维甲酸和三氧化二砷下调NB4细胞组织因子表达的作用机制
作者：郭为民 王鸿利 赵维莅 璩斌 潘玲 诸江 储海燕 王学锋
单位：200025 上海第二医科大学瑞金医院、上海血液学研究所
关键词：维甲酸；砷剂；白血病，早幼粒细胞，急性；组织因子
中华血液学杂志000504 【摘要】 目的 研究全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(As2O3)下调NB4细胞组织因子(TF)表达的作用机制。方法 用放线菌酮抑制蛋白合成和用放线菌素D阻断RNA合成后，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ATRA对NB4细胞TF mRNA转录的影响。将含有PML-RARα融合蛋白全部编码序列的重组逆转录病毒质粒转染U937细胞，以转染空载体的U937细胞为对照，用ELISA方法检测ATRA和As2O3处理的转染PML-RARα U937细胞的TF抗原。结果 放线菌酮完全阻断了ATRA对NB4细胞TF mRNA的下调作用；ATRA使NB4细胞的TF mRNA的半寿期从正常对照的60min缩短至30min。转染PML-RARα的U937细胞与转染逆转录病毒载体的U937细胞相比，其TF表达水平显著升高(P<0.01)；使用ATRA或As2O3分别处理转染PML-RARα的U937细胞和对照细胞24 h，ATRA和As2O3均可显著地降低这两个细胞株的TF抗原水平。结论 ATRA对NB4细胞TF mRNA的下调作用依赖于新的蛋白质合成，ATRA可能是以间接方式下调APL细胞TF mRNA的转录；ATRA处理的NB4细胞TF mRNA的稳定性也有所降低。APL细胞染色体易位产生的融合蛋白PML-RARα可能对TF的异常表达有一定的影响。ATRA和As2O3对TF的下调作用可能不依赖于融合蛋白PML-RARα的降解。
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Mechanism of tissue factor expression on NB4 cells down-regulated by all-trans retinoic acid and arsenic trioxide
GUO Weimin, WANG Hongli, ZHAO Weili, et al.
(Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025，China)
【Abstract】 Objective To investigate molecular mechanism of tissue factor (TF) expression on acute promyelocytic leukemia cell line NB4 cells down-regulated by all-trans retinoic acid (ATRA) and arsenic trioxide (As2O3). Methods Cyclohexamide (CHX) inhibition test for de novo protein synthesis and actinomycin D (Act D) inhibition test for RNA synthesis were used to check the effect of ATRA on the TF expression. TF antigen of U937 cells transfected with pMSCV-PML-RARα treated with or without ATRA and As2O3 was detected. Results CHX treatment completely suppressed the down-regulation effect of ATRA on the TF mRNA expression, Act D inhibition test showed that half-life of TF mRNA in treated NB4 cells was shortened to about 30 min from that of around 60 min in untreated NB4 cells. The TF antigen contents in U937 cells transfected with pMSCV-PML-RARα were significantly higher than that in transfected U937 cells with retrovirus vector. Both ATRA and As2O3 could down-regulate the TF antigen level in U937 cells transfected with or without PML-RARα. Conclusion The modulation of the TF mRNA expression in NB4 cells by ATRA might be indirect. TF mRNA destabilization was involved in the TF regulation process mediated by ATRA. Elevated TF antigen level in U937 cells transfected with pMSCV-PML-RARα may be related to the fusion protein PML-RARα. The down-regulation effect of ATRA and As2O3 on the TF expression of U937 cells might not involve the fusion protein.
