GAD预防NOD雌鼠胰岛炎机理研究——胰岛内NK细胞计数及其意义
作者：杨竹林 伍汉文 周智广 廖二元 杨文
单位：杨竹林(湖南医科大学第二附属医院，湖南长沙410011)；伍汉文 周智广 廖二元 杨文(湖南医科大学代谢与内分泌研究所)
关键词：非肥胖糖尿病鼠；胰岛；NK细胞；计数；免疫组化学；谷氨酸脱羧酶
现代康复000532
摘要 目的:研究自身抗原-谷氨酸脱羧酶(GAD)预防非肥胖糖尿病(NOD)雌鼠胰岛炎的作用及胰岛炎与NK细胞浸润的相互关系。方法：应用本室自制猪GAD组，腹腔注射于4周龄NOD雌鼠，对照组注射等量小牛血清(BSA组)，分别于19周龄、24周龄和47周龄处死。结果：同周龄GAD组胰岛炎发生程度和胰岛炎评分均数明显低于同周龄BSA组，其评分均数之间存在高度显著性差异(P<0.001)；同周龄GAD组胰岛内NK细胞计数阳性率明显低于同周龄BSA组，有高度显著性差异(P<0.001);胰岛炎分值与胰岛内NK细胞计数阳性率之间存在高度正相关(r="0.7713,P<"0.01)。结论：本室自制的猪GAD能预防NOD雌鼠胰岛炎的发生和抑制NK细胞浸润胰岛内的作用。
, 百拇医药
中图分类号 R587 文献标识码 A 文章编号 1007-5496(2000)05-0706-02
The study on preventing insulitis by glutamic acid decarboxylase (GAD)on no- obese diabetic (NOD) female mice— the count and significance of natural killer cell(NK cell)in the islet
YANG Zhu-lin
(Research Laboratory of Hepatobillary Diseases,The Second Affiliated Hospital of Hunan Medical University,Changsha 410011,China)
, 百拇医药
WU Han-wen
(Research Laboratory of Hepatobillary Diseases,The Second Affiliated Hospital of Hunan Medical University,Changsha 410011,China)
ZHOU Zhi-guang,et al.
(Research Laboratory of Hepatobillary Diseases,The Second Affiliated Hospital of Hunan Medical University,Changsha 410011,China)
Abstract Objective: To study the effects of preventing insulitis by GAD and the relationships between the insulitis and the NK cells in NOD female mice.Methods:Porcine GAD purified by our laboratory or BSA(control )was injected into peritonea of NOD female mice at the age of 4 week ,then were killed at 19 week,24 week and 47 week respectively.Results:The degrees of insulitis scoring mean of insulitis,and percentage means of NK cell were significantly lower in GAD group than in BSA group at the same age.The close positive correlations were found between the score of insulitis and the percentage of NK cell in the islets (correlation coefficient:r=0.7713,P<0.01).Conclusions :The porcine GAD purified by our laboratory could prevent insulitis and inhibit the infilitration of NK cell in the islets.
