冷冻异体骨膜引导骨组织再生的实验研究
作者：刘希云 周丛豪 娄铁尘 李志华
单位：刘希云(铁道部北京铁路总医院口腔科 100038)；周丛豪(铁道部北京铁路总医院口腔科 100038)；娄铁尘(首都医科大学附属北京口腔医院病理科)；李志华(铁道部北京铁路总医院口腔科 100038)
关键词：移植；同种；骨膜；引导组织再生
中华口腔医学杂志000521 【摘要】 目的 探讨用冷冻异体骨膜作为引导骨组织再生膜的可能性。方法 取兔颅骨顶部骨膜经冷冻处理，在31只日本大耳白兔的下颌骨造成两处骨缺失，采取同体对照，一处表面覆盖冷冻异体骨膜，另一处不覆盖。分别在第4、8、12、16周处死动物，行X线及组织学观察。结果 冷冻异体骨膜不产生排斥反应，可在体内维持8～12周，具有良好的阻挡纤维组织长入骨创面、分隔不同细胞及引导组织再生的功效。结论 冷冻异体骨膜是一种理想的引导骨组织再生膜。
, 百拇医药
Experiment study of guiding bone tissue regeneration by frozen homologous periosteum
LIU Xiyun
(Department of Stomatology, Beijing Railway General Hospital，Beijing 100038，China)
ZHOU Conghao, LOU Tiechen ,et al.
【Abstract】 Objective Explores the feasibility of guiding bone tissue regeneration by frozen homologous periosteum. Methods Rabbit's cranial periosteum was taken and refrigerated . In thirty-one white Japanese big ear rabbits,defects of the mandible were created . Defect at one side was covered with the membrane, another side not. The rabbits were sacrificed on four, eight, twelve, sixteen weeks.Specimens were examined by naked eye, X-ray, and histology. Results The frozen homologous periosteummet the requirement of guiding bone tissue regeneration There was no rejection, and could be kept 8 for 12 weeks in the body.It had the favorable efficacy of obstructing the fiber tissue from filling into bone defects and had an efficacy of guiding bone tissue regeneration. Conclusions Frozen homologous periosteum is a perfect guiding bone tissue regeneration membrane.
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【Key words】 Transplantation，homologous； Periosteum； Guide tissue regeneration
自1976年Melcher[1]在牙周病手术中提出了引导组织再生(guided tissue regenration ,GTR)概念以来，国内外学者一直在寻求取材、制备简便，手术操作简单，引导组织再生效果好的引导组织再生材料。我们将异体骨膜经深冷冻处理去除其抗原性后，进行组织学研究，并将其作为引导组织再生膜进行实验研究，为将冷冻异体骨膜作为引导组织再生膜应用于临床奠定理论基础。
材料与方法
1.材料制备：将健康日本大耳白兔处死后取颅骨顶部骨膜，以生理盐水反复漂洗，拭干置于75%乙醇中浸泡脱脂，然后放置于液态氮(-196℃)中冷冻10 min，取出待自然解冻，反复3次，处理完毕后将其放置于无菌器皿中储存于低温冰箱内(-60℃)保存备用。
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上述骨膜在处理后行肉眼、光镜检查，观察处理前后变化情况。