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【Key words】 Retinoic acid； Arsenical； Leukemia, promyelocytic,acute; Tissue factors
急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是一种具有严重出血倾向的急性白血病,完整的APL细胞表面异常地表达组织因子(tis-sue factor, TF)，TF是血液凝固的触发因子，在APL伴发DIC时起着非常重要的作用[1,2]。Koyama等[3]的研究表明全反式维甲酸(ATRA)能下调APL细胞株NB4细胞TF mRNA的表达，降低其TF抗原水平和促凝活性(PCA)，我们的研究结果提示，As2O3与ATRA一样，可抑制APL细胞TF mRNA的转录，降低APL细胞的TF抗原水平和PCA[4,5]。为进一步研究ATRA和As2O3下调APL细胞TF表达的作用机制，我们进行了蛋白和RNA合成的阻断以及转染实验，以探讨与APL并发DIC出血密切相关的TF异常表达的分子病理机制和ATRA下调APL细胞TF表达的作用机制。
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材料和方法
1 细胞培养 NB4细胞由法国圣*路易医院Michel Lanotte博士惠赠，将NB4细胞置于含体积分数为10%胎牛血清(56℃灭活30 min)的RPMI 1640培养液(Gibco-BRL，USA)中，于37℃、体积分数为5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。用10μg/ml 放线菌酮(CHX，蛋白合成抑制剂)处理NB4细胞1h后，用1μmol/L ATRA作用NB4细胞12h，然后收集细胞并抽提总RNA，用于观察ATRA对NB4细胞TF mRNA转录的影响是否依赖于新合成的蛋白质。用1μmol/L ATRA处理NB4细胞6h后，在ATRA处理的NB4细胞和未用ATRA处理的NB4细胞中分别加入终浓度为10μg/ml的放线菌素D，分别于处理前和处理后30，60，90，120，150min收集细胞并抽提总RNA，用于观察ATRA对NB4细胞mRNA稳定性的影响。上述试剂均为美国Sigma公司产品。
2 转染试验 将含有PML-RARα融合蛋白全部编码序列的逆转录病毒重组质粒pMSCV-PML-RARα转染包装细胞Bosc23，然后将其含有病毒颗粒的培养上清感染PA317细胞，以终浓度为5μg/ml的嘌呤霉素筛选10d以上，收获含有病毒颗粒的培养上清感染U937细胞，同时以空载体转染上述细胞作为对照。继续使用嘌呤霉素筛选并扩增U937细胞30d以上，用免疫荧光(immunofluoresence assay)法、蛋白印迹(Western blot)法和逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测，证实转染pMSCV-PML-RARα重组质粒的U937细胞表达PML-RARα融合蛋白。离心收集U937细胞，然后以不含嘌呤霉素的培养基培养转染了pMSCV-PML-RARα重组质粒(U937-pMSCV-PML-RARα)和空载体(U937-pMSCV)的U937细胞5d以上，分别以1μmol/L ATRA和1μmol/L As2O3处理U937-pMSCV-PML-RARα和U937-pMSCV 24h后收集细胞。用冷PBS洗细胞1次，取2×106活细胞加250μl 10g/L Triton X-100/TBS，在4℃冰箱放置30min，然后在4℃下，12000×g，20min离心后，取其上清检测TF抗原。
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3 TF抗原的测定 参照文献的方法[5]。
4 RNA抽提和RT-PCR检测TF mRNA的转录 RNA抽提和RT-PCR检测TF mRNA的转录参照文献[5]的方法。用TRIzol试剂(Gibco-BRL, USA)抽提细胞总RNA，用RNase-free DNase对抽提的总RNA进行消化，酚-氯仿抽提，紫外分光光度法定量，然后进行电泳鉴定。TF引物序列为：上游引物5′-GGATGTGAAGCAGACGTACT-3′位于TF第3外显子(5672～5691bp)，下游引物5′-GTGTAGAGATATAGCCAGGA-3′位于第6外显子(11211～11230bp)，扩增的长度应为535bp。利用SuperScript Preamplication System(Gibco-BRL, USA)将2μg RNA加随机引物进行逆转录；逆转录产物利用上述引物进行PCR扩增后得到了535bp和375bp两个条带。将得到的两种PCR产物分别克隆到pGEM-T质粒后，利用Sanger双脱氧法分别将重组质粒中的535bp和375bp两个插入片段进行DNA测序(测序仪为ABI 377A, Perkin-Elmer公司产品)，发现375bp的TF片段为缺失了整个第5外显子(9277～9436bp)160bp的TF转录本，TF mRNA的这种选择性剪切使TF第4外显子3′端8669nt与第6外显子5′端11157nt相连接。利用TF重组质粒535bp插入片段中间的Hpa Ⅰ和EcoR Ⅰ两个单一酶切位点，使用限制性内切酶Hpa Ⅰ和EcoR Ⅰ对含有535bp插入片段的重组质粒进行双酶切，切除535bp插入片段中的55bp，然后进行连接反应，并以此作为PCR的内参照。使用这种TF内参照模板扩增的PCR产物长度为480bp。
