补阳还五汤对沙土鼠脑缺血后迟发性神经元坏死脑组织一氧化氮的影响
作者：刘志龙1 宋含平1 邓常青2 韩绍娟1
单位：1.广东省珠海市人民医院中医科，广东 珠海 519000；2.湖南中医学院
关键词：脑缺血；补阳还五汤；一氧化氮；迟发性神经元坏死；中医药
D:\xia2000\zgzxyjhjjzz\zgzx2000\0005\S16.htm 摘要：目的：研究补阳还五汤抗脑缺血后迟发性神经元坏死(DNN)作用与一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS) 的关系。方法：采用沙土鼠双侧颈总动脉夹闭脑缺血再灌注模型，于再灌注后48小时取前脑皮质测定NO和NOS。结果：缺血再灌注后48小时脑组织NO含量和NOS活性降低。腹腔注射补阳还五汤可增加缺血再灌注48小时后脑组织NO含量，提高NOS活性。结论：脑缺血后DNN与脑内NO的生成减少有一定的关系，补阳还五汤可能通过调节脑组织NO的生成而发挥抗脑缺血的作用。
, 百拇医药
中图分类号：R285.5;R363.2 文献标识码：A 文章编号：10089691(2000)05029502
Influences of Buyang Huanwu decoction(补阳还五汤)on nitric oxide in brain tissue of gerbils with delayed neuronal necrosis after ischemia LIU Zhilong,SONG Hanping,DENG Changqing,et al.Zhuhai People′s Hospital,Zhuhai Guangdong 519000
Abstract:Objective:To study the action of Buyang Huanwu decoction(BYHWD,补阳还五汤) on delayed neuronal necrosis (DNN) after cerebral ischemia and the relationship between nitric oxide(NO) and nitric oxide synthetase (NOS).Methods:Cerebral reperfusion models were built by clamping bilateral carotid arteries of gerbils NO and NOS of antecerebral cortex were detected 48 hours later.Results:About 48 hours after cerebral reperfusion,NO content and NOS activity were decreased.Injection of BYHWD into belly could increase NO content and NOS activity.Conclusions:DNN after cerebral ischemia is related to the decrease of NO.BYHWD may play an antiischemic role through modulating the generation of NO.
, 百拇医药
Key words:cerebral ischmia;Buyang Huanwu decoction;nitric oxide;delayed neuronal necrosis;traditional Chinese medicine
CLC number:R285.5;R363.2 Document code:A Artical ID:10089691(2000)05029502
基金项目：
广东省中医药管理局资助项目(No.98453)
作者简介：刘志龙(1963)，男(汉族)，湖南岳阳人，医学博士，副教授，硕士研究生导师，副主任医师。获省、市级科技进步奖各1项。
近来研究表明，在脑缺血再灌注后数日，会出现严重的继发性神经损伤，称之为迟发性神经元坏死(DNN)。因此，积极防治脑缺血后DNN为其重要的治疗措施〔1〕。补阳还五汤为治疗缺血性脑血管疾病的有效方剂，该方可对抗脑缺血再灌注损伤，具有抗氧自由基毒性，防止神经细胞内钙超负荷，调节脑内花生烯代谢等作用〔2，3〕。已有研究表明，一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)等与缺血性脑损伤的发生发展具有密切的关系，而有关该方对此影响的研究报道甚少。为此，本研究采用沙土鼠脑缺血再灌注损伤模型，研究该方的作用。报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 药物：补阳还五汤(黄芪60 g，当归9 g,川芎6 g，赤芍9 g，桃仁9 g，红花9 g，地龙9 g)由湖南中医学院药学分院制成注射剂，含生药1 000 g/L，使用时用生理盐水稀释成500 g/L。
1.2 动物：体重60～80 g清洁级蒙古沙土鼠，雌雄各半，卫生部上海生物制品研究所动物中心提供。
