白头翁糖蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞免疫的增强作用
作者：戴玲 王华 陈彦
单位：合肥，安徽大学生命科学院 230039
关键词：白头翁， 糖蛋白， 巨噬细胞， 免疫增强
中国生化药物杂志000505 摘 要 目的：研究白头翁糖蛋白对巨噬细胞免疫功能的调节作 用。方法：在体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞中加入不同浓度白头翁糖 蛋白后，观察其对巨噬细胞吞噬功能、一氧化氮合成和白介素-1分泌的影响。结果：白头翁糖蛋白能在体外显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红 的作用，并可诱生巨噬细胞产生一氧化氮，对巨噬细胞分泌白介素-1亦有一定的提高作用 。结论：白头翁糖蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞有免疫增强作用。
中图分类号 R282.71； Q513.2
The Immune-enhancing Effect of PcG-A--a Glycoprotein Isolated f rom Dried Root
, http://www.100md.com
of Pulsatilla Chinensis(Bunge) Regel
Dai Ling Wang Hua Chen Yan
(College of Life Science,Anhui University Hefei 230039)
Abstract Purpose：The aim is to study the modulation effects of PcG-A on immune function of macrophages.Methods:By adding different concentra tion of PcG-A into cultured mice peritoneal macrophages in vitro, the influ ence of PcG-A on macrophage immune function was observed by detecting phagocy tosis,nitric oxide synthesis and IL-1 secretion.Results:PcG-A coul d significantly increase phagocytic activity and NO release of Mφ had som e positive effect on LPS induced IL-1 production.Conclusion:PcG-A can enhance the immune function of macrophages.
, 百拇医药
Key words Pulsatilla Chinensis, Glycoprotein, Macrophage, I mmune enhancement
中药白头翁为多年生草本植物白头翁[Pulsatilla Chinensis(Bunge)Regel]的干燥根 ，功效清热解毒，为中医临床治痢要药。白头翁糖蛋白是从中药白头翁根的水提取液中分离纯化得到的均一糖蛋白组分。本文研究了 该白头翁糖蛋白组分(PcG-A)对小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)免疫功能的影响。
1 材 料
PcG-A由市售中药白头翁经水浸提，醇析，过柱，浓缩，冷冻干燥等步骤制得[1] 。呈白色粉状，分子量6.25×104，糖含量61.8%，由木糖和葡萄糖组成，摩尔比1 .5∶1，并含10种氨基酸。用 RPMI 1640培养基配成一定浓度，过滤除菌，置冰箱保存备用 。
, http://www.100md.com
昆明种小鼠，6～8周龄，18～22g，雌雄不限，安徽医科大学实验动物中心。
RPMI 1640，Gibco产品；ConA、N-1-萘乙二胺盐酸盐、LPS，Sigma公司；MTT，Fluka ；其余试剂均为国产分析纯。
2 方 法
2.1 小鼠腹腔Mφ制备
昆明种小鼠，腹腔注射1%淀粉溶液2 ml/只，2 d后断颈处死，无菌冰浴收集腹腔渗出细胞。 按常规制备Mφ单层。
2.2 Mφ吞噬中性红试验[2]
取2.1项制备的96孔板Mφ单层，加入用RPMI 1640完全培养基稀释的含有不同浓度PcG-A 的溶液0.1 ml/孔，CO2培养箱培养22 h，然后向每孔加入0.1%的中性红生理盐水液，继续 培养20 min，倾去上清液，用温PBS洗3遍，每孔加入细胞溶解液(乙酸∶无水乙醇=50∶50) 0.2 ml，室温下放置2～3 h，待细胞溶解后，即在酶标仪上测波长540 nm处的吸收度A 。不加糖，加培养基作为对照组。
