将O 型健康者洗涤血小板调至200×109/L，每管100 μl与等量血浆标本在37 ℃孵育2 h，用T EN洗涤2遍后，用100 μl PBS悬浮，等分后分别加入FITC-羊抗鼠IgG及FITC-羊抗人IgG， 温育30 min，洗涤，加PBS悬浮，用FCM测定。
ELISA直接法测定血小板相关IgG：参照文献〔2〕的方法，调整洗涤血小板浓度100× 109/L，以Triton-X100(终浓度1%)4℃破碎离心，将上清液1∶10备用。以羊抗人IgG包 板，封闭后加入血小板稀释破碎液反应，再加入E-羊抗人IgG，洗涤后用OPD显色，490 nm 处测定吸光度(A)值。
ELISA间接法测定血浆中抗血小板自身抗体：参照文献〔6〕的方法，以O型健康者洗 涤血小板(10×105/孔)包板，用30 g/L白蛋白封闭，再加1∶10稀释的血浆标本温育， 加E-羊抗人IgG，洗涤后用OPD显色，490 nm处测定A值。
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1.4 统计学处理
正常对照组结果以
±s表示，以>+2s定为阳性值。不同方法的 阳性率进行χ2检验。
2 结果
FCM检测血小板自身抗体PAIgG：正常对照组的：直接法和间接法的MFI分别为0. 56±0.16和0.73±0.11，荧光百分率分别为(20.63±5.10)%和(3 5.58±7.40)%。本文20例ITP患者中，FCM直接法14例(70%)阳性，间接法9例(45%) 阳性。
ELISA检测血小板自身抗体PAIgG：正常对照组的；直接法和间接法A值分别为0.147 ±0.038和0.134±0.037。本文20例ITP患者中，直接法PAIgG阳性12例(60%) ，而间接法PAIgG阳性7例(35%)。FCM法结果与ELISA法相比无显著性差异(P>0.05 )，但检测阳性率有增高趋势。同样直接法检测结果与间接法也无显著性差异(P>0. 05)，但检测率增高。直接法中，ELISA检测阳性，12例其中FCM检测阳性11例；FCM检测 阳性14例，其中ELISA11例阳性；而间接法中，ELISA检测阳性者，FCM检测均为阳性，FCM检 测9例阳性者中，ELISA检测7例阳性。
, 百拇医药
3 讨论
ITP是一种自身免疫性疾病，系由循环中血小板自身抗体作用于血小板抗原造成血小板破坏 所致〔7〕。其中一部分抗体针对血小板表面多种抗原抑制血小板功能，使出血严重 ；一部分能活化血小板，加剧血小板的减少〔8〕。人们已建立了各种方法检测患者 血小板上及血浆中的抗血小板抗体，这对ITP诊断及监测病情演变有重要的参考价值。但临 床上实用并已普遍开展的只有ELISA等测定方法。但这些方法缺点较多，如操作复杂、费时 或特异性低等。
FCM是近年来发展起来的一项新技术，具有快速、灵敏的特点，已广泛应用于免疫学、血液 学等多学科领域。国外从90年代开始用于ITP 研究，但国内尚未开展此项工作。本研究应用 FCM和ELISA 监测20例ITP患者血小板及血浆中PAIgG，发现两种方法的结果符合率高，说明F CM检测结果可靠。FCM阳性率较高，可能比ELISA更敏感。
, 百拇医药
一般而言，间接法检测率较直接法低，这是由于大多数患者血浆中抗体浓度很低的缘故。本 研究用FCM检测阳性率达45%，表明FCM有相当高的价值。
FCM简易、快速、敏感，是ITP自身抗体检测的一个临床实用方法，与ELISA合用可进一步提 高阳性率与准确性。但与ELISA方法一样，需要改进检测方法，提高检测的特异性。
(编辑 王冬英)
参考文献
1，Mcmillan R. Clinical role of antiplatelet antibody assays. Sem Thromb Haemost，1995,21:37～45
2，Lin R Y,Levin M,Nygren E N,et al. Assessment of platelet antibody by f low cytometric and ELISA technique: A comparison study. J Lab Med, 1990, 116: 47 9～486
, 百拇医药
3，Latorraca A, Lanza F, Morettis S, et al. Flow cytometric analysis of a nti-platelet antibodies in idiopathic thrombocytopenic purpura. Haematologica, 1994,79:269～272
4，Macchi L, Clofent-Sanchez G, Marit G, et al. PAICA: a method for char acterizing platelet-associated antibodies- its application to the study of id iopathic thrombocytopenic purpura and to the dectection of platelet-bound c7E3. Thromb Haemost,1996,76:1020～1029
, 百拇医药 5，Stockelberg D, Hou M, Jacobsson S, et al. Detection of platelet antibo bies in hronic idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP): A comparative study usi ng flow cytometry a whole platelet ELISA, and an antigen capture ELISA. Eur J Ha ematol,1996,56:72～77
