从高温高压蒸煮过的中华鳖甲和骨骼中提取及扩增DNA
作者：刘中权 王义权 周开亚
单位：南京师范大学遗传资源研究所 210097
关键词：中华鳖甲和骨骼；DNA提取；PCR扩增
中草药000512摘 要 为验证经高温加工过的鳖甲是否可以用DNA分子标记鉴定，选取经高温高压蒸煮过的中华鳖鳖甲和骨进行DNA提取，并用通用引物L1091和H1478扩增。结果表明经高温高压蒸煮过的鳖甲也可以提得较高质量的DNA，与从肌肉和药材鳖甲中提取的DNA比较没有明显差异，并可用作模板进行PCR扩增，得到约400 bp基因片段；同时还讨论了DNA提取和扩增过程中应注意的问题，为分子遗传标记技术广泛应用于同类药材的鉴定积累了基础资料。
Extraction and Amplification of DNA from Autoclaved
, http://www.100md.com
Chinese Soft-Shelled Turtle (Trionyx sinensis) Shell and Bone
Liu Zhongquan, Wang Yiquan and Zhou Kaiya
(Institute of Genetic Resources, Nanjing Normal University Nanjing 210097)
Abstract In order to ascertain whether autoclaved Trionyx sinensis Wiegmann could be authenticated by DNA molecular technology, DNA from boiled, steamed, and autoclaved shells and bones of the turtle were extracted and the template DNA amplified by universal primers L-1091 and H-1478. The results showed that there were no differences between the DNA obtained from the autoclaved material in comparison with those obtained from the boiled, steamed or traditionally processed crude drug. A 400 bp DNA fragment was amplified successfully from both boiled bone and muscles of crude drug under standard PCR conditions using the universal primers. The issue of DNA extraction and amplification were also discussed.
, http://www.100md.com
Key words Chinese soft-shelled turtle (Trionyx sinensis Wiegmann) shell and bone DNA extraction PCR amplification
中华鳖Trionyx sinensis Wiegmann 鳖甲是常用中药材。王亚明等从保存10 年的药材龟甲和鳖甲中提得DNA，并用扩增线粒体DNA Cyt b基因片段的通用引物进行PCR扩增[1]，但未说明药材鳖甲是否经高温蒸煮过。而实际收购的药材中，有许多鳖甲经过高温蒸煮。对于这些鳖甲能否用于提取DNA，所提得的DNA结构是否被破坏，最终能否用于PCR扩增，也就是说DNA分子标记鉴定是否适用于经高温蒸煮过的鳖甲?对于其它经高温蒸煮加工过的药材，如用DNA分子标记鉴定也存在着类似问题。为此本文选取高温高压蒸煮过的中华鳖甲和骨骼进行实验研究。
1 材料和方法
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1.1 实验材料：经砂锅用水煮过的中华鳖甲2 块和骨骼2 件；蒸过的中华鳖甲5 块(分别蒸0.5，1，2 h)，高压灭菌锅蒸过(126.8 ℃，0.148 MPa)的鳖甲2 块(分别蒸0.5，1 h)，洗净烘干备用。-20 ℃保存的原动物标本1 只，药材鳖甲1 只，用于对照。
1.2 试剂：蛋白酶K，dNTPs，Taq聚合酶为Promega公司产品，SDS为Serva产品，DNA为Marker和引物为Takara公司合成产品，其它试剂均为国产分析纯。
1.3 DNA的提取：取原动物肌肉约0.1 g于1.5 mL离心管中，加入裂解液(Tris-HCl 0.01 mol/L pH 8.0，EDTA 0.01 mol/L，NaCl 0.01 mol/L)0.4 mL，另加入SDS和蛋白酶K至终浓度分别为1%和0.8 μg/mL，55 ℃水浴保温8 h，然后用等体积饱和酚、等体积酚-氯仿、氯仿、氯仿-异戊醇(24∶1)各抽提1 次，乙醇沉淀DNA，室温下干燥，加TE缓冲液100 μL 溶解DNA沉淀。鳖甲的DNA抽取过程除饱和酚抽提2 次外，余同文献[1]。