, 百拇医药
2.3 NO诱生量的测定
用亚硝酸盐测定法[3]。NO的生成以测定培养上清中NO2-的含量为指标，后者 为NO的氧化物。Mφ单层加入不同浓度含白头翁糖蛋白溶液后，置CO2培养箱培养24 h， 然后取上清50 μl至另一培养板，加Griess试剂(1%对氨基苯磺酸、0.1%N-1-萘乙 二胺盐酸盐、2.5%H3PO4)50 μl ，室温10 min，在波长540 nm测定吸收度A。 以亚硝酸钠同样操作作出标准曲线，求出NO2-的含量。
2.4 白介素-1(IL-1)的诱生与检测[4]
24孔板Mφ单层，分别加入不同浓度的PcG-A和LPS(终浓度6 μg/ml)，总体积1 ml，CO 2孵箱中培养6 h后，吸去含药物的培养液，用温RPMI 1640培养液洗3次，换等量含10%小牛 血清的RPMI 1640完全培养基继续培养至48 h，收集上清-20℃冻存待测IL-1活性。
, http://www.100md.com
IL-1活性测定用胸腺细胞增殖法。在96孔平底培养板中，每孔加入不同稀释度的IL-1待测 品0.1 ml，ConA-胸腺细胞0.1 ml(细胞浓度1×107/ml,ConA终浓度2 μg/ml)，37 ℃，CO2培养箱培养，以MTT比色法测胸腺细胞增殖。
所有数据均用t检验分析组间差异。
3 结果与讨论
3.1 Pc G-A对小鼠腹腔Mφ吞噬中性红的影响
从表1中可见，在所用的各种浓度，PcG-A均有较强的促Mφ吞噬中性红的作用。
表1 PcG-A对小鼠腹腔Mφ吞噬中性红的影响(n=3,x -±s) PcG-A终浓度(μg/ml)
, http://www.100md.com
A值
30
0.696±0.0781
60
0.890±0.1802
120
0.831±0.0902
240
0.931±0.1182
480
0.722±0.0552
, 百拇医药
对照组
0.413±0.098
与对照组比较：1 P<0.05，2 P<0.01
3.2 PcG-A诱导Mφ生成NO
PcG-A对Mφ有很强的诱生NO的作用(见表2)。在所选用的各种PcG-A浓度，各给药组和对 照组比较均有显著差异。
表2 PcG-A对小鼠腹腔Mφ产生NO的影响(n=3,x- ±s) PcG-A终浓度(μg/ml)
NO-2 (nmol/)L
, 百拇医药 30
142±141
60
135±131
120
150±162
240
156±152
对照组
100±9
与对照组比较：1 P<0.05，2 P<0.01
, 百拇医药
3.3 不同剂量的PcG-A对LPS诱导Mφ产生IL-1的影响
表3所列结果为待测上清作1∶20稀释时所测得。结果表明，PcG-A对亚适剂量的LPS(6 μg/ ml)诱导Mφ产生IL-1具有一定的促进作用。和LPS组比较，PcG-A在浓度≥240 μg/ml时 差异有统计学意义，而在较低浓度时对Mφ分泌IL-1的能力有增高趋势，但无统计学差异 。
表3 PcG-A对小鼠Mφ分泌IL-1的影响(n=4,x-±s ) PcG-A终浓度(μg/ml)
IL-1(A值)
30
0.785±0.058
, 百拇医药 60
0.830±0.038
120
0.863±0.110
240
0.887±0.0391
480
0.913±0.0701
LPS(6 μg/ml)
0.777±0.0752
对照组
, http://www.100md.com
0.608±0.024
与LPS组比较：1 P<0.05；与对照组比较：2 P<0.01
Mφ是一具有多种功能的免疫细胞，在机体的特异性和非特异性免疫反应中发挥重要功能 。激活的Mφ表现出吞噬能力的加强并分泌大量介质，包括细胞因子，反应性氮介质及反 应性氧介质，从而发挥抗微生物，抗肿瘤，参与炎症反应等作用。
本结果表明从白头翁中提取的PcG-A，可在体外进一步增强小鼠腹腔Mφ吞噬功 能，刺激Mφ合成NO，对LPS诱导的IL-1产生也有促进作用。
安徽省自然科学基金资助项目
参考文献
, 百拇医药
1，陈彦，李一琨，包森林，等.白头翁糖蛋白的分离纯化及其性质.中国生化药物杂 志，1997，18(4)∶180～183
2，王晓京，丁桂风，范少光.几种阿片肽及ACTH对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作 用.中国免疫学杂志，1987，3(4)∶211～213
3，包建军，邢嵘，丁丽华，等.一氧化氮与活化的小鼠腹腔巨噬细胞细胞毒作用关 系的研究.上海免疫学杂志，1998，18(5)∶283～286
4，杨贵贞主编.免疫生物工程纲要与技术.长春∶吉林科学技术出版社，1991∶21