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将构建的内参照模板经系列稀释后加入到上述逆转录产物进行PCR扩增，每份标本分别加内参照模板0.025pg、0.0125pg、0.00625pg，cDNA模板2.5μl,反应总体积为25μl。扩增条件为：95℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共35次循环，最后72℃保温10min。取10μl PCR产物在3g/L琼脂糖凝胶上电泳鉴定。如样本条带和内参照条带亮度相同，则表明样本TF mRNA转录水平与该浓度的内参照相同。
结果
1 CHX蛋白合成抑制试验以及ATRA对NB4细胞mRNA稳定性的影响 从图1可见利用竞争性RT-PCR扩增TF基因的内参照模板480bp条带在ATRA组的亮度增强，说明ATRA组的内源性TF mRNA减少，ATRA对NB4细胞TF的表达有下调作用；使用蛋白合成抑制剂CHX抑制蛋白合成后，ATRA+CHX组TF基因的内参照模板480bp条带亮度减弱，说明ATRA+CHX组的内源性TF mRNA水平增加，加用CHX后阻断了ATRA对NB4细胞TF表达的下调作用，这表明ATRA对NB4细胞TF mRNA的下调作用依赖于新的蛋白质合成；对照组TF基因的内参照模板480bp条带亮度减弱表明NB4细胞TF mRNA的转录异常增高(见图1)。
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图1 CHX抑制蛋白合成后，ATRA对NB4细胞
TF mRNA表达水平的影响
使用放线菌素D阻断RNA的转录后，每一时间点分别加0.025，0.0125和0.00625pg的TF内参照模板对逆转录产物进行PCR扩增，对照组0min时间点0.0125pg内参照模板480bp条带的亮度与内源性TF条带的亮度相当，60min时间点0.0625pg内参照模板480bp条带的亮度与内源性TF条带的亮度相当，说明内源性TF mRNA减少一半的时间为60min，即NB4细胞TF mRNA的半寿期为60min。ATRA处理NB4细胞0min时间点0.0125pg内参照模板480bp条带的亮度与内源性TF条带的亮度相当，30min时间点0.00625pg内参照模板480bp条带的亮度与内源性TF条带的亮度相当，说明ATRA处理NB4细胞的TF mRNA减少一半的时间为30min，即ATRA处理NB4细胞的TF mRNA的半寿期为30min。这一结果表明，利用放线菌素D阻断RNA转录后，ATRA处理的NB4细胞TF mRNA的稳定性也有所下降(见图2)。
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图2 使用放线菌素D阻断RNA转录后，ATRA处理的
NB4细胞稳定性
2 转染pMSCV-PML-RARα重组质粒对U937细胞TF表达的影响 转染pMSCV-PML-RARα重组质粒的U937细胞与转染pMSCV的U937细胞相比，其TF抗原水平显著升高[分别为(889.8±80.3)pg/8×105细胞和(728.9±86.7)pg/8×105细胞，n=3，P< 0.01]。使用1μmol/L ATRA处理U937-pMSCV-PML-RARα和U937-pMSCV两株细胞24h，其TF抗原水平均显著下降[分别为(297.9±23.8)pg/8×105细胞和(301.6±20.1)pg/8×105细胞]；使用1μmol/L As2O3处理转染和未转染PML-RARα的U937细胞，其TF抗原水平也都显著下降[分别为(490.3±33.6)pg/8×105细胞和(381.6±60.6)pg/8×105细胞](见图3)。
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图3 转染pMSCV-PML-RARα重组质粒对U937细胞TF表达的影响
及ATRA和As2O3的作用
讨论
我们发现，使用CHX抑制蛋白合成后，完全阻断了ATRA对NB4细胞TF mRNA的下调作用，表明ATRA下调NB4细胞TF mRNA的转录依赖于新合成的蛋白质，ATRA是以间接的方式下调NB4细胞TF mRNA的转录。使用放线菌素D阻断RNA的转录后，NB4细胞正常对照组TF mRNA的半寿期为60min，ATRA处理NB4细胞的TF mRNA的半寿期为30min，表明ATRA除了下调TF mRNA的转录，还降低NB4细胞TF mRNA的稳定性。
转染pMSCV-PML-RARα重组质粒的U937细胞与转染pMSCV的U937细胞相比，其TF表达水平显著升高(P < 0.01)，我们实验室另一研究小组的工作证明，表达PLZF-RARα融合蛋白或NMP-RARα融合蛋白的转基因小鼠无论是否发生APL，其骨髓细胞均有TF的转录，而不表达PLZF-RARα融合蛋白和NMP-RARα融合蛋白的转基因小鼠骨髓细胞均无TF的转录。维甲酸受体(RARs)属于核受体超家族的一员，RARs必须与视黄醇X受体(retinoid X receptor, RXR)形成异二聚体，才能有效地与DNA结合而发挥转录调节作用[6]。上述PML-RARα、PLZF-RARα和NPM-RARα三种融合基因产生的不同融合产物的RARα部分都能与RXR形成异二聚体，干扰野生型RARα-RXR信号传导途径。上述发现提示APL细胞TF的高表达可能与染色体易位产生的融合蛋白有关。我们使用ATRA和As2O3分别处理U937-pMSCV-PML-RARα和U937-pMSCV两株细胞24h，ATRA和As2O3均可降低这两株细胞的TF抗原水平，因此推测ATRA和As2O3对上述U937细胞TF的下调作用可能不完全依赖于PML-RARα融合蛋白。APL细胞特有的t(15;17)染色体易位产生的融合蛋白PML-RARα据认为对白血病的发生具有重要意义，但使用PML-RARα-ribozyme抑制其表达后并不能使APL细胞分化[7]。因此进一步对APL细胞TF异常表达及其受维甲酸下调的分子机制研究，将不仅有助于阐明与APL并发DIC出血密切相关的TF异常表达的分子病理机制，从而有利于寻找更有效地控制DIC的方法，而且有可能促进我们对APL癌变机制和诱导分化机制的进一步理解。
