实验肿瘤抗p53融合蛋白单克隆抗体的性质鉴定
作者：刘彩云 张蕾 孙素莲 寿成超
单位：刘彩云(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤防治研究所 北京市100034)；张蕾(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤防治研究所 北京市100034)；孙素莲(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤防治研究所 北京市100034)；寿成超(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤防治研究所 北京市100034)
关键词：抗p53单克隆抗体；免疫组织化学；免疫印迹；免疫沉淀
中国肿瘤临床000515
摘要 目的：研制出能特异与p53结合的单克隆抗体， 使对p53的检测得到更为广泛的应用。方法：以原核表 达的p53-GST融合蛋白为免疫原，常规方法作细胞融合 ，间接酶联免疫吸附试验(ELISA)双筛和免疫组织化 学(IHC)筛选，将能稳定分泌抗人p53单抗的杂交瘤细 胞株的细胞上清(命名为M126)与常用p53进口单抗 PAB1801(ZYMED公司)作对比实验。结果：此单抗适用于ELISA、 IHC、免疫印迹及免疫沉淀等方面的研究，并且在一定 程度上优于PAB1801。结论：新制备的单抗M126可考虑取代 进口单抗PAB1801而用于p53的表达及突变研究。
, http://www.100md.com
The Making of Monoclonal Antibody against p53
Liu Caiyun Zhang Lei Sun Sulian
(The School of Oncology, Beijing Medical University, Beijing )
Abstract Objective: To prepare anti- p53 monoclonal antibody which can specifically bind to human p53 and make it to be used widely in p53 detection. Methods: BALB/C mice were immunized with p53- GST fusion protein. Hybridoma suspernatants were tested by ELISA and confirmed by immunohistochemistry. One hybridoma cell line secreting anti- human p53 antibody (named M126) was obtained. Results: It was shown that the monoclonal antibody is good for use in the study of ELISA, immunochemistry, Western blotting and immunoprecipitation and that M126 showed a stronger staining effect than the imported p53 McAb PAB1801. Conclusion: The monoclonal antibody can replace the former preparation in study of p53 expression and mutation.
, 百拇医药
Key Words Immunohistochemistry Anti- p53 monoclonal antibody Western blotting Immunoprecipitation
野生型p53基因是一种抑癌基因，为编码53KD的核蛋白 ，在细胞生长过程中起负调节作用，而突变型p53在许 多人类恶性肿瘤的发展中起重要作用[1]。有研究报道 p53突变是乳腺癌预后差的标志[2,3]。正常p53蛋白半衰期 短，不能用免疫组化法检测出，而突变型p53蛋白半衰 期明显增加，很容易用免疫组化法检测[3]，因此简单 快速的免疫组化法能为p53突变提供强有力的证据。免 疫组化法检测p53蛋白需要有与p53蛋白特异结合的抗p53单 抗。本文就新制备的抗p53单抗(杂交瘤细胞培养上清 )以进口p53单抗PAB1801为阳性对照进行免疫组化、免疫 印迹、免疫沉淀等试验。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 抗p53蛋白单抗的制备
以50μg/只鼠p53-GST融合为免疫原，免疫6～8周龄BALB/C小鼠3次。末次免疫1个月后，腹腔注射融合蛋白50μg/鼠，3天后取脾制成细胞悬液与SP2/0细胞常规融合。约10天后，将融合细胞上清分别加入用融合蛋白p21-GST及p53-GST包被的酶标板中，37℃1小时，PBST洗，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG37℃1小时，PBST洗后，以四甲基联苯胺(TMB)-H2O2系统为底物，挑选与p53-GST有强阳性反应，而不与p21-GST反应的细胞上清进一步进行IHC分析，将IHC阳性反应的细胞进行克隆，再检测，使其分泌抗体的能力稳定。
1.2 免疫组织化学检测
