激发型抗CD40单克隆抗体对CD40＋B细胞恶性肿瘤的生长抑制和促凋亡作用
作者：周照华 施勤 王江方 潘建忠 张学光
单位：215007 苏州医学院免疫教研室
关键词：抗原，CD40；抗体，单克隆；多发性骨髓瘤；淋巴瘤，B细胞；细胞凋亡
中华血液学杂志000503 【摘要】 目的 研究CD40抗原在恶性B淋巴细胞肿瘤中的表达及其CD40抗原激发所致的生物学效应。方法 将激发型CD40单克隆抗体(单抗)5C11加入肿瘤细胞的体外培养体系，采用细胞计数、流式细胞仪分析等方法分析单抗5C11对不同肿瘤细胞株的作用。结果 5C11能引起CD40表达强阳性的多发性骨髓瘤(MM)细胞XG2发生同型聚集，抑制其生长并介导细胞凋亡；5C11可引起CD40+的恶性B淋巴瘤细胞株Daudi发生同型聚集，抑制其生长并使细胞发生G2/M期阻滞，但并不介导细胞凋亡。结论 激发型CD40单抗通过诱导恶性B淋巴瘤细胞的凋亡或使G2/M期细胞阻滞，抑制肿瘤细胞的体外生长。
Anti-CD40 McAb induces CD40+ malignant B cell proliferation arrest and apoptosis
ZHOU Zhaohua, SHI Qin, WANG Jiangfang, et al.
(Department of Immunology, Suzhou Medical College, Suzhou 215007,China)
【Abstract】 Objective To study the expression of CD40 molecule and the biological effects mediated by CD40 molecules on malignant B cells. Methods Agonistic anti-human CD40 monoclonal antibody (5C11) was added to the cell culture system. Cell counting, PI staining, Annexin-V staining and flow cytometric analysis were used to study the biological effects of 5C11 on malignant B cell lines. Results 5C11 induced homotypic aggregation, proliferation arrest and apoptosis in the multiple myeloma cell line XG2 highly expressed CD40. 5C11 induced B lymphoma cell line Daudi homotypic aggregation and proliferation arrest but no apoptosis. Conclusion 5C11 can inhibit proliferation of malignant B cells by inducing apoptosis or arresting the cells at G2/M interphase.
【Key words】 Antigen, CD40; Monoclonal antibody; Multiple myeloma; Lymphoma,B-cell; Cell growth inhibition; Apoptosis
在B细胞发育过程中，CD40抗原的表达呈动态性变化。许多研究表明，在B细胞的个体发生早期，CD40分子就开始表达，这种表达先于B细胞的Ig μ基因的重排[1]。随后，在B细胞成熟和活化过程中CD40分子持续高表达[2，3]，但成熟的浆细胞不表达CD40[4-6]。而与此相反，新鲜分离及体外建系的人多发性骨髓瘤(MM)细胞——恶性浆细胞却异常表达CD40[7]。
为了进一步阐明CD40分子介导的信号对MM细胞和B淋巴瘤细胞的生物学作用，我们采用本室研制的CD40激发型单抗 5C11[8]，观察其对CD40表达阳性的恶性B淋巴瘤细胞株的生物学效应。
材料和方法
1 细胞株 XG2是本室张学光教授在国外建立的人多发性骨髓瘤细胞系[9]，置于含体积分数为10%胎牛血清及3ng/ml rIL-6(中国科学院刘新垣教授赠送)的RPMI 1640(Gibco 公司)中常规培养；B淋巴瘤细胞株Daudi(购自ATCC)用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基在37℃，体积分数为5%的CO2中长期培养。U266、RPMI 8226为非依赖IL-6的MM细胞株(均购自ATCC)，用含体积分数为10%小牛血清的RPMI 1640培养。
2 细胞培养 将XG2、Daudi细胞2×105/ml培养于24孔板，加不同浓度的5C11，于培养的24，48，72，96h计数(台盼蓝染色去除死细胞)。每组设3个复孔。
3 流式细胞术检测 ①碘化丙锭(PI)染色；培养的细胞200×g离心10min，收获1×106细胞，经PBS洗涤2次后，加入1ml体积分数为70%的乙醇4℃固定过夜。离心收集细胞，以PBS洗涤2次，再加入100μg/ml RNase A，于37℃放置30min，继而细胞置于含有34mmol/L的柠檬酸钠、50μg/ml PI液体500μl中，于4℃避光共育30min，用流式细胞仪(Coulter)的标准程序进行细胞周期分析。②Annexin-V标记：按Boehringe公司的说明书进行，1×106细胞用PBS洗两次，重悬于100μl标记液中[HEPES缓冲液 (HEPES/NaOH, pH 7.4; 140mmol/L NaCl; 5mmol/L CaCl2)含2μl Annexin-V和2μl PI (50μg/ml)]，室温放置20min，用HEPES 缓冲液洗两次, 用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。