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基金项目：胡应洲基金部分资助
参考文献
1，Tallman MS,Kwaan HC.Reassessing the hemostatic disorder associated with acute promyelocytic leukemia.Blood,1992,79:543-553.
2，Tanaka M,Yamanishi H.The expression of tissue factor antigen and activity on the surface of leukemic cells.Leuk Res，1993,17:103-111.
3，Koyama T,Hirosawa S,Kawamata N,et al.All-trans retinoic acid upregulates thrombomodulin and downregulates tissue factor expression in acute promyelocytic leukemia cells: distinct expression of thrombomodulin and tissue factor in human leukemic cells.Blood,1994,84:3001-3009.
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4，赵维莅，王鸿利，郭为民，等.急性早幼粒细胞白血病维甲酸和砷剂治疗期间组织因子改变的研究.中华血液学杂志,1998，19:473-476.
5，郭为民，诸江，王鸿利，等.维甲酸、砷剂及柔红霉素对NB4细胞组织因子表达的影响.中华血液学杂志,1999,20:453-455.
6，Chambon P.A decade of molecular biology of retinoic acid receptors.FASEB J,1996，10:940-954.
7，Nason-Burchenal K,Takle G,Pace U,et al.Targeting the PML/RAR alpha translocation product triggers apoptosis in promyelocytic leukemia cells.Oncogene,1998,17:1759-1768.
(收稿日期：1999-10-12), 百拇医药
单位：200025 上海第二医科大学瑞金医院、上海血液学研究所
关键词：维甲酸；砷剂；白血病，早幼粒细胞，急性；组织因子
中华血液学杂志000504 【摘要】 目的 研究全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(As2O3)下调NB4细胞组织因子(TF)表达的作用机制。方法 用放线菌酮抑制蛋白合成和用放线菌素D阻断RNA合成后，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ATRA对NB4细胞TF mRNA转录的影响。将含有PML-RARα融合蛋白全部编码序列的重组逆转录病毒质粒转染U937细胞，以转染空载体的U937细胞为对照，用ELISA方法检测ATRA和As2O3处理的转染PML-RARα U937细胞的TF抗原。结果 放线菌酮完全阻断了ATRA对NB4细胞TF mRNA的下调作用；ATRA使NB4细胞的TF mRNA的半寿期从正常对照的60min缩短至30min。转染PML-RARα的U937细胞与转染逆转录病毒载体的U937细胞相比，其TF表达水平显著升高(P<0.01)；使用ATRA或As2O3分别处理转染PML-RARα的U937细胞和对照细胞24 h，ATRA和As2O3均可显著地降低这两个细胞株的TF抗原水平。结论 ATRA对NB4细胞TF mRNA的下调作用依赖于新的蛋白质合成，ATRA可能是以间接方式下调APL细胞TF mRNA的转录；ATRA处理的NB4细胞TF mRNA的稳定性也有所降低。APL细胞染色体易位产生的融合蛋白PML-RARα可能对TF的异常表达有一定的影响。ATRA和As2O3对TF的下调作用可能不依赖于融合蛋白PML-RARα的降解。
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Mechanism of tissue factor expression on NB4 cells down-regulated by all-trans retinoic acid and arsenic trioxide
GUO Weimin, WANG Hongli, ZHAO Weili, et al.
(Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025，China)
【Abstract】 Objective To investigate molecular mechanism of tissue factor (TF) expression on acute promyelocytic leukemia cell line NB4 cells down-regulated by all-trans retinoic acid (ATRA) and arsenic trioxide (As2O3). Methods Cyclohexamide (CHX) inhibition test for de novo protein synthesis and actinomycin D (Act D) inhibition test for RNA synthesis were used to check the effect of ATRA on the TF expression. TF antigen of U937 cells transfected with pMSCV-PML-RARα treated with or without ATRA and As2O3 was detected. Results CHX treatment completely suppressed the down-regulation effect of ATRA on the TF mRNA expression, Act D inhibition test showed that half-life of TF mRNA in treated NB4 cells was shortened to about 30 min from that of around 60 min in untreated NB4 cells. The TF antigen contents in U937 cells transfected with pMSCV-PML-RARα were significantly higher than that in transfected U937 cells with retrovirus vector. Both ATRA and As2O3 could down-regulate the TF antigen level in U937 cells transfected with or without PML-RARα. Conclusion The modulation of the TF mRNA expression in NB4 cells by ATRA might be indirect. TF mRNA destabilization was involved in the TF regulation process mediated by ATRA. Elevated TF antigen level in U937 cells transfected with pMSCV-PML-RARα may be related to the fusion protein PML-RARα. The down-regulation effect of ATRA and As2O3 on the TF expression of U937 cells might not involve the fusion protein.
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【Key words】 Retinoic acid； Arsenical； Leukemia, promyelocytic,acute; Tissue factors
急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是一种具有严重出血倾向的急性白血病,完整的APL细胞表面异常地表达组织因子(tis-sue factor, TF)，TF是血液凝固的触发因子，在APL伴发DIC时起着非常重要的作用[1,2]。Koyama等[3]的研究表明全反式维甲酸(ATRA)能下调APL细胞株NB4细胞TF mRNA的表达，降低其TF抗原水平和促凝活性(PCA)，我们的研究结果提示，As2O3与ATRA一样，可抑制APL细胞TF mRNA的转录，降低APL细胞的TF抗原水平和PCA[4,5]。为进一步研究ATRA和As2O3下调APL细胞TF表达的作用机制，我们进行了蛋白和RNA合成的阻断以及转染实验，以探讨与APL并发DIC出血密切相关的TF异常表达的分子病理机制和ATRA下调APL细胞TF表达的作用机制。
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材料和方法