用S-P法将乳腺癌石蜡切片脱蜡入水，于0.3%H2O2-甲醇中40分钟，以去除组织内源性过氧化物酶，PBS洗 后，以0.1%人血清白蛋白37℃30分钟封闭切片；加自制 p53单抗(细胞培养上清)；PAB1801、PBS分别作为阳、阴 性对照，37℃孵育1小时，PBS洗3次，每次5分钟，加入 生物素标记马抗小鼠IgG(1:500)37℃30分钟，PBS洗后，加入 链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物(SA-HRP1:1000)37℃ 30分钟,PBS洗，以0.5mg/ml二氨基联苯胺(DAB)-H2O2系统显色。 以苏木素复染，酒精梯度脱水、封片，镜检。细胞 核染色分级按Sreenan方法[4]。
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1.3 免疫印迹试验
将p53阳性乳腺癌细胞株MDA231从培养瓶中消化，PBS洗3次，加入细胞裂解液，冰上放置20分钟，10000rpm离心30分 钟，10μl上清加10μl上样缓冲液，沸水中煮5分钟，行 SDS-PAGE，电泳完毕后，将蛋白转到硝酸纤维素膜上，膜用3%BSA37℃封闭30分钟，分别加入新制单抗M126和阳 性对照PAB1801，加入无关单抗为阴性对照，37℃孵育1小 时，PBST充分洗后，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗 小鼠IgG37℃孵育1小时,PBST充分洗后，用0.5mg/ml二氨基联苯 胺(DAB)和0.03%H2O2显色。
1.4 免疫沉淀
取约10μlMDA231细胞裂解液分别与M126及PAB1801单抗一起4℃ 孵育过夜，加入10μl琼脂糖-ProteinA,4℃孵育3小时，用 PBST洗3次，加入SDS-PAGE上样缓冲液煮沸10分钟，上样，10%SDS-PAGE电泳，用考马斯亮蓝染色。
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2 结果
2.1 抗p53单克隆抗体的制备
经一次细胞融合后融合率为100%(472/472)，经ELISA双筛 选只与p53-GST反应而不与p21-GST反应者为28%(150/472)，再 经IHC筛选后阳性率为5%(1/20)，经反复克隆筛选后，得到一株能稳定分泌抗人p53单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2.2 免疫组织化学检测
同时用新制单抗M126和进口单抗PAB1801对52例乳腺癌石 蜡切片进行免疫组织化学分析，细胞核呈棕黄色颗 粒状着色，癌细胞核染色呈现异质性，阳性检出率 分别为48.1%(25/52)和42.3%(22/52)，其中有3例用M126时癌细胞 核呈现阳性着色，而用PAB1801时却是阴性结果。共同的 阳性染色中，细胞核染色强度、面积等，M126比PAB1801均 有不同程度的提高，图1中A、B分别是由单抗M126和PAB1801对 乳腺癌石蜡切片的染色结果。
, 百拇医药
A自制p53单抗B进口p53单抗
图1 乳腺癌石蜡切片p53免疫组化检测×500
2.3 免疫印迹与免疫沉淀
图2结果显示，自制单抗M126和进口单抗PAB1801在50KD处有 一条蛋白带显示，说明二者均能与MDA231细胞株中的p53蛋 白特异结合，同时也证明M126,PAB1801均能与变性p53蛋白特 异反应。图3结果显示，除免疫球蛋白IgG重、轻链外 ，在约50KD处，还有一条多余的蛋白带，说明自制单 抗M126与进口单抗PAB1801都能与溶解状态的p53蛋白反应。
1分子量标准2进口p53单抗3自制p53单抗4阴性对照
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图2 免疫印迹
1分子量标准2进口p53单抗3自制p53单抗4阴性对照
图3 免疫沉淀
3 讨论
通过对人类肿瘤细胞的p53分子遗传分析结果表明： 很多人类恶性肿瘤中常有p53基因突变发生[4]，IHC和DNA序 列分析显示肿瘤细胞中异常p53蛋白的积累和p53基因点 突变之间有很好的相关性[5,6]。快速简单的免疫组化 法为p53基因突变提供了强有力的证据，免疫组化法检 测p53蛋白需要有适合于免疫组化用的抗p53试剂，而国 外产品价格昂贵，限制了我国实验室对p53的检测。我 们应用GST表达系统表达p53-GST融合蛋白，以此为免疫 原免疫BALB/C小鼠，细胞融合后，得到一株能稳定分泌 抗人p53单抗的杂交瘤细胞株，此单抗与进口单抗PAB1801同 时对52例乳腺癌石蜡切片进行免疫组化分析，M126不仅 能检测出PAB1801检测出的全部阳性外，还能检出3例 PAB1801不能检出的石蜡切片，这可能是由于PAB1801所识别 的抗原表位在福尔马林固定过程中不稳定[7]，而且由 M126所得免疫染色在阳性面积及强度方面均略高于 PAB1801，说明自制单抗M126可取代进口单抗PAB1801进行IHC分 析。免疫印迹和免疫沉淀的结果表明自制单抗M126和 进口单抗PAB1801均能与溶解状态和变性的p53蛋白发生特 异反应。因此自制p53单抗M126不仅可用于IHC研究，也可 用于免疫印迹和免疫沉淀等方面的研究。
, 百拇医药
(柏敏霜校对)
参考文献
1，Nigro JM,Baker ST,Preisinger AC,et al. Mutation in the p53 gene occur in diverse human tumour types. Nature,1989;342:705
2，Andersen TI,Holm R,Nesland JM,et al. Prognostic significance of p53 alterations in breast carcinoma. Br J Cancer,1993;68:540