3 RT-PCR 按文献[10]的方法，用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取XG2和Daudi细胞的总RNA，逆转录并定量。bcl-XL引物(上游:5′-TAGATGGAGCCACTGCGCACAG-3′，下游：5′-TCAGGAACCAGCGGTTGAAGCG-3′，453bp 产物)；bax 引物(上游:5′-TGAATGGAGCCACTGCGCACAG-3′，下游：5′-TCAGGAACCAGCGGTTGAAGCG-3′, 419bp 产物)由中国科学院上海细胞生物研究所合成，随机引物β-actin购自华美上海公司。PCR反应第一循环条件为94℃ 1min，56℃(bax为54℃)100s,72℃ 120s,共循环30次，最后一次循环为72℃ 4min；取10μl PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，并用GEL-DOC 1000紫外一次成像仪(BioRad公司)进行扫描，并以β-actin做为参照,对bcl-XL和bax mRNA进行拍照和作半定量分析。
结 果
1 抗CD40 单抗 5C11介导XG2及Daudi细胞发生同型聚集 在IL-6依赖性的XG2及Daudi细胞培养体系中加入1μg和10μg的5C11，在培养后24h，光镜下观察肿瘤细胞均呈明显的同型聚集，并在48h后细胞凝集成团。
2 5C11抑制XG2和Daudi细胞生长 加入单抗共同培养后的XG2和Daudi细胞，光镜下除发生同型聚集外，细胞生长缓慢，经不同培养时间的细胞计数表明，5C11抑制XG2和Daudi细胞生长，1μg/ml即具显著的抑制作用，见图1。
3 5C11介导XG2细胞的凋亡和使Daudi细胞G2/M期阻滞 镜下观察5C11(1μg/ml)处理24h后的XG2细胞，可发现细胞膜皱缩，细胞浆颗粒增多。随即用Annexin-V标记，流式细胞仪分析表明，40%～60%的XG2细胞呈现凋亡。Daudi细胞虽未发生相似的凋亡现象，但PI染色流式细胞仪分析表明，5C11可使Daudi细胞阻滞在G2/M期。
4 5C11处理使Daudi细胞抗凋亡基因bcl-XL表达增加 RT-PCR测定显示，经5C11处理的XG2细胞凋亡调节基因bcl-XL和bax无明显变化，而经5C11处理的Daudi细胞则表现为抗凋亡基因bcl-XL上调性表达，经Gel Doc紫外成像仪扫描分析，bcl-XL/bax比率亦增加，见图2。
1，2 vs 3，4，P<0.01
图1 5C11对XG2细胞(a)和Daudi细胞(b)生长的抑制效应
讨论
CD40抗原在B淋巴细胞的生长和分化中具有至关重要的作用。由CD40单抗+IL-4+LCD32细胞组成的体外培养系统能使B淋巴细胞增殖、分化，启动免疫球蛋白的分泌及其类型转换[11-15]。在恶性淋巴细胞，特别是恶性浆细胞表达CD40抗原，其意义和功能如何，一直存在争议。Westendorf等[6]报道新鲜分离的MM细胞均表达CD40抗原，同时CD40介导了MM细胞株ANBL-6的IL-6自分泌生长，并由此推论CD40对MM在体内扩散和增殖起关键的作用。而随后的一些研究表明，CD40抗原激发的MM细胞的增殖或克隆形成与IL-6分泌不一定有直接联系[16]。CD40的激发甚至能导致一些MM细胞株的生长抑制[17]。在本研究中，我们所获得的抗CD40单抗，能显著地抑制CD40+的多发性骨髓瘤细胞株XG2的增殖，并介导其凋亡，表明CD40介导的信号可能存在双向调节性，即可以介导细胞增殖和分化，也可抑制细胞生长甚至诱导凋亡。其机制可能与CD40配基化的程度有关或者与CD40分子的信号传递过程中所涉及的蛋白不同有关[18]。
XG2为IL-6依赖性人MM细胞株，Daudi为B淋巴瘤细胞株。5C11引起的XG2生长抑制和凋亡，主要是使XG2不进入细胞周期，即处于G1期而最终死亡，这与XG2撤除IL-6培养而发生的凋亡作用类似。同时，这两种情况均未引起 XG2凋亡调节基因bcl-XL和bax的变化。与此不同的是，5C11处理后的Daudi细胞发生G2/M期阻滞，但并不介导凋亡；同时，CD40单抗处理后的Daudi细胞bcl-XL mRNA表达提高，bcl-XL/bax比率亦增加，推测这可能与Daudi细胞在CD40单抗作用下仅产生G2/M期阻滞而未发生凋亡相关。
业已证实，新鲜分离的MM细胞均表达CD40分子，值得采用5C11单抗进一步观察能否促使其凋亡。这将为运用CD40 单抗或sCD40L诱导MM细胞凋亡提供理论依据。Funakoshi等[19]在负瘤小鼠实验中发现，CD40单抗能抑制淋巴瘤细胞的生长和促使肿瘤消退；我们在实验中亦发现应用5C11与淋巴瘤细胞共同培育后，有显著地抑制其生长的作用，并可以提高淋巴瘤对其它促凋亡因素(化疗药物地塞米松和60Co-γ射线照射)的敏感性。
基金项目：杰出人才基金资助项目(39625024)；国家自然科学基金青年基金资助项目(39600056)
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(收稿日期：1999-07-19)