1.3 实验方法：沙土鼠随机分为假手术对照组(假手术组)、模型对照组(模型组)和补阳还五汤组。参照文献〔4〕方法制备模型。实验前12小时，补阳还五汤组腹腔注射补阳还五汤8 ml/kg(含生药4 g/kg),假手术组和模型组腹腔注射等量生理盐水，实验前15分钟再同前方法注射药物1次。于给药后15分钟，腹腔注射盐酸氯胺酮1.2 ml/kg(60 mg/kg)麻醉，分离两侧颈总动脉。除假手术组外，其余各组均以小动脉夹夹闭双侧颈总动脉造成脑缺血，缺血20分钟后松开动脉夹进行再灌注。假手术组不结扎双侧颈总动脉，其它操作与以上各组相同。缝合手术切口，继续饲养。再分别于再灌注后12、24和36小时同前腹腔注射药物1次。于再灌注后48小时将沙土鼠颈椎脱臼致死，迅速取脑置冰台上，在冰台上迅速分离双侧前脑皮质，以冰生理盐水冲洗去除残余后称重，加冰生理盐水在冰溶下制成10%脑匀浆液，于4 ℃离心(3 500 r/min)15分钟，分离上清液供测试用。
, 百拇医药
1.4 观察指标：脑匀浆液NO含量按重氮化反应法测定；NOS活性以分光光度法测定。药盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.5 统计学方法：结果以均数±标准差(
±s)表示，P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 对脑组织NO含量的影响：模型组脑组织NO含量明显低于假手术组；补阳还五汤组NO含量也较假手术组降低，但显著高于模型组(P均<0.01)。见表1。
2.2 对脑组织NOS活性的影响：模型组NOS活性显著低于假手术组；补阳还五汤组NOS活性明显升高，与假手术组之间差异无显著性意义(P>0.05)。见表1。
表1 各组NO和NOS的比较(±s)μmol/g 组别
, http://www.100md.com
动物数(只)
NO
NOS
假手术组
8
2.60±2.02
16.71±2.21
模型组
8
0.79±0.40△△
11.61±1.64△△
, http://www.100md.com
补阳还五汤组
8
1.33±0.77△△**
15.47±1.95**
注：与假手术组比较：△△P<0.01；与模型组比较：**P<0.013 讨 论
脑组织存在丰富的NOS，可产生NO。研究表明，固有型NOS(cNOS)在基础条件下起作用，产生的NO对脑循环起重要的调节作用；而诱导型NOS(iNOS)在基础条件下不起作用，在缺血时表达并产生高浓度的NO，从而加速能量消耗，损伤DNA，导致神经细胞死亡。在大鼠局灶性脑缺血模型，脑缺血早期(阻断大脑中动脉后5～10分钟)NO持续增加，至30分钟达峰值，之后逐渐降至正常，再灌注数分钟到40分钟又轻度增加，之后又恢复至正常水平〔5，6〕。给予NOS抑制剂NJ硝基L精氨酸甲酯(LNANE)或NJ硝基L精氨酸(LNNA)等明显减少大鼠局灶性脑缺血区血流量〔7〕。但也有研究表明，LNANE等可使局部脑梗死体积缩小，NOS抑制剂对脑缺血起到保护作用〔8〕。可见，NO既具有潜在的有益作用，又有不良反应，NO浓度升高主要发生在缺血早期，此时对神经细胞产生毒性作用，而在再灌注后期，NO对脑血流等具有有益的调节作用。本研究结果表明，在再灌注48小时后，脑组织NO含量降低，NOS活性降低，表明此时脑组织内NO合成受抑。补阳还五汤可对抗再灌注后期NO含量和NOS活性的降低，提示补阳还五汤通过提高NO的合成，发挥其对抗缺血性脑损伤的作用。但该方作用的具体环节还有待于进一步研究。
, 百拇医药
参考文献：
〔1〕冯亦璞.脑缺血病理生理及生化机制研究进展.见：陈维洲，陈修，苏定冯主编.心血管药理学进展.第1版.北京：人民卫生出版社，1995.90101.
〔2〕桑梅.爱维治注射液合补阳还五汤治疗脑梗死临床观察.中国中西医结合急救杂志，1999，6(1)：40.
〔3〕邓常青，刘志龙，葛金文，等.补阳还五汤抗脑缺血再灌注损伤作用机理的研究.中国中医基础医学杂志 ，1998，4(8)：3234.
〔4〕严翠芬，李麟仙，王子灿，等.沙土鼠短暂性脑缺血后海马迟发性神经元死亡机理的研究.中国病理生理杂志，1991，7(6)：605606.
〔5〕Malinski T,Bailey F,Zhang Z G,et al.Nitric oxide measured by a porphyrinic microsensor in rat brain after transient middle cerebral artery occlusion.J Cereb Blood Flow Metab,1993,13:355.
, http://www.100md.com
〔6〕Sato S,Tominga T,Ohnishi T,et al.Role of nitric Oxide in brain ischemia.Ann N Y Aca Sci,1994,738:369.
〔7〕Irikura K,Maynard K I,Moskowitz M A.Importance of nitric oxide synthase inhibition to the attenuated vascular responses induced by topical Lnitroarginine during vibrissal stimulation.J Cereb Blood Flow Metab,1994,14:45.
〔8〕Nishikawa T,Kirsch J R,Koehler R C,et al.Effect of nitric oxide synthase inhibition on cerebral blood flow and injury volume during ischemia in cats.Stroke,1993,24:1717.