3，Bergh J,Norberg T,Sjogren S,et al. Complete sequencing of the p53 gene provides prognostic information in breast cancer patients,particularly in relation to adjuvant systemic therapy and radiotherapy. Nature Med,1995;1:1029
, http://www.100md.com
4，Sreenan MD,Richard A,and Prayson MD. Gliosarcoma:A study of 13 tumors,including p53 and CD34 immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med,1997;121:129
5，Marks JR,Davidoff AM,Kernsa BJ,et al. Over expression and mutation of p53 in epithelial ovarian cancer. Cancer Res,1991;51:2979
6，Iggo R,Gatter K,Bartek J,et al. Increased expression of mutant forms of p53 oncogene in primary lung cancer. Lancet,1990;35:675
7，Morkve O,Laerum OD. Flow cytometric measurement of p53 protein expression and DNA content in paraffin- embedded tissue from bronchial carcinomas. Cytometry,1991;12:438
(1999-03-09收稿)
(1999-05-18修回), http://www.100md.com
单位：刘彩云(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤防治研究所 北京市100034)；张蕾(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤防治研究所 北京市100034)；孙素莲(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤防治研究所 北京市100034)；寿成超(北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤防治研究所 北京市100034)
关键词：抗p53单克隆抗体；免疫组织化学；免疫印迹；免疫沉淀
中国肿瘤临床000515
摘要 目的：研制出能特异与p53结合的单克隆抗体， 使对p53的检测得到更为广泛的应用。方法：以原核表 达的p53-GST融合蛋白为免疫原，常规方法作细胞融合 ，间接酶联免疫吸附试验(ELISA)双筛和免疫组织化 学(IHC)筛选，将能稳定分泌抗人p53单抗的杂交瘤细 胞株的细胞上清(命名为M126)与常用p53进口单抗 PAB1801(ZYMED公司)作对比实验。结果：此单抗适用于ELISA、 IHC、免疫印迹及免疫沉淀等方面的研究，并且在一定 程度上优于PAB1801。结论：新制备的单抗M126可考虑取代 进口单抗PAB1801而用于p53的表达及突变研究。
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The Making of Monoclonal Antibody against p53
Liu Caiyun Zhang Lei Sun Sulian
(The School of Oncology, Beijing Medical University, Beijing )
Abstract Objective: To prepare anti- p53 monoclonal antibody which can specifically bind to human p53 and make it to be used widely in p53 detection. Methods: BALB/C mice were immunized with p53- GST fusion protein. Hybridoma suspernatants were tested by ELISA and confirmed by immunohistochemistry. One hybridoma cell line secreting anti- human p53 antibody (named M126) was obtained. Results: It was shown that the monoclonal antibody is good for use in the study of ELISA, immunochemistry, Western blotting and immunoprecipitation and that M126 showed a stronger staining effect than the imported p53 McAb PAB1801. Conclusion: The monoclonal antibody can replace the former preparation in study of p53 expression and mutation.
