三七、虫草菌丝对实验性肝纤维化预防作用的研究
作者：张荣华 周子成 洪多伦 艾九松
单位：第三军医大学附属西南医院中医科 重庆 400038
关键词：肝纤维化；治疗；三七；人工虫草菌丝；透明质酸；层粘连；蛋白；病理学；大鼠
重庆医学000602
摘 要 目的 观察三七、人工虫草菌丝对CCl4中毒性肝纤维 化的预防作用。方法 复制大鼠CCl4中毒性肝纤维化模型，并以秋 水仙碱作为阳性治疗对照。分空白对照组、肝纤维化模型组、秋水仙碱组、三七组、虫草菌 丝组。采用光镜、电镜观察肝脏组织学改变，测定血清ALT、白蛋白、球蛋白、HA、LN、肝 组织Hyp含量，以反映肝细胞损伤及肝纤维化程度。将形态改变与功能变化相结合，对比分 析虫草菌丝对CCl4中毒性肝纤维化的预防作用。结果 CCl4可引 起肝组织严重脂肪变性及肝纤维化。各组肝组织损伤及肝纤维化的严重程度依次为：模型组 >虫草菌丝组>秋水仙碱组>三七组。结论 本实验条件下，三七是较 理想的预防肝纤维化的药物。虫草菌丝对肝脏CCl4损伤具有一定保护作用，有较强促进肝 细胞再生修复作用，同时在损伤肝组织中成纤维细胞及胶原纤维也明显增生，这将加快肝纤 维化进程，临床应用时应权衡利弊。秋水仙碱有一定预防肝纤维化作用，但毒副作用不可忽 视。
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Inhibitory Effects of Panax Notoginseng and Cordyceps Sinensi s on CCl4-induced Hepatic Fibrosis in Rats
Zhang Ronghua, Zhou Zicheng, Hong Duolun,Ai Jiusong
(Department of Traditional Chinese Medicine, Southwest Hospital , Third Military Medical University, Chongqing 400038)
Abstract:Objective:To investigate the effects of Panax Notoginseng(PN)and Cordycesp Sinensis(CS)on CCl4-induced hepatic fibrosis(HF) .Methods:The model of CCl4-induced HF in rats was treate d with PN、CS or Colchicine (Col). The histological changes were observed with l ight and electronic microscopes. The Serum concentrations of alanine aminotransf erase(ALT)、albumin、hyaluronic acid(HA)、Laminin(LN) were determined and the le vel of hydroxyproline(Hyp) in liver tissue was also measured in order to reflect the extent of hepatocytic lesion and HF. The Col group was set up as positive t reatment control.Results:Severe fatty degeneration and HF can be induced by CCl4 intoxication in rat model. The severe extent of hepatoc ytic lesion, fatty degeneration and infiltration of inflammatory cells was :Mode l group>CS group>Col group>PN group.Conclusion:PN is an id eal drug on anti-chronic hepatic lesion and hepatic fibrosis. CS can exert sign ificant effects on improving regeneration and damage of hepatocytes. Meanwhile, the proliferation of fibroblasts and collagenous fibers were also obviously obse rved. Col has certain effect on preventing hepatic fibrosis, but its side-effec t could not be neglected.