2.动物实验：取日本大耳白兔31只随机分成两组。一组在其下颌骨右侧打2个直径7.5 mm颊舌向贯通孔，前孔为实验孔，后孔为对照孔，实验孔颊舌侧均覆盖经冷冻处理的骨膜作为组织引导再生膜(guided tissue regeneration membrance，GTRM)，用瞬康医用胶(河南省永城科技实验厂生产)将膜与骨面有效粘接，对照孔不做此处理，缝合肌肉及皮肤。另一组在下颌骨左右侧下缘分别切除1 cm×0.5 cm×0.5 cm的骨块，形成部分骨缺失，下颌骨右侧缺失处覆盖经冷冻处理的骨膜作为GTRM，用瞬康医用胶将膜与骨面有效粘接，对照侧不做此处理，缝合肌肉及皮肤。为防止自身骨膜产生的成骨作用的影响，我们将实验区的骨膜剪除。两组动物分别分为4组，第1组4周处死，第2组8周处死，第3组12周处死，第4组16周处死。进行肉眼、X线及组织学观察，比较冷冻异体骨膜覆盖与空白对照区的骨修复时间、修复方式和最终结果。通过组织学观察确定活体组织对冷冻异体骨膜的反应，通过肉眼及组织学观察异体骨膜的降解时间。
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结果
一、冷冻骨膜在体内的变化及其引导骨组织再生的作用
1.经冷冻处理的骨膜：其外观、颜色、韧性与未处理的骨膜无明显变化。光镜下冷冻骨膜纤维细胞无水肿变性、无纤维断裂(图1)，与未经冷冻处理的骨膜无明显差别。
2.4周标本：引导膜的形态较完整、界限较清晰，引导膜与骨面及周围软组织成为一体，不易揭起。镜下见引导膜纤维完整，与肌肉组织融合，膜周围无炎症细胞浸润(图2)，表明该膜无抗原性。可见膜下大量成骨。
3.8周标本：可见明显的引导膜，外观已不完整，其边界不清晰，膜明显变薄，膜下骨表面可见略突起的新生骨质，骨表面较粗糙。光镜下见膜已开始降解，可见纤维水肿、断裂、疏松，血管长入，引导膜下成骨。
4.12周标本：看不到引导膜，其附着位置已被正常骨膜代替，并与周围骨膜延续。镜下见引导膜已完全降解，仅见少许残片，新骨膜已形成。
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5.16周标本：肉眼及镜下均见不到引导膜。
二、实验区及对照区的成骨差异
1.4周标本:仍可看到实验区打孔或方块切除区的轮廓，但骨表面平整，探之质地硬但可刺穿。光镜下，实验区骨表面已长平，形成骨桥连接，其下方骨小梁已连成片，向深部长入(图3)，可见明显的指状突起表现，骨小梁边缘可见大量成排的成骨细胞(图4)。对照区打孔区或方块切除区轮廓清晰，表面明显凹陷，色暗，探之明显软于实验区。光镜下见打孔区表面凹陷，有纤维组织长入。其下方成骨量明显少于实验区，且骨小梁较实验区细小。
2.8周标本：实验打孔区或方块切除区界限不清，仍可见明显骨切除迹象，引导膜下新生骨质明显，表面明显突起,形成与引导膜形态一致的新生骨质，探之质地硬。光镜下见表面骨增厚形成皮质骨，可见哈佛系统，引导膜下方宿主骨表面新骨生成，其下方骨小梁增粗，骨髓腔开始改建。对照区见打孔及方块切除区域表面凹陷、粗糙、无明显骨质新生现象，探之质地略硬。镜下见骨表面凹陷，皮质骨连续，但较薄，深面成骨较少。
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3.12周标本：实验区骨表面平整，略粗糙。对照区表面仍有凹陷。光镜下见实验区皮质骨板增厚，渐趋成熟，哈佛系统明显增多，骨髓腔改建。对照区表面仍有凹陷，皮质骨形成差。
4.16周标本：实验区骨表面平坦、光滑，与周围骨无界限。但对照区表面仍凹陷。光镜下观察见实验区皮质骨已基本成熟，哈佛系统明显，新旧骨界限已不清，只能从骨细胞的排列方向区分之。对照区骨板成熟程度明显差于实验区。
三、X线片观察
4周、8周时，实验侧骨缺损处密度较对照侧高；12周时实验侧骨密度明显增高，对照侧部分增高；16周时实验侧骨密度与周围骨密度界限不清，基本一致，对照侧仍可见低密度区。
图1 经冷冻处理的兔颅顶部骨膜镜下观纤维粗大，细胞成分少，无血管。处理前、后组织像无明显差异(HE ×132)
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图2 4周实验膜 可见引导膜与肌组织完全溶为一体未见炎症(无排斥反应)，有血管长入(HE ×33)
图3 4周实验组实验区形成的骨桥平坦、无凹陷，且骨小梁较粗大，深部可见大量新骨形成。新骨与宿主骨可见镶嵌线(↑)(HE ×13.2)
图4 4周实验组 指状突起，表面可见成骨细胞(↑)(HE ×132)
讨论
引导性组织再生的基本原理是用外科手术方法放置一物理屏障用于分隔不同的组织，它的主要目的是建立能使生物再生功能得到最大程度发挥的有利环境[2]。开始，学者们将这种隔膜置于牙根表面和牙龈之间，作用主要有两方面：防止不利于牙周组织生长的牙龈上皮细胞、纤维组织在牙根表面聚集；使有利于牙周组织的牙周韧带细胞在牙根表面聚集生长[3]。逐渐这一方法引伸至其他方面，1989年Dahlin等[4]将GTRM技术引入种植术，一些学者将植骨表面覆盖GTRM，防止植入骨的吸收等，开辟了GTRM广泛的应用前景。