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Key Words Immunohistochemistry Anti- p53 monoclonal antibody Western blotting Immunoprecipitation
野生型p53基因是一种抑癌基因，为编码53KD的核蛋白 ，在细胞生长过程中起负调节作用，而突变型p53在许 多人类恶性肿瘤的发展中起重要作用[1]。有研究报道 p53突变是乳腺癌预后差的标志[2,3]。正常p53蛋白半衰期 短，不能用免疫组化法检测出，而突变型p53蛋白半衰 期明显增加，很容易用免疫组化法检测[3]，因此简单 快速的免疫组化法能为p53突变提供强有力的证据。免 疫组化法检测p53蛋白需要有与p53蛋白特异结合的抗p53单 抗。本文就新制备的抗p53单抗(杂交瘤细胞培养上清 )以进口p53单抗PAB1801为阳性对照进行免疫组化、免疫 印迹、免疫沉淀等试验。
1 材料与方法
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1.1 抗p53蛋白单抗的制备
以50μg/只鼠p53-GST融合为免疫原，免疫6～8周龄BALB/C小鼠3次。末次免疫1个月后，腹腔注射融合蛋白50μg/鼠，3天后取脾制成细胞悬液与SP2/0细胞常规融合。约10天后，将融合细胞上清分别加入用融合蛋白p21-GST及p53-GST包被的酶标板中，37℃1小时，PBST洗，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG37℃1小时，PBST洗后，以四甲基联苯胺(TMB)-H2O2系统为底物，挑选与p53-GST有强阳性反应，而不与p21-GST反应的细胞上清进一步进行IHC分析，将IHC阳性反应的细胞进行克隆，再检测，使其分泌抗体的能力稳定。
1.2 免疫组织化学检测
用S-P法将乳腺癌石蜡切片脱蜡入水，于0.3%H2O2-甲醇中40分钟，以去除组织内源性过氧化物酶，PBS洗 后，以0.1%人血清白蛋白37℃30分钟封闭切片；加自制 p53单抗(细胞培养上清)；PAB1801、PBS分别作为阳、阴 性对照，37℃孵育1小时，PBS洗3次，每次5分钟，加入 生物素标记马抗小鼠IgG(1:500)37℃30分钟，PBS洗后，加入 链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物(SA-HRP1:1000)37℃ 30分钟,PBS洗，以0.5mg/ml二氨基联苯胺(DAB)-H2O2系统显色。 以苏木素复染，酒精梯度脱水、封片，镜检。细胞 核染色分级按Sreenan方法[4]。
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1.3 免疫印迹试验
将p53阳性乳腺癌细胞株MDA231从培养瓶中消化，PBS洗3次，加入细胞裂解液，冰上放置20分钟，10000rpm离心30分 钟，10μl上清加10μl上样缓冲液，沸水中煮5分钟，行 SDS-PAGE，电泳完毕后，将蛋白转到硝酸纤维素膜上，膜用3%BSA37℃封闭30分钟，分别加入新制单抗M126和阳 性对照PAB1801，加入无关单抗为阴性对照，37℃孵育1小 时，PBST充分洗后，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗 小鼠IgG37℃孵育1小时,PBST充分洗后，用0.5mg/ml二氨基联苯 胺(DAB)和0.03%H2O2显色。
1.4 免疫沉淀
取约10μlMDA231细胞裂解液分别与M126及PAB1801单抗一起4℃ 孵育过夜，加入10μl琼脂糖-ProteinA,4℃孵育3小时，用 PBST洗3次，加入SDS-PAGE上样缓冲液煮沸10分钟，上样，10%SDS-PAGE电泳，用考马斯亮蓝染色。
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2 结果
2.1 抗p53单克隆抗体的制备
经一次细胞融合后融合率为100%(472/472)，经ELISA双筛 选只与p53-GST反应而不与p21-GST反应者为28%(150/472)，再 经IHC筛选后阳性率为5%(1/20)，经反复克隆筛选后，得到一株能稳定分泌抗人p53单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2.2 免疫组织化学检测
同时用新制单抗M126和进口单抗PAB1801对52例乳腺癌石 蜡切片进行免疫组织化学分析，细胞核呈棕黄色颗 粒状着色，癌细胞核染色呈现异质性，阳性检出率 分别为48.1%(25/52)和42.3%(22/52)，其中有3例用M126时癌细胞 核呈现阳性着色，而用PAB1801时却是阴性结果。共同的 阳性染色中，细胞核染色强度、面积等，M126比PAB1801均 有不同程度的提高，图1中A、B分别是由单抗M126和PAB1801对 乳腺癌石蜡切片的染色结果。