, 百拇医药
Key words:hepatic fibrosis drug therapy Panax Notoginsen g Cordyceps Sinensis hyaluronic acid laminin pathology rat
为探讨三七、人工虫草菌丝(简称虫草菌丝)的抗肝纤维化作用，我们采用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)中毒诱导的大鼠肝纤维化模型，研究三七、虫草菌丝对某些血清学 指标、肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量变化和肝组织病理形态改变的影响，并 与秋水仙碱的抗肝纤维化作用进行墩比分析，为进一步研究三七、虫草菌丝防治肝纤维化作 用和机理及指导临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠134只，SPF级，体重180-210g，由第三军医大学动物中心提供。
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1.2 药物及其配制
生三七粉(贵阳中药厂)、虫草菌丝(重庆制药六厂)分别制成3%、6%、12%混悬液，秋水仙碱( 法国HOUDE实验室)制成0.0025%混悬液，4℃保存。
1.3 肝纤维化模型
每只大鼠首次后腿皮下注射CCl4(重庆化学试剂厂)0.05ml/kg，以后注射40%CC14橄榄 油0.03ml/kg，每周两次，共9周。
1.4 动物分组及给药
将实验动物随机分为五组：①空白对照组大鼠接受橄榄油(上海卫辉化学试剂厂)后腿皮下注 射，首次0.05ml/kg，以后0.03ml/kg，每周两次。同时予0.5%羧甲基纤维素钠溶液经口 灌胃，5ml/kg，1/日。②肝纤维化模型组。③秋水仙碱组。模型组和秋水仙碱组在造模的同 时分别予0.5%羧甲基纤维素钠、0.0025%秋水仙碱灌胃，5m/kg,1/日。④三七组。⑤虫草 菌丝组。三七组和虫草菌丝组在预实验取得最佳剂量后，造模的同时予12%三七或虫草菌丝 灌胃，5ml/kg,1/日。
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1.5 标本采集
各组每隔3周处死8只大鼠，最后一次处死大鼠时间为第9周末。用3%戊巴比妥钠腹腔注射0. 02ml/kg，麻醉成功后，经股动脉放血，分离血清，-20℃保存。留取肝脾组织标本。
1.6 检测指标及方法
1.6.1 应用EX7全自动生化测定仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)含量。
1.6.2 应用上海第二军医大学海军医学研究所提供的透明质酸(hyaluron ic acid,HA)、层粘连蛋白(laminin,LN)放免试剂盒，按说明操作，测定HA、LN含量。
1.6.3 肝组织Hyp含量按许志勤法[1]进行测定。
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1.6.4 病理形态学观察
常规HE染色观察肝组织学改变，Van Gieson胶原纤维染色观察胶原纤维增生情况，电镜观察 肝脏超微结构变化。
1.6.5 统计处理
采用第三军医大学医用数理统计程序进行统计处理。
2 结果
2.1 大鼠一般情况
空白对照组处死前均存活，体重增加128±47g/只。模型组实验中死亡7只。至9周处死前， 体重增加34±29g/只，显著低于空白对照组(p<0.05)。秋水仙碱组实验中死亡4只，体重增 加62±23.6g/只，显著低于空白对照组(p<0.01)而高于模型组(p<0.05)。三七组实验中无死 亡，与模型组比较p<0.05，体重增加87±36g/只，显著高于模型组(p<0.01)。虫草菌丝组实 验中死亡3只，与模型组比较p>0.05，体重增加73±40.7g/只，显著高于模型组而 低于空白对照组(p均<0.05)。死亡者均末列入统计。
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2.2 三七、虫草菌丝对实验大鼠肝功能的影响(见表1)
表1 各组大鼠肝功能变化(
±s，n=8)
组别
ALT(IU/L)
Albumin(g/L)
Globulin(g/L)
空白对照组
3周
38.47±4.39
34.51±1.69
, 百拇医药
24.19±1.57
6周
37.59±5.32
35.09±1.87
23.78±1.45
9周
39.63±5.13
35.55±2.09
24.01±1.62
模型组
3周
225.38±99.78**
, 百拇医药
31.24±1.92**
27.76±2.20**