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Key words NOD mice;islet;natural killer cell;count;immohistochemistry； glutamic acid decarboxylase
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是一种遗传性I型糖尿病的啮齿动物模型，其发病机理为T细胞介导的胰岛β细胞进行性破坏和数量减少[1]。国外学者近年发现I型糖尿病自身抗原—谷氨酸脱羧酶(GAD)在预防NOD鼠胰岛炎及糖尿病发生中显示良好效果[2,3]。NK细胞在免疫调节中起重要作用，并参与自身免疫性疾病的发生发展[4]。本文应用病理形态学检查和免疫组化方法研究GAD预防NOD鼠胰岛炎的作用及其与胰岛内NK细胞计数的关系。
1 资料与方法
1.1 实验动物 NOD鼠从澳大利亚WEHI医学研究中心引进。所有小鼠在标准饲养环境下喂养，自由饮净化水及全价营养颗粒饮食。本实验采用的NOD雌鼠群落，在210d龄时糖尿病自然发病率约70%。
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1.2 动物实验 25只4周龄NOD雌鼠分成实验组和对照组.实验组即注射GAD组，共15只，每只鼠于4周龄腹腔内注射GAD2.4mu酶活性单位(100μl)，分别于19周龄(6只)、24周龄(4只)和47周龄(5只)处死。对照组即注射小牛血清组(BSA)，共10只，每只鼠于4周龄腹腔内注射BSAmg(100μl)，分别于19周龄(4只)和47周龄(6只)处死。处死NOD鼠按常规取下胰腺，将胰腺组织置10%中性福尔马林固定，按常规制作石蜡切片，切片厚4μm。
1.3 主要试剂 GAD由本所按文献方法制备[5]，将新鲜猪脑粗提，FPLC层析分离，收集GAD酶活性峰，本所制备的GAD含两种同功酶(GAD65和GAD67)，产品含蛋白10mg/ml,含GAD酶活性单位24mu/ml,比活为2.4mu/mg。BSA由上海第二医科大学生产。鼠抗人NK单克隆抗体(1/100)、生物素标记羊抗鼠lgG(1/300)和ABC试剂(1/500)均购自Simga公司；DABHcl由瑞士进口分装。
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1.4 方法 胰岛炎评分参照Guytingco和Tisch评分标准[6,7]，每只鼠胰切片2张(相隔50μm)在HE染色和高倍镜(HP)下随机计数10个胰岛炎分值，所得值0分示胰岛正常，1～2分示胰岛周围炎，3～4分示胰岛内炎。NK细胞染色方法为ABC免疫组化法，阳性细胞浆呈淡棕黄色至深棕黄色颗粒。以0.01mol/LPBS液(PH7.4)分别替代一抗、二抗或ABC试剂作为每次染色阴性对照；高倍光镜下每一切片中随机计数5个胰岛内每一胰岛的NK细胞数、胰岛炎分值及胰岛内细胞总数，胰岛内NK细胞计数阳性率=NK细胞阳性细胞数/胰岛细胞总数。统计学处理包括t检验、直接概率法及直线回归与相关分析。
2 结果
2.1 胰岛炎发生程度 19周龄鼠中，6只GAD组鼠均为胰岛周围炎，4只BSA组鼠1只为胰岛周围炎和3只为胰岛内炎，两者存在显著差异(P=0.0333)。24周龄鼠中，4只GAD组鼠3只为胰岛周围炎和1只为胰岛内炎，本组无BSA组鼠。47周龄鼠中，5只GAD组鼠中3只为胰岛周围炎和2只为胰岛内炎，6只BSA组鼠1只为胰岛周围炎和5只为胰岛内炎，两者无显著差异(P=0.197)。表1所示，GAD鼠胰岛炎评分均数明显低于同周龄BSA组鼠，均有高度显著差异(P<0.001)。
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表1 GAD组胰岛炎评分和NK细胞计数阳性率与BSA组比较(
±s) 分组
n
胰岛炎评分数
(n′=n×10)
NK细胞计
n′=n×5
19wGAD组
6
1.26±0.79
0.07±0.03
19wBSA组
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4
2.28±0.98**△△
0.12±0.057**△△
24wGAD组
4
1.23±0.89
0.07±0.03
47wGAD组
5
1.17±1.02
0.79±0.03
47wBSA组
, 百拇医药
6
2.53±1.07**△△
0.15±0.08**△△
注：与同周龄GAD组比较，**P<0.001,19周,47周BSA组与24周GAD组比较，△△P<0.001
2.2 胰岛内NK细胞计数 见表1，GAD组鼠胰岛内NK细胞数明显低于同周龄BSA组鼠，均有高度显著差异(P<0.001)；24周龄GAD组鼠胰岛内NK细胞计数阳性率也明显地低于19周龄、47周龄BSA组鼠，均有高度显著差异(P<0.001)。