, 百拇医药
1.4 PCR扩增： 所用引物为L1091(5′-AAAAAG
CTTCAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-
3′)，H1478(5′-TGACTGCAGAGGGTGACGGGC
GGTGTGT-3′)，L、H分别为轻链和重链，数字与人mtDNA序列对应。该引物用于扩增第三区和部分第二区的约400 bp的线粒体12S rRNA基因片段。PCR扩增总体积为30 μL反应液中含10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.1%Triton X-100，Taq酶1.5 U，4 种dNTP各150 μmol/L，两个引物各10 pmol/L,DNA模板约100 ng。
反应在PE2400或PTC200型PC仪上进行。循环参数为95 ℃预变性4 min，然后进行95 ℃变性40 s，55 ℃复性40 s，72 ℃延伸60 s共30 个循环，最后7 min延伸补齐。
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1.5 DNA的检测：取DNA的提取液或扩增产物5 μL在1.0%加入EB的琼脂糖凝胶上电泳，在UVP-Whiter/Ultraviolet Transilluminator上紫外扫描检测，并自动成相。
2 结果和讨论
从高温高压蒸煮过的鳖甲或骨骼中可以提取到DNA。从图1可见，煮过的鳖甲(3，4号)和骨骼(5，6号)、电饭煲蒸过的鳖甲(7～11号)与冰冻肌肉(1号)和药材鳖甲(2号)所提的DNA相比较，没有明显差异，大多数在1 000 bp以上。高压锅蒸过的鳖甲(12，13)，DNA片段略有降解，大多在2 000 bp以下。从经电饭煲和高压锅蒸时间长短不同(0.5，1，2 h)的鳖甲中，得到DNA没有明显的区别。空白对照中没有DNA，说明提取过程无DNA污染。
1-肌肉 2-药材鳖甲 3，4-煮过的鳖甲 5，6-煮过的骨骼 7和8，9和10，11-分别用电饭煲蒸0.5，1，2 h 12，13-分别用高压灭菌锅蒸0.5，1 h N-阴性对照 M-Marker, DL2000
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图1 从鳖甲和骨骼中提得的DNA琼脂糖凝胶电泳图
用上述提得的DNA模板进行PCR扩增，所有鳖甲和骨骼样品均能扩增出约400 bp的DNA片段，而空白对照无扩增产物，可见提取过程和PCR扩增过程中都无外源DNA的污染。图2为PCR增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。
(样品编号同图1)
图2 RCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
中药材DNA分子标记鉴定，一般要求药材DNA提取和扩增过程中必须严防外源DNA的污染。本实验用去污剂洗涤和紫外线照射样品，彻底去除样品表面外源DNA，所有实验过程都在超净台上进行。捣碎鳖甲的铜臼每用一次，用洗涤剂和超纯水清洗后，倒入酒精烧烤灭菌，以确保实验的准确性。在DNA提取和扩增过程中均设立了空白对照。
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鳖甲和骨骼中含有大量的Ca2+和其它矿物离子，DNA提取时，它们的存在不利于裂解液的消化作用，在随后的PCR反应中也有抑制作用，因此必须将Ca2+去除。一般肌肉或血液的DNA提取裂解液中EDTA浓度为10 mmol/L，本研究中除裂解液中的EDTA的浓度提高为100 mmol/L外，还在裂解液消化之前，用0.5 mol/L EDTA脱钙72 h，并在中间换两次新鲜EDTA溶液，达到去除Ca2+的目的。然后再用蛋白酶K和SDS消解已软化的鳖甲或骨骼粉末，用苯酚氯仿抽提，一次抽提往往不够彻底，可以采取两次或多次抽提的办法解决，以提高模板DNA的纯度，便于随后的扩增。
王亚明等从药材龟板和鳖甲中提取的DNA模板，用常规方法进行PCR扩增时，得不到DNA扩增产物，再次用苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀、透析模板DNA，甚至用DNA纯化试剂盒纯化模板DNA后，也未能扩增出目的DNA片段，认为DNA提取液中含有某种抑制PCR反应的抑制剂，通过加入BSA(小牛血清白蛋白)和过量的Taq酶，便可得到目的DNA片段，有无BSA并不影响扩增结果。可见DNA提取中杂质去除的是否彻底是影响PCR反应的关键。此外PCR反应中加入DNA模板量的多少对扩增也有一定影响，特别是从动物的甲和骨骼中所提的DNA，模板量过多复性时会与引物竞争，从而大大地抑制引物结合到DNA链上，同时也增加了其它抑制因素；模板量过少，减少了引物与DNA链结合的机会，也影响扩增反应的结果。因此在初次扩增时可选择不同浓度梯度的模板量，从中选择最适的浓度。
, 百拇医药