6周
312.63±72.21**
28.92±2.93**
30.7 8±1.88**
9周
348.63±90.75**
24.41±2.81**
36.5 2±1.09**
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秋水仙碱组
3周
58.38±12.68**△△
33.86±2.62△
24.14±2.25△△
6周
90.25±58.26*△△
32.10±3.97*
24.78±2 .09△△
9周
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110.0±37.55**△△
32.41±1.96**△△
26.45±2.60△△
三七组
3周
67.13±18.39**△△
34.83±1.58△△
24.01±2.50△△
6周
97.63±38.59**△△
, 百拇医药
34.35±1.54△△
23 .91±1.88△△
9周
68.12±14.34**△△＃
34.50±2.74△△
2 3.88±1.69△△＃
虫草菌丝组
3周
58.00±23.33*△△
30.81±2.23**
, 百拇医药
26.52±2.52*
6周
128.50±53.44**△△
30.27±2.33**
2 7.41±1.23**△△
9周
115.38±59.19**△△
30.12±2.13**
2 8.83±3.29**△△
, 百拇医药 与空白对照组相比*：p<0.05**p<0.01 与模型与相比 △：p<0.05 △△:p<0.01
与秋水仙碱组相比 ＃:p<0.01
如表1所示，模型组、秋水仙碱组、三七组、虫草菌丝组不同时相ALT含量均显著高于同期空 白对照组(p<0.01或0.05)，而以模型组最高，显著高于其他同期各组(p<0.01)。模型组白 蛋白下降，3、9周时与秋水仙碱组相比差异显著(p<0.05和p<0.01)，而与虫草菌丝组相比P> 0.05。三七组ALT最低。9周时，三七组ALT低于秋水仙碱组。模型组白蛋白下降，与秋水仙 碱组和三七组相比差异显著(p<0.05或p<0.01)，而与虫草菌丝组相比无差异。模型组球蛋白 增加与其他各组比较差异显著(除虫草菌丝组3周时外)。
2.3 三七、虫草菌丝对大鼠血清HA、LN和肝组织中Hyp的影响(见表2)
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表2 大鼠血清HA、LN和肝组织Hyp的变化(±s，n=8)
组别
HA(μg/L)
LN(μg/L)
Hyp(mg/g)
空白对照组
3周
97.32±15.28
32.47±5.01
2.01±0.39
, 百拇医药 6周
98.45±16.03
33.38±4.56
2.22±0.41
9周
100.13±17.1
33.86±4.28
2.39±0.46
模型组
3周
116.16±20.2
37.48±5.79
, 百拇医药
2.86±0.77
6周
139.69±18.97*
5.70±7.32**
3.56±0.77**
9周
198.78±34.54**
85.56±12.34**
3.9 5±0.98**
秋水仙碱组
, 百拇医药
3周
115.91±21.86
35.47±3.78
2.60±0.57
6周
129.64±22.07**
40.01±6.14*△△
2. 78±0.54△
9周
147.51±21.89**△△
45.81±9.30**
, 百拇医药
3 .11±0.42**
三七组
3周
109.50±17.76
33.04±4.93
2.48±0.41
6周
112.99±20.54△
37.44±4.90△△
2.80±0.6 4△
9周
, 百拇医药
141.56±23.55**△
39.20±4.93*△△
2 .97±0.69△
虫草菌丝组
3周
116.49±21.22
34.68±3.92
2.67±0.50
6周
127.42±21.58*
42.19±8.87*△△
, 百拇医药
2.92±0 .52△
9周
147.81±20.57**△△
50.49±10.33**△△
3.24±0.31**
与空白对照组相比*：p<0.05 **:P<0.01 与模型组相比 △：p<0.05 △△：p<0.01
如表2所示，各组大鼠不同相时血清HA、LN，肝Hyp均较空白对照组升高，且以9周时最为明 显，而三个药物预防组6周时血LN和肝Hyp显著低于同期模型组，9周时血HA与模型组相比P<0 .01，说明慢性CCL4中毒性肝纤维化存在胶原代谢异常，主要表现为血HA、LN和肝Hyp含量 增加，而三七、虫草菌丝和秋水仙碱对此有抑制作用。