(收稿日期：20000811 修回日期：20000917)
, 百拇医药(刘志龙1 宋含平1 邓常青2 韩绍娟1)
单位：1.广东省珠海市人民医院中医科，广东 珠海 519000；2.湖南中医学院
关键词：脑缺血；补阳还五汤；一氧化氮；迟发性神经元坏死；中医药
D:\xia2000\zgzxyjhjjzz\zgzx2000\0005\S16.htm 摘要：目的：研究补阳还五汤抗脑缺血后迟发性神经元坏死(DNN)作用与一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS) 的关系。方法：采用沙土鼠双侧颈总动脉夹闭脑缺血再灌注模型，于再灌注后48小时取前脑皮质测定NO和NOS。结果：缺血再灌注后48小时脑组织NO含量和NOS活性降低。腹腔注射补阳还五汤可增加缺血再灌注48小时后脑组织NO含量，提高NOS活性。结论：脑缺血后DNN与脑内NO的生成减少有一定的关系，补阳还五汤可能通过调节脑组织NO的生成而发挥抗脑缺血的作用。
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中图分类号：R285.5;R363.2 文献标识码：A 文章编号：10089691(2000)05029502
Influences of Buyang Huanwu decoction(补阳还五汤)on nitric oxide in brain tissue of gerbils with delayed neuronal necrosis after ischemia LIU Zhilong,SONG Hanping,DENG Changqing,et al.Zhuhai People′s Hospital,Zhuhai Guangdong 519000
Abstract:Objective:To study the action of Buyang Huanwu decoction(BYHWD,补阳还五汤) on delayed neuronal necrosis (DNN) after cerebral ischemia and the relationship between nitric oxide(NO) and nitric oxide synthetase (NOS).Methods:Cerebral reperfusion models were built by clamping bilateral carotid arteries of gerbils NO and NOS of antecerebral cortex were detected 48 hours later.Results:About 48 hours after cerebral reperfusion,NO content and NOS activity were decreased.Injection of BYHWD into belly could increase NO content and NOS activity.Conclusions:DNN after cerebral ischemia is related to the decrease of NO.BYHWD may play an antiischemic role through modulating the generation of NO.
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Key words:cerebral ischmia;Buyang Huanwu decoction;nitric oxide;delayed neuronal necrosis;traditional Chinese medicine
CLC number:R285.5;R363.2 Document code:A Artical ID:10089691(2000)05029502
基金项目：
广东省中医药管理局资助项目(No.98453)作者简介：刘志龙(1963)，男(汉族)，湖南岳阳人，医学博士，副教授，硕士研究生导师，副主任医师。获省、市级科技进步奖各1项。
近来研究表明，在脑缺血再灌注后数日，会出现严重的继发性神经损伤，称之为迟发性神经元坏死(DNN)。因此，积极防治脑缺血后DNN为其重要的治疗措施〔1〕。补阳还五汤为治疗缺血性脑血管疾病的有效方剂，该方可对抗脑缺血再灌注损伤，具有抗氧自由基毒性，防止神经细胞内钙超负荷，调节脑内花生烯代谢等作用〔2，3〕。已有研究表明，一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)等与缺血性脑损伤的发生发展具有密切的关系，而有关该方对此影响的研究报道甚少。为此，本研究采用沙土鼠脑缺血再灌注损伤模型，研究该方的作用。报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 药物：补阳还五汤(黄芪60 g，当归9 g,川芎6 g，赤芍9 g，桃仁9 g，红花9 g，地龙9 g)由湖南中医学院药学分院制成注射剂，含生药1 000 g/L，使用时用生理盐水稀释成500 g/L。
1.2 动物：体重60～80 g清洁级蒙古沙土鼠，雌雄各半，卫生部上海生物制品研究所动物中心提供。