近年来，分子遗传标记技术逐渐应用于中药材的鉴定[2～8]。这一技术的应用，首先必须能够从药材中抽提出DNA。在中药材加工过程中，许多药材经过高温蒸煮、炮制、煎制等过程，能否从这些药材中提得DNA，是分子遗传标记技术能否广泛用于中药材真伪鉴定的关键。本研究表明，经高温高压蒸煮过的鳖甲或骨骼中仍含有大量的DNA，用一般的DNA提取方法，即能从少量的鳖甲样品中提得足够的DNA，用扩增线粒体12S rRNA基因片段，通过用引物进行PCR扩增，能获得稳定的阳性产物。从而给我们一个重要的启示，即经过高温、高压蒸煮过的中药材也可以获得用于PCR扩增的微量DNA，本实验的结果为分子遗传标记技术广泛应用于中药材的真伪鉴定提供了基础资料。
Address: Liu Zongquan, Institute of Genetic Resources. Nanjing No rmal University, Nanjing
国家自然科学基金(No.39870913)、江苏省教委科学基金(98KJB3 60010)和江苏省“333工程”人才培养基金资助
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刘忠权 硕士，讲师，研究方向为动物分子生物学，现从事中药材分子鉴定研究 ，在《药学学报》等刊物上发表论文10 余篇。
联系人，Tel:(025)37291113328,Fax:(025)3738174, Em ail:yqw@pine. njnu. edu.cn
参 考 文 献
1，王亚明，等.药学学报，1996，31(6)：472
2，吴 平，等.药学学报，1998，33(4)：304
3，王义权，等.药学学报，1997，32(5)：384
4，Hashimoto A, et al. Natural Medicines,1998，52(1)：38
5，Fushimi H, et al. Phytomedicine,1996，3：387
6，吴 平，等.中国药科大学学报，1998，29(1)：28
7，王建云，等.中国药科大学学报，1996，27(8)：471
8，王义权，等.药学学报，1998，33(12)：941
(收稿1999-04-02), 百拇医药
单位：南京师范大学遗传资源研究所 210097
关键词：中华鳖甲和骨骼；DNA提取；PCR扩增
中草药000512摘 要 为验证经高温加工过的鳖甲是否可以用DNA分子标记鉴定，选取经高温高压蒸煮过的中华鳖鳖甲和骨进行DNA提取，并用通用引物L1091和H1478扩增。结果表明经高温高压蒸煮过的鳖甲也可以提得较高质量的DNA，与从肌肉和药材鳖甲中提取的DNA比较没有明显差异，并可用作模板进行PCR扩增，得到约400 bp基因片段；同时还讨论了DNA提取和扩增过程中应注意的问题，为分子遗传标记技术广泛应用于同类药材的鉴定积累了基础资料。
Extraction and Amplification of DNA from Autoclaved
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Chinese Soft-Shelled Turtle (Trionyx sinensis) Shell and Bone
Liu Zhongquan, Wang Yiquan and Zhou Kaiya
(Institute of Genetic Resources, Nanjing Normal University Nanjing 210097)
Abstract In order to ascertain whether autoclaved Trionyx sinensis Wiegmann could be authenticated by DNA molecular technology, DNA from boiled, steamed, and autoclaved shells and bones of the turtle were extracted and the template DNA amplified by universal primers L-1091 and H-1478. The results showed that there were no differences between the DNA obtained from the autoclaved material in comparison with those obtained from the boiled, steamed or traditionally processed crude drug. A 400 bp DNA fragment was amplified successfully from both boiled bone and muscles of crude drug under standard PCR conditions using the universal primers. The issue of DNA extraction and amplification were also discussed.