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GTRM主要分为两大类[5]：非降解性生物膜和可降解性生物膜。GTRM多为化学合成或从动物组织中提取，方法复杂，价格昂贵。为寻找来源丰富、价格低廉、处理方法简单的新的膜性材料， 有学者用冻干异体硬脑膜修复硬脑膜缺损，效果满意。国外有人已将冻干异体硬脑膜作为GTRM应用，经冻干处理的人体硬脑膜韧性好，无排斥反应，不与组织粘连[6]。国内学者以硬脑膜为材料，用超低温冷冻的方法去除抗原成分，进行引导骨组织再生的实验和临床研究[7]，取得了成功。
Scantlebury[8]总结了1982～1992年膜材料的研究进展,提出了GTRM材料应具备5个关键指标：①生物相容性好；②具有良好的机械屏障作用,分隔不同细胞；③在被修复的组织面与膜之间能保持一定空间(要求膜应具有一定的厚度及机械强度防止塌陷)；④能与组织结合，保证在组织中位置稳定；⑤具有临床可操作性。
为了开辟更广泛的引导组织再生应用材料，本研究尝试采用液态氮冷冻异体骨膜做为GTRM，其取材方便，制备简便。异体骨膜为致密的纤维结缔组织所构成，具有良好的韧性和理想的厚度。经组织学检查表明冷冻处理的骨膜仍保留完整的骨膜组织形态结构，它能起到确实的屏障作用，骨细胞得以优先长入骨缺损区。其本身为生物体的一部分，可被机体吸收降解，实验证实，膜可在体内保持8～12周，12周标本镜下还可见膜的残片，达到了可吸收性GTRM在体内保存6～8周后吸收的要求[9]。机体对膜无排异反应，膜与组织结合紧密，周围无炎细胞浸润，提示经液氮冷冻处理的骨膜达到了有效消除抗原的目的，移植后不产生排斥反应，配合瞬康医用胶的应用，使之操作简便易行，从而完全达到了上述5项要求。
, 百拇医药
观察结果提示，骨膜作GTRM有明显的阻挡纤维组织长入骨创面的作用。观察实验侧8～12周的标本，凡是引导膜覆盖区的骨面，均可见与引导膜外观形态一致的新生骨质，镜下可见引导膜下宿主骨表面有明显的新骨生成，提示冷冻异体骨膜除有阻挡纤维组织长入骨创面以外，还有明显的引导新骨生成的作用，其作用优于一般引导膜。
本实验为GTRM开创了新的有利用价值的材料来源，配合瞬康医用胶的应用，此膜将在即刻种植义齿、牙周病骨缺损等方面有较好的应用前景。
参考文献
1，Melcher AH.On the repair potential of periodontal tissues. J Periodontol, 1976,47：256-260.
2，Hardwick R.Devices for dentoalveolar regeneration:an up-to-date literature review. J Periodontol， 1995，66:495-505.
, 百拇医药
3，Raul G . Guided tissue regeneration : comparison of bioabsorbable and non-bioabsorbable membrans. histologic and histometric study in dogs.J Periodontol ，1994，65: 583-592.
4，Dahlin C, Sennerby L, Lekholm U,et al. Generation of new bone around titanium implants using a membrane technique: an experimental study in rabbits, Int J Oral Maxillofac Implants, 1989, 40:19-25.
5，张浩. 引导性组织再生膜材料的研究进展.国外医学生物学工程分册，1997，20:21-23.
, 百拇医药
6，周晓平,赵孟尧.冻干人体硬脑膜移植的实验研究和临床应用.中华实验外科杂志，1992，9：4.
7，周先略,李祖兵.冷冻异体硬脑膜引导骨组织再生的动物及在口腔种植中的临床应用研究.中国口腔种植学杂志, 1998，3:156-160.
8， Scantlebury TV.1982～1992: a decade of technoloy development for guided tissue regeneration. J Periodontol ,1993,64 (11 Suppl):1129-1137.
9，Meffert RM ,lenger B, Fritz ME. Dental implants: a review .J Periodontol ,1992, 63 : 859.