6，Schiffer C A, Young V. Detection of platelet antibodies using a micro-enzyme -linked immunosorbent assay (ELISA). Blood, 1983,61:311～317
7，阮长耿主编. 血栓与止血--现代理论与临床实践. 南京:江苏科技出版社,1994.179～2 29
8，Deckmyn H, Reys S D. Functional effects of human antiplatelet antibodies. Sem in Thromb Hemost,1995,21:46～59
(收稿 1999-10-15), 百拇医药
单位：韩悦(苏州医学院附属第一医院 江苏省血 液病研究所 江苏苏州，215006)；王兆钺(苏州医学院附属第一医院 江苏省血 液病研究所 江苏苏州，215006)；朱明清(苏州医学院重点实验室)；王爱青(苏州医学院重点实验室)；张威(苏州医学院附属第一医院 江苏省血 液病研究所 江苏苏州，215006)；阮长耿(苏州医学院附属第一医院 江苏省血 液病研究所 江苏苏州，215006)(苏州医学院重点实验室)
关键词：紫癜；血小板减少性；特发性 血小板；自身抗体；流式细胞术；酶联免疫吸附试验
临床血液学杂志000511 摘要 目的：应用流式细胞术(FCM)测定血小板自身抗体P AIgG，研究其对特发性血小板减少性紫癜(ITP)诊断的意义。方法：应用FCM检测20例ITP患者血小板膜表面及血浆中的抗血小板抗体， 并与ELISA所测结果进行比较。结果：FCM测得14例(70%)ITP患者血小板膜自身抗体PAIgG阳性，9例(45 %)血浆抗血小板抗体阳性。ELISA显示12例(60%)患者PAIgG阳性，7例(35%)血浆抗血小 板抗体阳性。FCM所测结果阳性率稍高于ELISA。结论：FCM可成为血小板自身抗体检测的一项新的快速简便的方法，与ELI SA等方法同时应用可进一步提高ITP患者抗血小板抗体检测的阳性率与可靠性。
, http://www.100md.com
Flowcytometry study of platelet associated antibody
in patient s with idiopathic thrombocytopenic pupura
HAN Yue WANG Zhao-yue ZHA NG Wei RUAN Chang-gen
(Jiangsu Institute of Hematology,the First Affiliated Hospi tal of
Suzhou Medical College,Suzhou,215006)
ZHU Ming-qing WANG Ai-qing RUAN Chang-gen
, 百拇医药
(The Suzhou Medical College Key Laboratory of Nuclear Medicine and Bi ological)
Abstract Objective:Set up a method of measuring plate let associated antibody PAIgG by flowcytometry and investigate its significance in the diagnosis of idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP). Method:With flowcytometry, PAIgG on the platelet membrane and in plasma were measured in 20 patients with ITP, which were compared with th e result of ELISA.Result:By flowcytometry, the PAIgG on platelet membrane wa s positive in 14 ITP cases(70%), but in plasma, the PAIgG was positive in 9 case s(45%).The samples of theses patients were also measured with ELISA, which idica ted positive platelet PAIgG in 12 cases (60%)and positive plasma PAIgG positive in 7 cases(35%). Compared with the results of ELISA, the positive percentage of PAIgG measured by FCM in ITP patients seems higher. Conclusion:FCM can be used as a new, rapid and simple meth od in detecting platelet autoantibody. FCM, in combination with ELISA, would imp rove the reliability and the positive percentage of PAIgG measurement in ITP pat ients.