1 细胞培养 NB4细胞由法国圣*路易医院Michel Lanotte博士惠赠，将NB4细胞置于含体积分数为10%胎牛血清(56℃灭活30 min)的RPMI 1640培养液(Gibco-BRL，USA)中，于37℃、体积分数为5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。用10μg/ml 放线菌酮(CHX，蛋白合成抑制剂)处理NB4细胞1h后，用1μmol/L ATRA作用NB4细胞12h，然后收集细胞并抽提总RNA，用于观察ATRA对NB4细胞TF mRNA转录的影响是否依赖于新合成的蛋白质。用1μmol/L ATRA处理NB4细胞6h后，在ATRA处理的NB4细胞和未用ATRA处理的NB4细胞中分别加入终浓度为10μg/ml的放线菌素D，分别于处理前和处理后30，60，90，120，150min收集细胞并抽提总RNA，用于观察ATRA对NB4细胞mRNA稳定性的影响。上述试剂均为美国Sigma公司产品。
2 转染试验 将含有PML-RARα融合蛋白全部编码序列的逆转录病毒重组质粒pMSCV-PML-RARα转染包装细胞Bosc23，然后将其含有病毒颗粒的培养上清感染PA317细胞，以终浓度为5μg/ml的嘌呤霉素筛选10d以上，收获含有病毒颗粒的培养上清感染U937细胞，同时以空载体转染上述细胞作为对照。继续使用嘌呤霉素筛选并扩增U937细胞30d以上，用免疫荧光(immunofluoresence assay)法、蛋白印迹(Western blot)法和逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测，证实转染pMSCV-PML-RARα重组质粒的U937细胞表达PML-RARα融合蛋白。离心收集U937细胞，然后以不含嘌呤霉素的培养基培养转染了pMSCV-PML-RARα重组质粒(U937-pMSCV-PML-RARα)和空载体(U937-pMSCV)的U937细胞5d以上，分别以1μmol/L ATRA和1μmol/L As2O3处理U937-pMSCV-PML-RARα和U937-pMSCV 24h后收集细胞。用冷PBS洗细胞1次，取2×106活细胞加250μl 10g/L Triton X-100/TBS，在4℃冰箱放置30min，然后在4℃下，12000×g，20min离心后，取其上清检测TF抗原。
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3 TF抗原的测定 参照文献的方法[5]。
4 RNA抽提和RT-PCR检测TF mRNA的转录 RNA抽提和RT-PCR检测TF mRNA的转录参照文献[5]的方法。用TRIzol试剂(Gibco-BRL, USA)抽提细胞总RNA，用RNase-free DNase对抽提的总RNA进行消化，酚-氯仿抽提，紫外分光光度法定量，然后进行电泳鉴定。TF引物序列为：上游引物5′-GGATGTGAAGCAGACGTACT-3′位于TF第3外显子(5672～5691bp)，下游引物5′-GTGTAGAGATATAGCCAGGA-3′位于第6外显子(11211～11230bp)，扩增的长度应为535bp。利用SuperScript Preamplication System(Gibco-BRL, USA)将2μg RNA加随机引物进行逆转录；逆转录产物利用上述引物进行PCR扩增后得到了535bp和375bp两个条带。将得到的两种PCR产物分别克隆到pGEM-T质粒后，利用Sanger双脱氧法分别将重组质粒中的535bp和375bp两个插入片段进行DNA测序(测序仪为ABI 377A, Perkin-Elmer公司产品)，发现375bp的TF片段为缺失了整个第5外显子(9277～9436bp)160bp的TF转录本，TF mRNA的这种选择性剪切使TF第4外显子3′端8669nt与第6外显子5′端11157nt相连接。利用TF重组质粒535bp插入片段中间的Hpa Ⅰ和EcoR Ⅰ两个单一酶切位点，使用限制性内切酶Hpa Ⅰ和EcoR Ⅰ对含有535bp插入片段的重组质粒进行双酶切，切除535bp插入片段中的55bp，然后进行连接反应，并以此作为PCR的内参照。使用这种TF内参照模板扩增的PCR产物长度为480bp。
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结果
1 CHX蛋白合成抑制试验以及ATRA对NB4细胞mRNA稳定性的影响 从图1可见利用竞争性RT-PCR扩增TF基因的内参照模板480bp条带在ATRA组的亮度增强，说明ATRA组的内源性TF mRNA减少，ATRA对NB4细胞TF的表达有下调作用；使用蛋白合成抑制剂CHX抑制蛋白合成后，ATRA+CHX组TF基因的内参照模板480bp条带亮度减弱，说明ATRA+CHX组的内源性TF mRNA水平增加，加用CHX后阻断了ATRA对NB4细胞TF表达的下调作用，这表明ATRA对NB4细胞TF mRNA的下调作用依赖于新的蛋白质合成；对照组TF基因的内参照模板480bp条带亮度减弱表明NB4细胞TF mRNA的转录异常增高(见图1)。