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2.4 病理形态学观察
2.4.1 肝脾大体形态观察
模型组3周末肝脏开始肿大，9周末停止肿大，韧度增加，有油腻感。其中有1只大鼠肝脏体 积缩小，黄褐色，表面呈细节状，有腹水。脾脏从第6周末开始肿大，9周末肿大最明显。秋 水仙碱组、虫草菌丝组3周末肝脏开始肿大，9周末仍肿大，但较模型组轻，脾脏肿大不明显 。
2.4.2 光镜观察
HE染色和Van Gieson胶原纤维染色后观察，见对空白照组肝小叶结构完整，无变性、坏死、 炎细胞浸润和纤维组织增生。模型组3周时肝细胞广泛脂肪变性，可见少量增生的纤维组织 ；6周时肝组织脂肪变性加重，残存少量肝细胞；9周时肝组织大片脂肪变性，呈空网状，仅 残存少量肝细胞，变性肝组织中穿插纤维组织条索。三七组3周时肝组织脂肪变性较模型组 及秋水仙碱组轻，汇管区少量纤维组织；6周时部分肝组织脂肪变性，肝内灶性炎细胞浸润 ，肝小叶间和中央静脉周围少量纤维组织增生；9周时中央静脉周围大片肝组织脂肪变性， 汇管区及界板区纤维组织少量增生。秋水仙碱组3周时界板区大量脂肪空泡，炎细胞浸润较 多，有少量纤维组织增生；6周时肝组织呈大片网状变性坏死，变性区有成纤维细胞增生和 炎细胞浸润，小叶间少量纤维组织增生；9周时汇管区纤维组织增生，并向周围放射生长， 可见再生肝细胞，界板区纤维组织增生。虫草菌丝组3周时肝中央静脉及小叶结构可见，界 板区肝组织脂肪变性明显，界板及中央静脉周围较多纤维母细胞增生，呈放射状排列；6周 时，肝组织大量脂肪变性，再生肝细胞较多，呈团状，有炎细胞浸润；9周时，肝细胞索排 列紊乱，肝细胞成团增生，体积大，胞浆呈泡沫状，可见双核细胞，小叶间纤维组织增生， 肝假小叶形成。
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此外，对脾脏进行HE染色观察，见正常脾脏有大量淋巴细胞，红、白髓分界明显，模型组脾 窦充血明显，秋水仙碱组的脾脏红髓结构紊乱，有较多不规则空泡形成，有核细胞数量减少 ，有纤维组织样结构形成。
2.4.3 电镜观察
模型组肝细胞浆内充满大小不等的脂肪空泡，有的肝细胞核被挤压变形，核内亦可见空泡。 浆胞内滑面内质网增生，呈典型的肝细胞中毒损伤后的超微结构特征性改变。变性的肝细胞 内线粒体电子密度增强，脊模糊或消失呈均质状。而秋水仙碱组、三七组和虫草菌丝组上述 改变较轻微。
3 讨论
综合各组形态改变和功能变化特点，并与其他组对比分析，可以看出：
3.1 大鼠慢性CCl4中毒可引起肝组织脂肪变性和肝纤维化，病变程度随 中毒时间延长而加重。
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3.2 三七对CCl4引起的肝细胞损伤具有一定保护作用，与虫草菌丝和秋 水仙碱相比保护作用稍强。三七促进肝细胞再生作用没有虫草菌丝强，未见到形成典型再生 肝细胞团块结构。更突出的特点是三七组肝组织成纤维细胞及胶原纤维增生较少，这是与模 型组和虫草菌丝组的最大差别。正是因为三七对肝细胞有相对明显的保护作用，同时减少成 纤维细胞及胶原纤维增生，故有利于减慢肝纤维化的进程。其预防肝纤维化作用，可能是通 过抑制肝脏炎症坏死，促进白蛋白合成及胶原分解，减少胶原合成而实现的。
3.3 人工虫草菌丝组与模型组比较，整体病情明显减轻；肝功能损害远不 如模型组严重，但比空白对照组ALT明显增高；形态学研究观察到虫草菌丝组的肝组织仍发 生灶性或大片有肝细胞脂变及炎细胞浸润，但病变程度较模型组轻。说明虫草菌丝对CCl4 中毒引起肝细胞损伤具有一定的保护作用，但作用较弱。虫草菌丝组有一突出特点是促进肝 细胞再生作用强，再生肝细胞比其他组都多；同时，成纤维细胞和胶原纤维增生也很明显， 有的区域增生的纤维围绕再生肝细胞团形成假小叶结构，部分再生肝细胞再度脂变。我们认 为，虫草菌丝促进肝细胞再生修复对机体是有利的，尤其在肝病早期，肝组织网状支架结构 未严重破坏时应用虫草菌丝促进肝细胞沿网状支架再生修复，恢复正常的肝细胞索结构，才 能达到形态和功能的恢复。如果病情发展到一定严重程度，肝组织网状支架塌陷，再生的肝 细胞成团生长，则不能达到结构修复。尤其值得注意的是，虫草菌丝不仅促进肝细胞再生， 而且促进成纤维细胞和胶原纤维增生，这势必将加快肝纤维化的进程。因此在临床应用中应 充分权衡其利弊。
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3.4 秋水仙碱对肝细胞损伤有一定保护作用，但不如三七作用明显，成纤 维细胞及胶原纤维增生比虫草菌丝组少，比三七组多，再生肝细胞较少。所以肝纤维化进程 没有模型组及虫草菌丝组快。但用秋水仙碱后，脾脏有核细胞(主要是淋巴细胞)数量明显减 少，形成不规则空网结构和纤维样结构，显然这将导致机体免疫功能抑制。