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Key words Purpura,thrombocytopenic,idiopathic Blood plat elets Autoantibodies Flow cytometry Enzyme linked immunosorbent assay
特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种免疫性疾病，患者体 内产生抗血小板自身抗体与血小板抗原结合，导致血小板迅速从循环中清除。检测血小板自 身抗体已成为ITP诊断的一个重要指标。人们已建立了各种抗血小板抗体的检测方法〔 1〕，即以直接法测定血小板结合的Ig，或用间接法测定血浆中能与正常人血小板结合的I g，其中ELISA是最常用的检查方法。流式细胞术(FCM)是一种单细胞定量分析的新技术， 具有快速、灵敏的特点，已广泛应用于基础医学与临床研究。90年代以来，国外开始将FCM 用于ITP自身抗体的研究〔2，3〕。最近，我们建立了ITP自身抗体FCM检测方法，并 与ELISA方法对比，研究其对ITP诊断的价值和意义。
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1 资料与方法
1.1 研究对象
20例ITP患者均为本院初诊患者，诊断符合
1986年全国血栓止血会议制定的标准，其中男6例，女14例，年龄20～62岁(中位年龄33岁) ，均未用过激素、免疫抑制剂及脾切除术等治疗。正常对照组为20例健康志愿者，性别和年 龄与患者匹配。
1.2 标本制备
采肘静脉血，以EDTA(Na2)抗凝用200 g离心力离心8 min，上层富血小板血浆(PRP )以TEN洗涤2次，余血以800 g离心力离心15 min，分离取血浆。
1.3 检测方法
FCM直接法检测血小板表面抗体：按Macchi等〔4〕方法改进。洗涤血小板以0.01 mol/L PBS悬浮，调整血小板浓度至200×109/L,每管50 μl细胞悬液中分别加等量FITC -羊抗鼠IgG及FITC-羊抗人IgG(上海华美生物公司产品)稀释液，温育30 min，以TEN洗 涤2遍后再加入1 ml PBS重悬。采用EPICS-XL型FCM(Coulter公司产品)，选择488 nm波长 的氦氖激发光，根据前向角散射与侧向角散射设定血小板门，测定5 000～10 000个血小板的 荧光阳性百分率及平均荧光强度(MFI)。
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FCM间接法检测血浆中血小板自身抗体：按Stockelberg等〔5〕方法改进。用PBS将O 型健康者洗涤血小板调至200×109/L，每管100 μl与等量血浆标本在37 ℃孵育2 h，用T EN洗涤2遍后，用100 μl PBS悬浮，等分后分别加入FITC-羊抗鼠IgG及FITC-羊抗人IgG， 温育30 min，洗涤，加PBS悬浮，用FCM测定。
ELISA直接法测定血小板相关IgG：参照文献〔2〕的方法，调整洗涤血小板浓度100× 109/L，以Triton-X100(终浓度1%)4℃破碎离心，将上清液1∶10备用。以羊抗人IgG包 板，封闭后加入血小板稀释破碎液反应，再加入E-羊抗人IgG，洗涤后用OPD显色，490 nm 处测定吸光度(A)值。
ELISA间接法测定血浆中抗血小板自身抗体：参照文献〔6〕的方法，以O型健康者洗 涤血小板(10×105/孔)包板，用30 g/L白蛋白封闭，再加1∶10稀释的血浆标本温育， 加E-羊抗人IgG，洗涤后用OPD显色，490 nm处测定A值。
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1.4 统计学处理
正常对照组结果以
±s表示，以>+2s定为阳性值。不同方法的 阳性率进行χ2检验。2 结果
FCM检测血小板自身抗体PAIgG：正常对照组的：直接法和间接法的MFI分别为0. 56±0.16和0.73±0.11，荧光百分率分别为(20.63±5.10)%和(3 5.58±7.40)%。本文20例ITP患者中，FCM直接法14例(70%)阳性，间接法9例(45%) 阳性。
ELISA检测血小板自身抗体PAIgG：正常对照组的；直接法和间接法A值分别为0.147 ±0.038和0.134±0.037。本文20例ITP患者中，直接法PAIgG阳性12例(60%) ，而间接法PAIgG阳性7例(35%)。FCM法结果与ELISA法相比无显著性差异(P>0.05 )，但检测阳性率有增高趋势。同样直接法检测结果与间接法也无显著性差异(P>0. 05)，但检测率增高。直接法中，ELISA检测阳性，12例其中FCM检测阳性11例；FCM检测 阳性14例，其中ELISA11例阳性；而间接法中，ELISA检测阳性者，FCM检测均为阳性，FCM检 测9例阳性者中，ELISA检测7例阳性。