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图1 CHX抑制蛋白合成后，ATRA对NB4细胞
TF mRNA表达水平的影响
使用放线菌素D阻断RNA的转录后，每一时间点分别加0.025，0.0125和0.00625pg的TF内参照模板对逆转录产物进行PCR扩增，对照组0min时间点0.0125pg内参照模板480bp条带的亮度与内源性TF条带的亮度相当，60min时间点0.0625pg内参照模板480bp条带的亮度与内源性TF条带的亮度相当，说明内源性TF mRNA减少一半的时间为60min，即NB4细胞TF mRNA的半寿期为60min。ATRA处理NB4细胞0min时间点0.0125pg内参照模板480bp条带的亮度与内源性TF条带的亮度相当，30min时间点0.00625pg内参照模板480bp条带的亮度与内源性TF条带的亮度相当，说明ATRA处理NB4细胞的TF mRNA减少一半的时间为30min，即ATRA处理NB4细胞的TF mRNA的半寿期为30min。这一结果表明，利用放线菌素D阻断RNA转录后，ATRA处理的NB4细胞TF mRNA的稳定性也有所下降(见图2)。
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图2 使用放线菌素D阻断RNA转录后，ATRA处理的
NB4细胞稳定性
2 转染pMSCV-PML-RARα重组质粒对U937细胞TF表达的影响 转染pMSCV-PML-RARα重组质粒的U937细胞与转染pMSCV的U937细胞相比，其TF抗原水平显著升高[分别为(889.8±80.3)pg/8×105细胞和(728.9±86.7)pg/8×105细胞，n=3，P< 0.01]。使用1μmol/L ATRA处理U937-pMSCV-PML-RARα和U937-pMSCV两株细胞24h，其TF抗原水平均显著下降[分别为(297.9±23.8)pg/8×105细胞和(301.6±20.1)pg/8×105细胞]；使用1μmol/L As2O3处理转染和未转染PML-RARα的U937细胞，其TF抗原水平也都显著下降[分别为(490.3±33.6)pg/8×105细胞和(381.6±60.6)pg/8×105细胞](见图3)。
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图3 转染pMSCV-PML-RARα重组质粒对U937细胞TF表达的影响
及ATRA和As2O3的作用
讨论
我们发现，使用CHX抑制蛋白合成后，完全阻断了ATRA对NB4细胞TF mRNA的下调作用，表明ATRA下调NB4细胞TF mRNA的转录依赖于新合成的蛋白质，ATRA是以间接的方式下调NB4细胞TF mRNA的转录。使用放线菌素D阻断RNA的转录后，NB4细胞正常对照组TF mRNA的半寿期为60min，ATRA处理NB4细胞的TF mRNA的半寿期为30min，表明ATRA除了下调TF mRNA的转录，还降低NB4细胞TF mRNA的稳定性。
转染pMSCV-PML-RARα重组质粒的U937细胞与转染pMSCV的U937细胞相比，其TF表达水平显著升高(P < 0.01)，我们实验室另一研究小组的工作证明，表达PLZF-RARα融合蛋白或NMP-RARα融合蛋白的转基因小鼠无论是否发生APL，其骨髓细胞均有TF的转录，而不表达PLZF-RARα融合蛋白和NMP-RARα融合蛋白的转基因小鼠骨髓细胞均无TF的转录。维甲酸受体(RARs)属于核受体超家族的一员，RARs必须与视黄醇X受体(retinoid X receptor, RXR)形成异二聚体，才能有效地与DNA结合而发挥转录调节作用[6]。上述PML-RARα、PLZF-RARα和NPM-RARα三种融合基因产生的不同融合产物的RARα部分都能与RXR形成异二聚体，干扰野生型RARα-RXR信号传导途径。上述发现提示APL细胞TF的高表达可能与染色体易位产生的融合蛋白有关。我们使用ATRA和As2O3分别处理U937-pMSCV-PML-RARα和U937-pMSCV两株细胞24h，ATRA和As2O3均可降低这两株细胞的TF抗原水平，因此推测ATRA和As2O3对上述U937细胞TF的下调作用可能不完全依赖于PML-RARα融合蛋白。APL细胞特有的t(15;17)染色体易位产生的融合蛋白PML-RARα据认为对白血病的发生具有重要意义，但使用PML-RARα-ribozyme抑制其表达后并不能使APL细胞分化[7]。因此进一步对APL细胞TF异常表达及其受维甲酸下调的分子机制研究，将不仅有助于阐明与APL并发DIC出血密切相关的TF异常表达的分子病理机制，从而有利于寻找更有效地控制DIC的方法，而且有可能促进我们对APL癌变机制和诱导分化机制的进一步理解。
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基金项目：胡应洲基金部分资助
参考文献
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(收稿日期：1999-10-12), 百拇医药