2.3 胰岛炎分值与胰岛内NK细胞数的相关分析 通过直线相关与回归分析，胰岛炎分值与胰岛内阳性细胞数之间存在高度密切正相关(r=0.7713,P<0.01)其回归方程为：Y(NK细胞阳性率)=0.0309x(x为胰岛炎分值)+0.06186(常数)。
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3 讨论
I型糖尿病发病机理主要表现为自身免疫反应引起的胰岛β细胞进行性破坏。NOD雌鼠第5周龄起可自发出现自身免疫性胰岛炎，β细胞进行性破坏而发展成糖尿病，NOD鼠糖尿病与人类I型糖尿病有许多相似之处，适用于作为人类I型糖尿病病因病理及预防研究探讨的动物模型[1,2,3,7]。GAD为一种胰岛β细胞自身抗原，在人类和NOD鼠I型糖尿病发生中起重要作用。近年发现GAD65能抑制自主性T细胞对GAD65和其肽类的增殖反应，阻止NOD鼠胰岛炎和糖尿病的发生[2,3,5]。Elliott等给4周龄NOD鼠腹腔注射100μgGAD67也能预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病发生[3]。本文发现GAD组NOD雌鼠胰岛炎发生程度和胰岛炎评分均数明显地低于BSA组鼠，其结果与国外文献报道一致，GAD能明显减轻NOD雌鼠胰岛炎发生。说明通过诱导对GAD的免疫耐受能减轻NOD鼠胰岛炎，从而可预防糖尿病发生，为人类预防和治疗I型糖尿病提供了一条新途径。
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NK细胞是与T、B细胞不同的另一类杀伤细胞，具有抗肿瘤、抗感染和参与免疫调节作用，NK细胞是一类重要免疫调节细胞，它对B细胞、T细胞等功能均有调节作用，且通过释放淋巴因子对免疫应答进行调节[4]。GAD预防NOD鼠胰岛炎是否与NK细胞胰岛内浸润有关未见文献报道。本文发现GAD组鼠胰岛内NK细胞数明显地低于BSA组鼠，且NOD鼠胰岛炎分值与胰岛内NK细胞数呈高度正相关，说明NK细胞可能通过免疫调节及杀伤细胞作用参与了胰岛内β细胞破坏，GAD可能抑制NK细胞胰岛内浸润，从而保护β细胞免遭破坏，这可能是GAD预防NOD鼠胰岛炎和糠尿病发生的作用机理之一，但需进一步研究。
基金项目国家自然科学基金资助项目(39370343);湖南省中青年科技基金资助。
作者简介 杨竹林(1962-)，男，湖南人，博士。研究方向：消化系统疾病基础研究。
参考文献
, http://www.100md.com
[1]Signor A,Pozzilli P,Gale EMA,et al .The natural history of lymphocyte subsets infilitrating the pancreas of NOD mice[J].Diabetlolgia,1989,32: 282
[2]Tian J,Atkinoson MA,Clare-salzler M,et al.Nasal administration of glutamate decarboxylase(GAD)petides induce Th2 response and prevents murine insulin-dependent diabetes[J].J Exp Med,1996,183:1 561
[3]Elliot GF,Qin HY,Bhatti S,et al.Immunization with the larger isoform of mouse glutamic acid decarboxylase(GAD67)prevents autoimmune dia betes is NOD mice[J].Diabetes,1994,43:1 494
, 百拇医药
[4]毕爱华.医学免疫学[M].武汉：同济医科大学出版社，1986.82
[5]Nathan B,Hsu CC J.Puriffication and charactrization of a novel form of brain glutamate decarboxylase:A Ca 2+ dependent perpheral membran protein[J].J Biol Chem,1994,269:7 249
[6]Guytingco R， Quddus J,Richarclson B,et al.Single administration or bacillus calmette-guer in (BCG)vaccine in non-obese diabetic(NOD)mice results in supression of in vitrot lymphocyte proliferation,and regression of insulitis[J].Diabetes,1991,40:152