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Key words Chinese soft-shelled turtle (Trionyx sinensis Wiegmann) shell and bone DNA extraction PCR amplification
中华鳖Trionyx sinensis Wiegmann 鳖甲是常用中药材。王亚明等从保存10 年的药材龟甲和鳖甲中提得DNA，并用扩增线粒体DNA Cyt b基因片段的通用引物进行PCR扩增[1]，但未说明药材鳖甲是否经高温蒸煮过。而实际收购的药材中，有许多鳖甲经过高温蒸煮。对于这些鳖甲能否用于提取DNA，所提得的DNA结构是否被破坏，最终能否用于PCR扩增，也就是说DNA分子标记鉴定是否适用于经高温蒸煮过的鳖甲?对于其它经高温蒸煮加工过的药材，如用DNA分子标记鉴定也存在着类似问题。为此本文选取高温高压蒸煮过的中华鳖甲和骨骼进行实验研究。
1 材料和方法
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1.1 实验材料：经砂锅用水煮过的中华鳖甲2 块和骨骼2 件；蒸过的中华鳖甲5 块(分别蒸0.5，1，2 h)，高压灭菌锅蒸过(126.8 ℃，0.148 MPa)的鳖甲2 块(分别蒸0.5，1 h)，洗净烘干备用。-20 ℃保存的原动物标本1 只，药材鳖甲1 只，用于对照。
1.2 试剂：蛋白酶K，dNTPs，Taq聚合酶为Promega公司产品，SDS为Serva产品，DNA为Marker和引物为Takara公司合成产品，其它试剂均为国产分析纯。
1.3 DNA的提取：取原动物肌肉约0.1 g于1.5 mL离心管中，加入裂解液(Tris-HCl 0.01 mol/L pH 8.0，EDTA 0.01 mol/L，NaCl 0.01 mol/L)0.4 mL，另加入SDS和蛋白酶K至终浓度分别为1%和0.8 μg/mL，55 ℃水浴保温8 h，然后用等体积饱和酚、等体积酚-氯仿、氯仿、氯仿-异戊醇(24∶1)各抽提1 次，乙醇沉淀DNA，室温下干燥，加TE缓冲液100 μL 溶解DNA沉淀。鳖甲的DNA抽取过程除饱和酚抽提2 次外，余同文献[1]。
, 百拇医药
1.4 PCR扩增： 所用引物为L1091(5′-AAAAAG
CTTCAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-
3′)，H1478(5′-TGACTGCAGAGGGTGACGGGC
GGTGTGT-3′)，L、H分别为轻链和重链，数字与人mtDNA序列对应。该引物用于扩增第三区和部分第二区的约400 bp的线粒体12S rRNA基因片段。PCR扩增总体积为30 μL反应液中含10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.1%Triton X-100，Taq酶1.5 U，4 种dNTP各150 μmol/L，两个引物各10 pmol/L,DNA模板约100 ng。
反应在PE2400或PTC200型PC仪上进行。循环参数为95 ℃预变性4 min，然后进行95 ℃变性40 s，55 ℃复性40 s，72 ℃延伸60 s共30 个循环，最后7 min延伸补齐。
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1.5 DNA的检测：取DNA的提取液或扩增产物5 μL在1.0%加入EB的琼脂糖凝胶上电泳，在UVP-Whiter/Ultraviolet Transilluminator上紫外扫描检测，并自动成相。
2 结果和讨论
从高温高压蒸煮过的鳖甲或骨骼中可以提取到DNA。从图1可见，煮过的鳖甲(3，4号)和骨骼(5，6号)、电饭煲蒸过的鳖甲(7～11号)与冰冻肌肉(1号)和药材鳖甲(2号)所提的DNA相比较，没有明显差异，大多数在1 000 bp以上。高压锅蒸过的鳖甲(12，13)，DNA片段略有降解，大多在2 000 bp以下。从经电饭煲和高压锅蒸时间长短不同(0.5，1，2 h)的鳖甲中，得到DNA没有明显的区别。空白对照中没有DNA，说明提取过程无DNA污染。
1-肌肉 2-药材鳖甲 3，4-煮过的鳖甲 5，6-煮过的骨骼 7和8，9和10，11-分别用电饭煲蒸0.5，1，2 h 12，13-分别用高压灭菌锅蒸0.5，1 h N-阴性对照 M-Marker, DL2000
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图1 从鳖甲和骨骼中提得的DNA琼脂糖凝胶电泳图