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A自制p53单抗B进口p53单抗
图1 乳腺癌石蜡切片p53免疫组化检测×500
2.3 免疫印迹与免疫沉淀
图2结果显示，自制单抗M126和进口单抗PAB1801在50KD处有 一条蛋白带显示，说明二者均能与MDA231细胞株中的p53蛋 白特异结合，同时也证明M126,PAB1801均能与变性p53蛋白特 异反应。图3结果显示，除免疫球蛋白IgG重、轻链外 ，在约50KD处，还有一条多余的蛋白带，说明自制单 抗M126与进口单抗PAB1801都能与溶解状态的p53蛋白反应。
1分子量标准2进口p53单抗3自制p53单抗4阴性对照
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图2 免疫印迹
1分子量标准2进口p53单抗3自制p53单抗4阴性对照
图3 免疫沉淀
3 讨论
通过对人类肿瘤细胞的p53分子遗传分析结果表明： 很多人类恶性肿瘤中常有p53基因突变发生[4]，IHC和DNA序 列分析显示肿瘤细胞中异常p53蛋白的积累和p53基因点 突变之间有很好的相关性[5,6]。快速简单的免疫组化 法为p53基因突变提供了强有力的证据，免疫组化法检 测p53蛋白需要有适合于免疫组化用的抗p53试剂，而国 外产品价格昂贵，限制了我国实验室对p53的检测。我 们应用GST表达系统表达p53-GST融合蛋白，以此为免疫 原免疫BALB/C小鼠，细胞融合后，得到一株能稳定分泌 抗人p53单抗的杂交瘤细胞株，此单抗与进口单抗PAB1801同 时对52例乳腺癌石蜡切片进行免疫组化分析，M126不仅 能检测出PAB1801检测出的全部阳性外，还能检出3例 PAB1801不能检出的石蜡切片，这可能是由于PAB1801所识别 的抗原表位在福尔马林固定过程中不稳定[7]，而且由 M126所得免疫染色在阳性面积及强度方面均略高于 PAB1801，说明自制单抗M126可取代进口单抗PAB1801进行IHC分 析。免疫印迹和免疫沉淀的结果表明自制单抗M126和 进口单抗PAB1801均能与溶解状态和变性的p53蛋白发生特 异反应。因此自制p53单抗M126不仅可用于IHC研究，也可 用于免疫印迹和免疫沉淀等方面的研究。
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(柏敏霜校对)
参考文献
1，Nigro JM,Baker ST,Preisinger AC,et al. Mutation in the p53 gene occur in diverse human tumour types. Nature,1989;342:705
2，Andersen TI,Holm R,Nesland JM,et al. Prognostic significance of p53 alterations in breast carcinoma. Br J Cancer,1993;68:540
3，Bergh J,Norberg T,Sjogren S,et al. Complete sequencing of the p53 gene provides prognostic information in breast cancer patients,particularly in relation to adjuvant systemic therapy and radiotherapy. Nature Med,1995;1:1029
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4，Sreenan MD,Richard A,and Prayson MD. Gliosarcoma:A study of 13 tumors,including p53 and CD34 immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med,1997;121:129
5，Marks JR,Davidoff AM,Kernsa BJ,et al. Over expression and mutation of p53 in epithelial ovarian cancer. Cancer Res,1991;51:2979
6，Iggo R,Gatter K,Bartek J,et al. Increased expression of mutant forms of p53 oncogene in primary lung cancer. Lancet,1990;35:675
7，Morkve O,Laerum OD. Flow cytometric measurement of p53 protein expression and DNA content in paraffin- embedded tissue from bronchial carcinomas. Cytometry,1991;12:438
(1999-03-09收稿)
(1999-05-18修回), http://www.100md.com