综合分析各组肝组织纤维化的严重程度依次为：模型组>虫草菌丝组>秋水仙碱组>三七组。 本实验条件下，三七组是较理想的预防肝纤维化的药物，并且没有秋水仙碱的毒副作用。
3.5 根据中医辨证，结缔组织增生性疾病(包括肝纤维化和肝硬化)与血瘀 证相关，而活血化瘀药物对此类疾病有独特的功效。在肝纤维化的治疗中，目前以活血化瘀 及益气活血法应用得最为广泛。
三七是经典的止血活血良药。临床观察发现，三七有利胆、退黄、降酶等作用，可提高慢肝 病患者的血浆白蛋白[2]。药理研究证实，三七对动物实验性急性肝损伤有明显的 防治作用，其有效成分三七总皂甙是缺血再灌注损伤的有效保护药物[3]，但对其 防治肝纤维化作用研究报道较少。
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人工虫草菌丝是人工培育的和冬虫夏草有类似作用的药物。它具有调节人体免疫功能及抗免 疫损伤性肝硬化的作用，是治疗病毒性肝炎、肝硬化的一个值得推广的药物[4]。 刘成等[5]用该药治疗肝炎后肝硬化的研究表明，该药能提高机体免疫机能，加强 对病毒的消除能力，保护肝细胞而间接抑制肝纤维化的发生发展。朱家旋等[6]用 虫草菌丝对大鼠免疫损伤导致的肝纤维化防治作用的研究表明，该方不仅能减轻肝脏的炎性 细胞浸润和肝细胞变性坏死、抑制总胶原、特别是Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝内的沉积，而且能使已 形成的胶原重新溶解和吸收。
中医认为，虫草为滋补之品，性温，有养阴、补精、益髓之功。而肝硬化(纤维化)又是虚实 夹杂之证，为本虚标实，瘀虚共存。在全病过程中，不同程度的存在着气滞、血瘀、水停、 湿热或寒湿等邪，血瘀是肝纤维化的基本病机，故其治疗在益气、养阴、补益肝肾、疏肝健 脾、软坚散结的同时，离不开活血化瘀。单纯地使用虫草补药则有留邪之弊。这与本实验研 究发现有吻合之处。
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秋水仙碱已用于临床治疗慢性肝病，长期应用可防治实验性和临床病人的肝纤维化和肝硬化 ，并有抑制胶原分泌的作用，被认为是治疗人类肝纤维化的有希望的药物[7]。从 本研究结果分析，秋水仙碱确有抗肝纤维化作用，但毒副作用不容忽视，不宜长期服用。
有学者报道[8]，桃仁提取物合虫草菌丝具有明显的抑制肝内胶原蛋白沉积和纤 维组织增生以及促进纤维化肝脏结缔组织降解的作用。我们推测，如果将虫草菌丝和三七有 机伍用，协同保护肝细胞，早期促进肝细胞再生修复，同时又抑制成纤维细胞增生，可望达 到恢复肝功能、防止肝纤维化的目的。这值得进一步研究。
参考文献
1，许志勤，高兴兰.组织羟脯氨酸测定方法的改进.解放军预防医学杂志 ，1990，8(1)：40～42
2，陶文生，韩淑芳.三七有利胆、退黄、降酶等作用.中医杂志，1994， 35(2)：71
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3，梁力建，何强，吕明德，等.三七总皂甙对大鼠肝缺血再灌注损伤的保 护作用.新消化病学杂志，1997，5(7)：419～420
4，吴勤，唐善令，杨生.冬虫夏草治疗慢性肝病的研究进展.中西医结合 肝病杂志，1997，7(1)：57～59
5，刘成，薛惠明，徐列明.人工虫草菌丝制剂治疗肝炎后肝硬化22例.上 海中医药杂志，1986，(6)：30～31
6，，朱家旋，王宝恩，王泰玲.冬虫夏草对实验性免疫损伤性肝纤维化的预 防和治疗作用的研究.中华消化杂志，1994，14(6)：333～335
7，Cedillo A, Mourelle M, Muriel P. Effect of colchicine and trim ethylcolchicinic acid on CCl4-induced cirrhosis in the rat. Pharmacology and Toxicology,1996,79(4):241～246
8，徐列明，刘平，刘成，等.桃仁提取物合虫草菌丝抗肝纤维化的实验研 究.中国中医药科技，1995，2(1)：18～20
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Zhang Ronghua, Zhou Zicheng, Hong Duolun,Ai Jiusong