(收稿日期：2000-03-15), 百拇医药
单位：刘希云(铁道部北京铁路总医院口腔科 100038)；周丛豪(铁道部北京铁路总医院口腔科 100038)；娄铁尘(首都医科大学附属北京口腔医院病理科)；李志华(铁道部北京铁路总医院口腔科 100038)
关键词：移植；同种；骨膜；引导组织再生
中华口腔医学杂志000521 【摘要】 目的 探讨用冷冻异体骨膜作为引导骨组织再生膜的可能性。方法 取兔颅骨顶部骨膜经冷冻处理，在31只日本大耳白兔的下颌骨造成两处骨缺失，采取同体对照，一处表面覆盖冷冻异体骨膜，另一处不覆盖。分别在第4、8、12、16周处死动物，行X线及组织学观察。结果 冷冻异体骨膜不产生排斥反应，可在体内维持8～12周，具有良好的阻挡纤维组织长入骨创面、分隔不同细胞及引导组织再生的功效。结论 冷冻异体骨膜是一种理想的引导骨组织再生膜。
, 百拇医药
Experiment study of guiding bone tissue regeneration by frozen homologous periosteum
LIU Xiyun
(Department of Stomatology, Beijing Railway General Hospital，Beijing 100038，China)
ZHOU Conghao, LOU Tiechen ,et al.
【Abstract】 Objective Explores the feasibility of guiding bone tissue regeneration by frozen homologous periosteum. Methods Rabbit's cranial periosteum was taken and refrigerated . In thirty-one white Japanese big ear rabbits,defects of the mandible were created . Defect at one side was covered with the membrane, another side not. The rabbits were sacrificed on four, eight, twelve, sixteen weeks.Specimens were examined by naked eye, X-ray, and histology. Results The frozen homologous periosteummet the requirement of guiding bone tissue regeneration There was no rejection, and could be kept 8 for 12 weeks in the body.It had the favorable efficacy of obstructing the fiber tissue from filling into bone defects and had an efficacy of guiding bone tissue regeneration. Conclusions Frozen homologous periosteum is a perfect guiding bone tissue regeneration membrane.
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【Key words】 Transplantation，homologous； Periosteum； Guide tissue regeneration
自1976年Melcher[1]在牙周病手术中提出了引导组织再生(guided tissue regenration ,GTR)概念以来，国内外学者一直在寻求取材、制备简便，手术操作简单，引导组织再生效果好的引导组织再生材料。我们将异体骨膜经深冷冻处理去除其抗原性后，进行组织学研究，并将其作为引导组织再生膜进行实验研究，为将冷冻异体骨膜作为引导组织再生膜应用于临床奠定理论基础。
材料与方法
1.材料制备：将健康日本大耳白兔处死后取颅骨顶部骨膜，以生理盐水反复漂洗，拭干置于75%乙醇中浸泡脱脂，然后放置于液态氮(-196℃)中冷冻10 min，取出待自然解冻，反复3次，处理完毕后将其放置于无菌器皿中储存于低温冰箱内(-60℃)保存备用。
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上述骨膜在处理后行肉眼、光镜检查，观察处理前后变化情况。