用上述提得的DNA模板进行PCR扩增，所有鳖甲和骨骼样品均能扩增出约400 bp的DNA片段，而空白对照无扩增产物，可见提取过程和PCR扩增过程中都无外源DNA的污染。图2为PCR增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。
(样品编号同图1)
图2 RCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
中药材DNA分子标记鉴定，一般要求药材DNA提取和扩增过程中必须严防外源DNA的污染。本实验用去污剂洗涤和紫外线照射样品，彻底去除样品表面外源DNA，所有实验过程都在超净台上进行。捣碎鳖甲的铜臼每用一次，用洗涤剂和超纯水清洗后，倒入酒精烧烤灭菌，以确保实验的准确性。在DNA提取和扩增过程中均设立了空白对照。
, http://www.100md.com
鳖甲和骨骼中含有大量的Ca2+和其它矿物离子，DNA提取时，它们的存在不利于裂解液的消化作用，在随后的PCR反应中也有抑制作用，因此必须将Ca2+去除。一般肌肉或血液的DNA提取裂解液中EDTA浓度为10 mmol/L，本研究中除裂解液中的EDTA的浓度提高为100 mmol/L外，还在裂解液消化之前，用0.5 mol/L EDTA脱钙72 h，并在中间换两次新鲜EDTA溶液，达到去除Ca2+的目的。然后再用蛋白酶K和SDS消解已软化的鳖甲或骨骼粉末，用苯酚氯仿抽提，一次抽提往往不够彻底，可以采取两次或多次抽提的办法解决，以提高模板DNA的纯度，便于随后的扩增。
王亚明等从药材龟板和鳖甲中提取的DNA模板，用常规方法进行PCR扩增时，得不到DNA扩增产物，再次用苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀、透析模板DNA，甚至用DNA纯化试剂盒纯化模板DNA后，也未能扩增出目的DNA片段，认为DNA提取液中含有某种抑制PCR反应的抑制剂，通过加入BSA(小牛血清白蛋白)和过量的Taq酶，便可得到目的DNA片段，有无BSA并不影响扩增结果。可见DNA提取中杂质去除的是否彻底是影响PCR反应的关键。此外PCR反应中加入DNA模板量的多少对扩增也有一定影响，特别是从动物的甲和骨骼中所提的DNA，模板量过多复性时会与引物竞争，从而大大地抑制引物结合到DNA链上，同时也增加了其它抑制因素；模板量过少，减少了引物与DNA链结合的机会，也影响扩增反应的结果。因此在初次扩增时可选择不同浓度梯度的模板量，从中选择最适的浓度。
, 百拇医药
近年来，分子遗传标记技术逐渐应用于中药材的鉴定[2～8]。这一技术的应用，首先必须能够从药材中抽提出DNA。在中药材加工过程中，许多药材经过高温蒸煮、炮制、煎制等过程，能否从这些药材中提得DNA，是分子遗传标记技术能否广泛用于中药材真伪鉴定的关键。本研究表明，经高温高压蒸煮过的鳖甲或骨骼中仍含有大量的DNA，用一般的DNA提取方法，即能从少量的鳖甲样品中提得足够的DNA，用扩增线粒体12S rRNA基因片段，通过用引物进行PCR扩增，能获得稳定的阳性产物。从而给我们一个重要的启示，即经过高温、高压蒸煮过的中药材也可以获得用于PCR扩增的微量DNA，本实验的结果为分子遗传标记技术广泛应用于中药材的真伪鉴定提供了基础资料。
Address: Liu Zongquan, Institute of Genetic Resources. Nanjing No rmal University, Nanjing
国家自然科学基金(No.39870913)、江苏省教委科学基金(98KJB3 60010)和江苏省“333工程”人才培养基金资助
, http://www.100md.com
刘忠权 硕士，讲师，研究方向为动物分子生物学，现从事中药材分子鉴定研究 ，在《药学学报》等刊物上发表论文10 余篇。
联系人，Tel:(025)37291113328,Fax:(025)3738174, Em ail:yqw@pine. njnu. edu.cn
参 考 文 献
1，王亚明，等.药学学报，1996，31(6)：472
2，吴 平，等.药学学报，1998，33(4)：304
3，王义权，等.药学学报，1997，32(5)：384
4，Hashimoto A, et al. Natural Medicines,1998，52(1)：38
5，Fushimi H, et al. Phytomedicine,1996，3：387
6，吴 平，等.中国药科大学学报，1998，29(1)：28
7，王建云，等.中国药科大学学报，1996，27(8)：471
8，王义权，等.药学学报，1998，33(12)：941
(收稿1999-04-02), 百拇医药