1.3 实验方法：沙土鼠随机分为假手术对照组(假手术组)、模型对照组(模型组)和补阳还五汤组。参照文献〔4〕方法制备模型。实验前12小时，补阳还五汤组腹腔注射补阳还五汤8 ml/kg(含生药4 g/kg),假手术组和模型组腹腔注射等量生理盐水，实验前15分钟再同前方法注射药物1次。于给药后15分钟，腹腔注射盐酸氯胺酮1.2 ml/kg(60 mg/kg)麻醉，分离两侧颈总动脉。除假手术组外，其余各组均以小动脉夹夹闭双侧颈总动脉造成脑缺血，缺血20分钟后松开动脉夹进行再灌注。假手术组不结扎双侧颈总动脉，其它操作与以上各组相同。缝合手术切口，继续饲养。再分别于再灌注后12、24和36小时同前腹腔注射药物1次。于再灌注后48小时将沙土鼠颈椎脱臼致死，迅速取脑置冰台上，在冰台上迅速分离双侧前脑皮质，以冰生理盐水冲洗去除残余后称重，加冰生理盐水在冰溶下制成10%脑匀浆液，于4 ℃离心(3 500 r/min)15分钟，分离上清液供测试用。
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1.4 观察指标：脑匀浆液NO含量按重氮化反应法测定；NOS活性以分光光度法测定。药盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.5 统计学方法：结果以均数±标准差(
±s)表示，P<0.05为差异有显著性。2 结 果
2.1 对脑组织NO含量的影响：模型组脑组织NO含量明显低于假手术组；补阳还五汤组NO含量也较假手术组降低，但显著高于模型组(P均<0.01)。见表1。
2.2 对脑组织NOS活性的影响：模型组NOS活性显著低于假手术组；补阳还五汤组NOS活性明显升高，与假手术组之间差异无显著性意义(P>0.05)。见表1。
表1 各组NO和NOS的比较(
±s)μmol/g 组别, http://www.100md.com
动物数(只)
NO
NOS
假手术组
8
2.60±2.02
16.71±2.21
模型组
8
0.79±0.40△△
11.61±1.64△△
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补阳还五汤组
8
1.33±0.77△△**
15.47±1.95**
注：与假手术组比较：△△P<0.01；与模型组比较：**P<0.013 讨 论
脑组织存在丰富的NOS，可产生NO。研究表明，固有型NOS(cNOS)在基础条件下起作用，产生的NO对脑循环起重要的调节作用；而诱导型NOS(iNOS)在基础条件下不起作用，在缺血时表达并产生高浓度的NO，从而加速能量消耗，损伤DNA，导致神经细胞死亡。在大鼠局灶性脑缺血模型，脑缺血早期(阻断大脑中动脉后5～10分钟)NO持续增加，至30分钟达峰值，之后逐渐降至正常，再灌注数分钟到40分钟又轻度增加，之后又恢复至正常水平〔5，6〕。给予NOS抑制剂NJ硝基L精氨酸甲酯(LNANE)或NJ硝基L精氨酸(LNNA)等明显减少大鼠局灶性脑缺血区血流量〔7〕。但也有研究表明，LNANE等可使局部脑梗死体积缩小，NOS抑制剂对脑缺血起到保护作用〔8〕。可见，NO既具有潜在的有益作用，又有不良反应，NO浓度升高主要发生在缺血早期，此时对神经细胞产生毒性作用，而在再灌注后期，NO对脑血流等具有有益的调节作用。本研究结果表明，在再灌注48小时后，脑组织NO含量降低，NOS活性降低，表明此时脑组织内NO合成受抑。补阳还五汤可对抗再灌注后期NO含量和NOS活性的降低，提示补阳还五汤通过提高NO的合成，发挥其对抗缺血性脑损伤的作用。但该方作用的具体环节还有待于进一步研究。
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参考文献：
〔1〕冯亦璞.脑缺血病理生理及生化机制研究进展.见：陈维洲，陈修，苏定冯主编.心血管药理学进展.第1版.北京：人民卫生出版社，1995.90101.
〔2〕桑梅.爱维治注射液合补阳还五汤治疗脑梗死临床观察.中国中西医结合急救杂志，1999，6(1)：40.
〔3〕邓常青，刘志龙，葛金文，等.补阳还五汤抗脑缺血再灌注损伤作用机理的研究.中国中医基础医学杂志 ，1998，4(8)：3234.
〔4〕严翠芬，李麟仙，王子灿，等.沙土鼠短暂性脑缺血后海马迟发性神经元死亡机理的研究.中国病理生理杂志，1991，7(6)：605606.
〔5〕Malinski T,Bailey F,Zhang Z G,et al.Nitric oxide measured by a porphyrinic microsensor in rat brain after transient middle cerebral artery occlusion.J Cereb Blood Flow Metab,1993,13:355.
, http://www.100md.com
〔6〕Sato S,Tominga T,Ohnishi T,et al.Role of nitric Oxide in brain ischemia.Ann N Y Aca Sci,1994,738:369.
〔7〕Irikura K,Maynard K I,Moskowitz M A.Importance of nitric oxide synthase inhibition to the attenuated vascular responses induced by topical Lnitroarginine during vibrissal stimulation.J Cereb Blood Flow Metab,1994,14:45.
〔8〕Nishikawa T,Kirsch J R,Koehler R C,et al.Effect of nitric oxide synthase inhibition on cerebral blood flow and injury volume during ischemia in cats.Stroke,1993,24:1717.
(收稿日期：20000811 修回日期：20000917)
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