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3 讨论
ITP是一种自身免疫性疾病，系由循环中血小板自身抗体作用于血小板抗原造成血小板破坏 所致〔7〕。其中一部分抗体针对血小板表面多种抗原抑制血小板功能，使出血严重 ；一部分能活化血小板，加剧血小板的减少〔8〕。人们已建立了各种方法检测患者 血小板上及血浆中的抗血小板抗体，这对ITP诊断及监测病情演变有重要的参考价值。但临 床上实用并已普遍开展的只有ELISA等测定方法。但这些方法缺点较多，如操作复杂、费时 或特异性低等。
FCM是近年来发展起来的一项新技术，具有快速、灵敏的特点，已广泛应用于免疫学、血液 学等多学科领域。国外从90年代开始用于ITP 研究，但国内尚未开展此项工作。本研究应用 FCM和ELISA 监测20例ITP患者血小板及血浆中PAIgG，发现两种方法的结果符合率高，说明F CM检测结果可靠。FCM阳性率较高，可能比ELISA更敏感。
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一般而言，间接法检测率较直接法低，这是由于大多数患者血浆中抗体浓度很低的缘故。本 研究用FCM检测阳性率达45%，表明FCM有相当高的价值。
FCM简易、快速、敏感，是ITP自身抗体检测的一个临床实用方法，与ELISA合用可进一步提 高阳性率与准确性。但与ELISA方法一样，需要改进检测方法，提高检测的特异性。
(编辑 王冬英)
参考文献
1，Mcmillan R. Clinical role of antiplatelet antibody assays. Sem Thromb Haemost，1995,21:37～45
2，Lin R Y,Levin M,Nygren E N,et al. Assessment of platelet antibody by f low cytometric and ELISA technique: A comparison study. J Lab Med, 1990, 116: 47 9～486
, 百拇医药
3，Latorraca A, Lanza F, Morettis S, et al. Flow cytometric analysis of a nti-platelet antibodies in idiopathic thrombocytopenic purpura. Haematologica, 1994,79:269～272
4，Macchi L, Clofent-Sanchez G, Marit G, et al. PAICA: a method for char acterizing platelet-associated antibodies- its application to the study of id iopathic thrombocytopenic purpura and to the dectection of platelet-bound c7E3. Thromb Haemost,1996,76:1020～1029
, 百拇医药 5，Stockelberg D, Hou M, Jacobsson S, et al. Detection of platelet antibo bies in hronic idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP): A comparative study usi ng flow cytometry a whole platelet ELISA, and an antigen capture ELISA. Eur J Ha ematol,1996,56:72～77
6，Schiffer C A, Young V. Detection of platelet antibodies using a micro-enzyme -linked immunosorbent assay (ELISA). Blood, 1983,61:311～317
7，阮长耿主编. 血栓与止血--现代理论与临床实践. 南京:江苏科技出版社,1994.179～2 29
8，Deckmyn H, Reys S D. Functional effects of human antiplatelet antibodies. Sem in Thromb Hemost,1995,21:46～59
(收稿 1999-10-15), 百拇医药