[7]Tisch R,Yang XD,Singer SM,et al.Immune response to glutamic acid decarboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic mice[J]. Nature,1993,366:72
(收稿：2000-04-01), http://www.100md.com
单位：杨竹林(湖南医科大学第二附属医院，湖南长沙410011)；伍汉文 周智广 廖二元 杨文(湖南医科大学代谢与内分泌研究所)
关键词：非肥胖糖尿病鼠；胰岛；NK细胞；计数；免疫组化学；谷氨酸脱羧酶
现代康复000532
摘要 目的:研究自身抗原-谷氨酸脱羧酶(GAD)预防非肥胖糖尿病(NOD)雌鼠胰岛炎的作用及胰岛炎与NK细胞浸润的相互关系。方法：应用本室自制猪GAD组，腹腔注射于4周龄NOD雌鼠，对照组注射等量小牛血清(BSA组)，分别于19周龄、24周龄和47周龄处死。结果：同周龄GAD组胰岛炎发生程度和胰岛炎评分均数明显低于同周龄BSA组，其评分均数之间存在高度显著性差异(P<0.001)；同周龄GAD组胰岛内NK细胞计数阳性率明显低于同周龄BSA组，有高度显著性差异(P<0.001);胰岛炎分值与胰岛内NK细胞计数阳性率之间存在高度正相关(r="0.7713,P<"0.01)。结论：本室自制的猪GAD能预防NOD雌鼠胰岛炎的发生和抑制NK细胞浸润胰岛内的作用。
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中图分类号 R587 文献标识码 A 文章编号 1007-5496(2000)05-0706-02
The study on preventing insulitis by glutamic acid decarboxylase (GAD)on no- obese diabetic (NOD) female mice— the count and significance of natural killer cell(NK cell)in the islet
YANG Zhu-lin
(Research Laboratory of Hepatobillary Diseases,The Second Affiliated Hospital of Hunan Medical University,Changsha 410011,China)
, 百拇医药
WU Han-wen
(Research Laboratory of Hepatobillary Diseases,The Second Affiliated Hospital of Hunan Medical University,Changsha 410011,China)
ZHOU Zhi-guang,et al.
(Research Laboratory of Hepatobillary Diseases,The Second Affiliated Hospital of Hunan Medical University,Changsha 410011,China)
Abstract Objective: To study the effects of preventing insulitis by GAD and the relationships between the insulitis and the NK cells in NOD female mice.Methods:Porcine GAD purified by our laboratory or BSA(control )was injected into peritonea of NOD female mice at the age of 4 week ,then were killed at 19 week,24 week and 47 week respectively.Results:The degrees of insulitis scoring mean of insulitis,and percentage means of NK cell were significantly lower in GAD group than in BSA group at the same age.The close positive correlations were found between the score of insulitis and the percentage of NK cell in the islets (correlation coefficient:r=0.7713,P<0.01).Conclusions :The porcine GAD purified by our laboratory could prevent insulitis and inhibit the infilitration of NK cell in the islets.