2.动物实验：取日本大耳白兔31只随机分成两组。一组在其下颌骨右侧打2个直径7.5 mm颊舌向贯通孔，前孔为实验孔，后孔为对照孔，实验孔颊舌侧均覆盖经冷冻处理的骨膜作为组织引导再生膜(guided tissue regeneration membrance，GTRM)，用瞬康医用胶(河南省永城科技实验厂生产)将膜与骨面有效粘接，对照孔不做此处理，缝合肌肉及皮肤。另一组在下颌骨左右侧下缘分别切除1 cm×0.5 cm×0.5 cm的骨块，形成部分骨缺失，下颌骨右侧缺失处覆盖经冷冻处理的骨膜作为GTRM，用瞬康医用胶将膜与骨面有效粘接，对照侧不做此处理，缝合肌肉及皮肤。为防止自身骨膜产生的成骨作用的影响，我们将实验区的骨膜剪除。两组动物分别分为4组，第1组4周处死，第2组8周处死，第3组12周处死，第4组16周处死。进行肉眼、X线及组织学观察，比较冷冻异体骨膜覆盖与空白对照区的骨修复时间、修复方式和最终结果。通过组织学观察确定活体组织对冷冻异体骨膜的反应，通过肉眼及组织学观察异体骨膜的降解时间。
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结果
一、冷冻骨膜在体内的变化及其引导骨组织再生的作用
1.经冷冻处理的骨膜：其外观、颜色、韧性与未处理的骨膜无明显变化。光镜下冷冻骨膜纤维细胞无水肿变性、无纤维断裂(图1)，与未经冷冻处理的骨膜无明显差别。
2.4周标本：引导膜的形态较完整、界限较清晰，引导膜与骨面及周围软组织成为一体，不易揭起。镜下见引导膜纤维完整，与肌肉组织融合，膜周围无炎症细胞浸润(图2)，表明该膜无抗原性。可见膜下大量成骨。
3.8周标本：可见明显的引导膜，外观已不完整，其边界不清晰，膜明显变薄，膜下骨表面可见略突起的新生骨质，骨表面较粗糙。光镜下见膜已开始降解，可见纤维水肿、断裂、疏松，血管长入，引导膜下成骨。
4.12周标本：看不到引导膜，其附着位置已被正常骨膜代替，并与周围骨膜延续。镜下见引导膜已完全降解，仅见少许残片，新骨膜已形成。
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5.16周标本：肉眼及镜下均见不到引导膜。
二、实验区及对照区的成骨差异
1.4周标本:仍可看到实验区打孔或方块切除区的轮廓，但骨表面平整，探之质地硬但可刺穿。光镜下，实验区骨表面已长平，形成骨桥连接，其下方骨小梁已连成片，向深部长入(图3)，可见明显的指状突起表现，骨小梁边缘可见大量成排的成骨细胞(图4)。对照区打孔区或方块切除区轮廓清晰，表面明显凹陷，色暗，探之明显软于实验区。光镜下见打孔区表面凹陷，有纤维组织长入。其下方成骨量明显少于实验区，且骨小梁较实验区细小。
2.8周标本：实验打孔区或方块切除区界限不清，仍可见明显骨切除迹象，引导膜下新生骨质明显，表面明显突起,形成与引导膜形态一致的新生骨质，探之质地硬。光镜下见表面骨增厚形成皮质骨，可见哈佛系统，引导膜下方宿主骨表面新骨生成，其下方骨小梁增粗，骨髓腔开始改建。对照区见打孔及方块切除区域表面凹陷、粗糙、无明显骨质新生现象，探之质地略硬。镜下见骨表面凹陷，皮质骨连续，但较薄，深面成骨较少。
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3.12周标本：实验区骨表面平整，略粗糙。对照区表面仍有凹陷。光镜下见实验区皮质骨板增厚，渐趋成熟，哈佛系统明显增多，骨髓腔改建。对照区表面仍有凹陷，皮质骨形成差。
4.16周标本：实验区骨表面平坦、光滑，与周围骨无界限。但对照区表面仍凹陷。光镜下观察见实验区皮质骨已基本成熟，哈佛系统明显，新旧骨界限已不清，只能从骨细胞的排列方向区分之。对照区骨板成熟程度明显差于实验区。
三、X线片观察
4周、8周时，实验侧骨缺损处密度较对照侧高；12周时实验侧骨密度明显增高，对照侧部分增高；16周时实验侧骨密度与周围骨密度界限不清，基本一致，对照侧仍可见低密度区。
图1 经冷冻处理的兔颅顶部骨膜镜下观纤维粗大，细胞成分少，无血管。处理前、后组织像无明显差异(HE ×132)
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图2 4周实验膜 可见引导膜与肌组织完全溶为一体未见炎症(无排斥反应)，有血管长入(HE ×33)
图3 4周实验组实验区形成的骨桥平坦、无凹陷，且骨小梁较粗大，深部可见大量新骨形成。新骨与宿主骨可见镶嵌线(↑)(HE ×13.2)
图4 4周实验组 指状突起，表面可见成骨细胞(↑)(HE ×132)
讨论
引导性组织再生的基本原理是用外科手术方法放置一物理屏障用于分隔不同的组织，它的主要目的是建立能使生物再生功能得到最大程度发挥的有利环境[2]。开始，学者们将这种隔膜置于牙根表面和牙龈之间，作用主要有两方面：防止不利于牙周组织生长的牙龈上皮细胞、纤维组织在牙根表面聚集；使有利于牙周组织的牙周韧带细胞在牙根表面聚集生长[3]。逐渐这一方法引伸至其他方面，1989年Dahlin等[4]将GTRM技术引入种植术，一些学者将植骨表面覆盖GTRM，防止植入骨的吸收等，开辟了GTRM广泛的应用前景。