收稿日期 1999-10-01
修回日期 1999-12-26, 百拇医药
单位：合肥，安徽大学生命科学院 230039
关键词：白头翁， 糖蛋白， 巨噬细胞， 免疫增强
中国生化药物杂志000505 摘 要 目的：研究白头翁糖蛋白对巨噬细胞免疫功能的调节作 用。方法：在体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞中加入不同浓度白头翁糖 蛋白后，观察其对巨噬细胞吞噬功能、一氧化氮合成和白介素-1分泌的影响。结果：白头翁糖蛋白能在体外显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红 的作用，并可诱生巨噬细胞产生一氧化氮，对巨噬细胞分泌白介素-1亦有一定的提高作用 。结论：白头翁糖蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞有免疫增强作用。
中图分类号 R282.71； Q513.2
The Immune-enhancing Effect of PcG-A--a Glycoprotein Isolated f rom Dried Root
, http://www.100md.com
of Pulsatilla Chinensis(Bunge) Regel
Dai Ling Wang Hua Chen Yan
(College of Life Science,Anhui University Hefei 230039)
Abstract Purpose：The aim is to study the modulation effects of PcG-A on immune function of macrophages.Methods:By adding different concentra tion of PcG-A into cultured mice peritoneal macrophages in vitro, the influ ence of PcG-A on macrophage immune function was observed by detecting phagocy tosis,nitric oxide synthesis and IL-1 secretion.Results:PcG-A coul d significantly increase phagocytic activity and NO release of Mφ had som e positive effect on LPS induced IL-1 production.Conclusion:PcG-A can enhance the immune function of macrophages.
, 百拇医药
Key words Pulsatilla Chinensis, Glycoprotein, Macrophage, I mmune enhancement
中药白头翁为多年生草本植物白头翁[Pulsatilla Chinensis(Bunge)Regel]的干燥根 ，功效清热解毒，为中医临床治痢要药。白头翁糖蛋白是从中药白头翁根的水提取液中分离纯化得到的均一糖蛋白组分。本文研究了 该白头翁糖蛋白组分(PcG-A)对小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)免疫功能的影响。
1 材 料
PcG-A由市售中药白头翁经水浸提，醇析，过柱，浓缩，冷冻干燥等步骤制得[1] 。呈白色粉状，分子量6.25×104，糖含量61.8%，由木糖和葡萄糖组成，摩尔比1 .5∶1，并含10种氨基酸。用 RPMI 1640培养基配成一定浓度，过滤除菌，置冰箱保存备用 。
, http://www.100md.com
昆明种小鼠，6～8周龄，18～22g，雌雄不限，安徽医科大学实验动物中心。
RPMI 1640，Gibco产品；ConA、N-1-萘乙二胺盐酸盐、LPS，Sigma公司；MTT，Fluka ；其余试剂均为国产分析纯。
2 方 法
2.1 小鼠腹腔Mφ制备
昆明种小鼠，腹腔注射1%淀粉溶液2 ml/只，2 d后断颈处死，无菌冰浴收集腹腔渗出细胞。 按常规制备Mφ单层。
2.2 Mφ吞噬中性红试验[2]
取2.1项制备的96孔板Mφ单层，加入用RPMI 1640完全培养基稀释的含有不同浓度PcG-A 的溶液0.1 ml/孔，CO2培养箱培养22 h，然后向每孔加入0.1%的中性红生理盐水液，继续 培养20 min，倾去上清液，用温PBS洗3遍，每孔加入细胞溶解液(乙酸∶无水乙醇=50∶50) 0.2 ml，室温下放置2～3 h，待细胞溶解后，即在酶标仪上测波长540 nm处的吸收度A 。不加糖，加培养基作为对照组。