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Key words NOD mice;islet;natural killer cell;count;immohistochemistry； glutamic acid decarboxylase
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是一种遗传性I型糖尿病的啮齿动物模型，其发病机理为T细胞介导的胰岛β细胞进行性破坏和数量减少[1]。国外学者近年发现I型糖尿病自身抗原—谷氨酸脱羧酶(GAD)在预防NOD鼠胰岛炎及糖尿病发生中显示良好效果[2,3]。NK细胞在免疫调节中起重要作用，并参与自身免疫性疾病的发生发展[4]。本文应用病理形态学检查和免疫组化方法研究GAD预防NOD鼠胰岛炎的作用及其与胰岛内NK细胞计数的关系。
1 资料与方法
1.1 实验动物 NOD鼠从澳大利亚WEHI医学研究中心引进。所有小鼠在标准饲养环境下喂养，自由饮净化水及全价营养颗粒饮食。本实验采用的NOD雌鼠群落，在210d龄时糖尿病自然发病率约70%。
, 百拇医药
1.2 动物实验 25只4周龄NOD雌鼠分成实验组和对照组.实验组即注射GAD组，共15只，每只鼠于4周龄腹腔内注射GAD2.4mu酶活性单位(100μl)，分别于19周龄(6只)、24周龄(4只)和47周龄(5只)处死。对照组即注射小牛血清组(BSA)，共10只，每只鼠于4周龄腹腔内注射BSAmg(100μl)，分别于19周龄(4只)和47周龄(6只)处死。处死NOD鼠按常规取下胰腺，将胰腺组织置10%中性福尔马林固定，按常规制作石蜡切片，切片厚4μm。
1.3 主要试剂 GAD由本所按文献方法制备[5]，将新鲜猪脑粗提，FPLC层析分离，收集GAD酶活性峰，本所制备的GAD含两种同功酶(GAD65和GAD67)，产品含蛋白10mg/ml,含GAD酶活性单位24mu/ml,比活为2.4mu/mg。BSA由上海第二医科大学生产。鼠抗人NK单克隆抗体(1/100)、生物素标记羊抗鼠lgG(1/300)和ABC试剂(1/500)均购自Simga公司；DABHcl由瑞士进口分装。
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1.4 方法 胰岛炎评分参照Guytingco和Tisch评分标准[6,7]，每只鼠胰切片2张(相隔50μm)在HE染色和高倍镜(HP)下随机计数10个胰岛炎分值，所得值0分示胰岛正常，1～2分示胰岛周围炎，3～4分示胰岛内炎。NK细胞染色方法为ABC免疫组化法，阳性细胞浆呈淡棕黄色至深棕黄色颗粒。以0.01mol/LPBS液(PH7.4)分别替代一抗、二抗或ABC试剂作为每次染色阴性对照；高倍光镜下每一切片中随机计数5个胰岛内每一胰岛的NK细胞数、胰岛炎分值及胰岛内细胞总数，胰岛内NK细胞计数阳性率=NK细胞阳性细胞数/胰岛细胞总数。统计学处理包括t检验、直接概率法及直线回归与相关分析。
2 结果
2.1 胰岛炎发生程度 19周龄鼠中，6只GAD组鼠均为胰岛周围炎，4只BSA组鼠1只为胰岛周围炎和3只为胰岛内炎，两者存在显著差异(P=0.0333)。24周龄鼠中，4只GAD组鼠3只为胰岛周围炎和1只为胰岛内炎，本组无BSA组鼠。47周龄鼠中，5只GAD组鼠中3只为胰岛周围炎和2只为胰岛内炎，6只BSA组鼠1只为胰岛周围炎和5只为胰岛内炎，两者无显著差异(P=0.197)。表1所示，GAD鼠胰岛炎评分均数明显低于同周龄BSA组鼠，均有高度显著差异(P<0.001)。
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表1 GAD组胰岛炎评分和NK细胞计数阳性率与BSA组比较(
±s) 分组n
胰岛炎评分数
(n′=n×10)
NK细胞计
n′=n×5
19wGAD组
6
1.26±0.79
0.07±0.03
19wBSA组
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4
2.28±0.98**△△
0.12±0.057**△△
24wGAD组
4
1.23±0.89
0.07±0.03
47wGAD组
5
1.17±1.02
0.79±0.03
47wBSA组
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6
2.53±1.07**△△
0.15±0.08**△△
注：与同周龄GAD组比较，**P<0.001,19周,47周BSA组与24周GAD组比较，△△P<0.001