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GTRM主要分为两大类[5]：非降解性生物膜和可降解性生物膜。GTRM多为化学合成或从动物组织中提取，方法复杂，价格昂贵。为寻找来源丰富、价格低廉、处理方法简单的新的膜性材料， 有学者用冻干异体硬脑膜修复硬脑膜缺损，效果满意。国外有人已将冻干异体硬脑膜作为GTRM应用，经冻干处理的人体硬脑膜韧性好，无排斥反应，不与组织粘连[6]。国内学者以硬脑膜为材料，用超低温冷冻的方法去除抗原成分，进行引导骨组织再生的实验和临床研究[7]，取得了成功。
Scantlebury[8]总结了1982～1992年膜材料的研究进展,提出了GTRM材料应具备5个关键指标：①生物相容性好；②具有良好的机械屏障作用,分隔不同细胞；③在被修复的组织面与膜之间能保持一定空间(要求膜应具有一定的厚度及机械强度防止塌陷)；④能与组织结合，保证在组织中位置稳定；⑤具有临床可操作性。
为了开辟更广泛的引导组织再生应用材料，本研究尝试采用液态氮冷冻异体骨膜做为GTRM，其取材方便，制备简便。异体骨膜为致密的纤维结缔组织所构成，具有良好的韧性和理想的厚度。经组织学检查表明冷冻处理的骨膜仍保留完整的骨膜组织形态结构，它能起到确实的屏障作用，骨细胞得以优先长入骨缺损区。其本身为生物体的一部分，可被机体吸收降解，实验证实，膜可在体内保持8～12周，12周标本镜下还可见膜的残片，达到了可吸收性GTRM在体内保存6～8周后吸收的要求[9]。机体对膜无排异反应，膜与组织结合紧密，周围无炎细胞浸润，提示经液氮冷冻处理的骨膜达到了有效消除抗原的目的，移植后不产生排斥反应，配合瞬康医用胶的应用，使之操作简便易行，从而完全达到了上述5项要求。
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观察结果提示，骨膜作GTRM有明显的阻挡纤维组织长入骨创面的作用。观察实验侧8～12周的标本，凡是引导膜覆盖区的骨面，均可见与引导膜外观形态一致的新生骨质，镜下可见引导膜下宿主骨表面有明显的新骨生成，提示冷冻异体骨膜除有阻挡纤维组织长入骨创面以外，还有明显的引导新骨生成的作用，其作用优于一般引导膜。
本实验为GTRM开创了新的有利用价值的材料来源，配合瞬康医用胶的应用，此膜将在即刻种植义齿、牙周病骨缺损等方面有较好的应用前景。
参考文献
1，Melcher AH.On the repair potential of periodontal tissues. J Periodontol, 1976,47：256-260.
2，Hardwick R.Devices for dentoalveolar regeneration:an up-to-date literature review. J Periodontol， 1995，66:495-505.
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3，Raul G . Guided tissue regeneration : comparison of bioabsorbable and non-bioabsorbable membrans. histologic and histometric study in dogs.J Periodontol ，1994，65: 583-592.
4，Dahlin C, Sennerby L, Lekholm U,et al. Generation of new bone around titanium implants using a membrane technique: an experimental study in rabbits, Int J Oral Maxillofac Implants, 1989, 40:19-25.
5，张浩. 引导性组织再生膜材料的研究进展.国外医学生物学工程分册，1997，20:21-23.
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6，周晓平,赵孟尧.冻干人体硬脑膜移植的实验研究和临床应用.中华实验外科杂志，1992，9：4.
7，周先略,李祖兵.冷冻异体硬脑膜引导骨组织再生的动物及在口腔种植中的临床应用研究.中国口腔种植学杂志, 1998，3:156-160.
8， Scantlebury TV.1982～1992: a decade of technoloy development for guided tissue regeneration. J Periodontol ,1993,64 (11 Suppl):1129-1137.
9，Meffert RM ,lenger B, Fritz ME. Dental implants: a review .J Periodontol ,1992, 63 : 859.
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