, 百拇医药
2.3 NO诱生量的测定
用亚硝酸盐测定法[3]。NO的生成以测定培养上清中NO2-的含量为指标，后者 为NO的氧化物。Mφ单层加入不同浓度含白头翁糖蛋白溶液后，置CO2培养箱培养24 h， 然后取上清50 μl至另一培养板，加Griess试剂(1%对氨基苯磺酸、0.1%N-1-萘乙 二胺盐酸盐、2.5%H3PO4)50 μl ，室温10 min，在波长540 nm测定吸收度A。 以亚硝酸钠同样操作作出标准曲线，求出NO2-的含量。
2.4 白介素-1(IL-1)的诱生与检测[4]
24孔板Mφ单层，分别加入不同浓度的PcG-A和LPS(终浓度6 μg/ml)，总体积1 ml，CO 2孵箱中培养6 h后，吸去含药物的培养液，用温RPMI 1640培养液洗3次，换等量含10%小牛 血清的RPMI 1640完全培养基继续培养至48 h，收集上清-20℃冻存待测IL-1活性。
, http://www.100md.com
IL-1活性测定用胸腺细胞增殖法。在96孔平底培养板中，每孔加入不同稀释度的IL-1待测 品0.1 ml，ConA-胸腺细胞0.1 ml(细胞浓度1×107/ml,ConA终浓度2 μg/ml)，37 ℃，CO2培养箱培养，以MTT比色法测胸腺细胞增殖。
所有数据均用t检验分析组间差异。
3 结果与讨论
3.1 Pc G-A对小鼠腹腔Mφ吞噬中性红的影响
从表1中可见，在所用的各种浓度，PcG-A均有较强的促Mφ吞噬中性红的作用。
表1 PcG-A对小鼠腹腔Mφ吞噬中性红的影响(n=3,x -±s) PcG-A终浓度(μg/ml)
, http://www.100md.com
A值
30
0.696±0.0781
60
0.890±0.1802
120
0.831±0.0902
240
0.931±0.1182
480
0.722±0.0552
, 百拇医药
对照组
0.413±0.098
与对照组比较：1 P<0.05，2 P<0.01
3.2 PcG-A诱导Mφ生成NO
PcG-A对Mφ有很强的诱生NO的作用(见表2)。在所选用的各种PcG-A浓度，各给药组和对 照组比较均有显著差异。
表2 PcG-A对小鼠腹腔Mφ产生NO的影响(n=3,x- ±s) PcG-A终浓度(μg/ml)
NO-2 (nmol/)L
, 百拇医药 30
142±141
60
135±131
120
150±162
240
156±152
对照组
100±9
与对照组比较：1 P<0.05，2 P<0.01
, 百拇医药
3.3 不同剂量的PcG-A对LPS诱导Mφ产生IL-1的影响
表3所列结果为待测上清作1∶20稀释时所测得。结果表明，PcG-A对亚适剂量的LPS(6 μg/ ml)诱导Mφ产生IL-1具有一定的促进作用。和LPS组比较，PcG-A在浓度≥240 μg/ml时 差异有统计学意义，而在较低浓度时对Mφ分泌IL-1的能力有增高趋势，但无统计学差异 。
表3 PcG-A对小鼠Mφ分泌IL-1的影响(n=4,x-±s ) PcG-A终浓度(μg/ml)
IL-1(A值)
30
0.785±0.058
, 百拇医药 60
0.830±0.038
120
0.863±0.110
240
0.887±0.0391
480
0.913±0.0701
LPS(6 μg/ml)
0.777±0.0752
对照组
, http://www.100md.com
0.608±0.024
与LPS组比较：1 P<0.05；与对照组比较：2 P<0.01
Mφ是一具有多种功能的免疫细胞，在机体的特异性和非特异性免疫反应中发挥重要功能 。激活的Mφ表现出吞噬能力的加强并分泌大量介质，包括细胞因子，反应性氮介质及反 应性氧介质，从而发挥抗微生物，抗肿瘤，参与炎症反应等作用。
本结果表明从白头翁中提取的PcG-A，可在体外进一步增强小鼠腹腔Mφ吞噬功 能，刺激Mφ合成NO，对LPS诱导的IL-1产生也有促进作用。
安徽省自然科学基金资助项目
参考文献
, 百拇医药
1，陈彦，李一琨，包森林，等.白头翁糖蛋白的分离纯化及其性质.中国生化药物杂 志，1997，18(4)∶180～183
2，王晓京，丁桂风，范少光.几种阿片肽及ACTH对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作 用.中国免疫学杂志，1987，3(4)∶211～213
3，包建军，邢嵘，丁丽华，等.一氧化氮与活化的小鼠腹腔巨噬细胞细胞毒作用关 系的研究.上海免疫学杂志，1998，18(5)∶283～286
4，杨贵贞主编.免疫生物工程纲要与技术.长春∶吉林科学技术出版社，1991∶21
收稿日期 1999-10-01
修回日期 1999-12-26, 百拇医药