2.2 胰岛内NK细胞计数 见表1，GAD组鼠胰岛内NK细胞数明显低于同周龄BSA组鼠，均有高度显著差异(P<0.001)；24周龄GAD组鼠胰岛内NK细胞计数阳性率也明显地低于19周龄、47周龄BSA组鼠，均有高度显著差异(P<0.001)。
2.3 胰岛炎分值与胰岛内NK细胞数的相关分析 通过直线相关与回归分析，胰岛炎分值与胰岛内阳性细胞数之间存在高度密切正相关(r=0.7713,P<0.01)其回归方程为：Y(NK细胞阳性率)=0.0309x(x为胰岛炎分值)+0.06186(常数)。
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3 讨论
I型糖尿病发病机理主要表现为自身免疫反应引起的胰岛β细胞进行性破坏。NOD雌鼠第5周龄起可自发出现自身免疫性胰岛炎，β细胞进行性破坏而发展成糖尿病，NOD鼠糖尿病与人类I型糖尿病有许多相似之处，适用于作为人类I型糖尿病病因病理及预防研究探讨的动物模型[1,2,3,7]。GAD为一种胰岛β细胞自身抗原，在人类和NOD鼠I型糖尿病发生中起重要作用。近年发现GAD65能抑制自主性T细胞对GAD65和其肽类的增殖反应，阻止NOD鼠胰岛炎和糖尿病的发生[2,3,5]。Elliott等给4周龄NOD鼠腹腔注射100μgGAD67也能预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病发生[3]。本文发现GAD组NOD雌鼠胰岛炎发生程度和胰岛炎评分均数明显地低于BSA组鼠，其结果与国外文献报道一致，GAD能明显减轻NOD雌鼠胰岛炎发生。说明通过诱导对GAD的免疫耐受能减轻NOD鼠胰岛炎，从而可预防糖尿病发生，为人类预防和治疗I型糖尿病提供了一条新途径。
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NK细胞是与T、B细胞不同的另一类杀伤细胞，具有抗肿瘤、抗感染和参与免疫调节作用，NK细胞是一类重要免疫调节细胞，它对B细胞、T细胞等功能均有调节作用，且通过释放淋巴因子对免疫应答进行调节[4]。GAD预防NOD鼠胰岛炎是否与NK细胞胰岛内浸润有关未见文献报道。本文发现GAD组鼠胰岛内NK细胞数明显地低于BSA组鼠，且NOD鼠胰岛炎分值与胰岛内NK细胞数呈高度正相关，说明NK细胞可能通过免疫调节及杀伤细胞作用参与了胰岛内β细胞破坏，GAD可能抑制NK细胞胰岛内浸润，从而保护β细胞免遭破坏，这可能是GAD预防NOD鼠胰岛炎和糠尿病发生的作用机理之一，但需进一步研究。
基金项目国家自然科学基金资助项目(39370343);湖南省中青年科技基金资助。
作者简介 杨竹林(1962-)，男，湖南人，博士。研究方向：消化系统疾病基础研究。
参考文献
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[1]Signor A,Pozzilli P,Gale EMA,et al .The natural history of lymphocyte subsets infilitrating the pancreas of NOD mice[J].Diabetlolgia,1989,32: 282
[2]Tian J,Atkinoson MA,Clare-salzler M,et al.Nasal administration of glutamate decarboxylase(GAD)petides induce Th2 response and prevents murine insulin-dependent diabetes[J].J Exp Med,1996,183:1 561
[3]Elliot GF,Qin HY,Bhatti S,et al.Immunization with the larger isoform of mouse glutamic acid decarboxylase(GAD67)prevents autoimmune dia betes is NOD mice[J].Diabetes,1994,43:1 494
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[7]Tisch R,Yang XD,Singer SM,et al.Immune response to glutamic acid decarboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic mice[J]. Nature,1993,366:72
(收稿：2000-04-01), http://www.100md.com