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Abstract:Objective:To investigate the effects of Panax Notoginseng(PN)and Cordycesp Sinensis(CS)on CCl4-induced hepatic fibrosis(HF) .Methods:The model of CCl4-induced HF in rats was treate d with PN、CS or Colchicine (Col). The histological changes were observed with l ight and electronic microscopes. The Serum concentrations of alanine aminotransf erase(ALT)、albumin、hyaluronic acid(HA)、Laminin(LN) were determined and the le vel of hydroxyproline(Hyp) in liver tissue was also measured in order to reflect the extent of hepatocytic lesion and HF. The Col group was set up as positive t reatment control.Results:Severe fatty degeneration and HF can be induced by CCl4 intoxication in rat model. The severe extent of hepatoc ytic lesion, fatty degeneration and infiltration of inflammatory cells was :Mode l group>CS group>Col group>PN group.Conclusion:PN is an id eal drug on anti-chronic hepatic lesion and hepatic fibrosis. CS can exert sign ificant effects on improving regeneration and damage of hepatocytes. Meanwhile, the proliferation of fibroblasts and collagenous fibers were also obviously obse rved. Col has certain effect on preventing hepatic fibrosis, but its side-effec t could not be neglected.
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Key words:hepatic fibrosis drug therapy Panax Notoginsen g Cordyceps Sinensis hyaluronic acid laminin pathology rat
为探讨三七、人工虫草菌丝(简称虫草菌丝)的抗肝纤维化作用，我们采用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)中毒诱导的大鼠肝纤维化模型，研究三七、虫草菌丝对某些血清学 指标、肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量变化和肝组织病理形态改变的影响，并 与秋水仙碱的抗肝纤维化作用进行墩比分析，为进一步研究三七、虫草菌丝防治肝纤维化作 用和机理及指导临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠134只，SPF级，体重180-210g，由第三军医大学动物中心提供。
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1.2 药物及其配制
生三七粉(贵阳中药厂)、虫草菌丝(重庆制药六厂)分别制成3%、6%、12%混悬液，秋水仙碱( 法国HOUDE实验室)制成0.0025%混悬液，4℃保存。
1.3 肝纤维化模型
每只大鼠首次后腿皮下注射CCl4(重庆化学试剂厂)0.05ml/kg，以后注射40%CC14橄榄 油0.03ml/kg，每周两次，共9周。
1.4 动物分组及给药
将实验动物随机分为五组：①空白对照组大鼠接受橄榄油(上海卫辉化学试剂厂)后腿皮下注 射，首次0.05ml/kg，以后0.03ml/kg，每周两次。同时予0.5%羧甲基纤维素钠溶液经口 灌胃，5ml/kg，1/日。②肝纤维化模型组。③秋水仙碱组。模型组和秋水仙碱组在造模的同 时分别予0.5%羧甲基纤维素钠、0.0025%秋水仙碱灌胃，5m/kg,1/日。④三七组。⑤虫草 菌丝组。三七组和虫草菌丝组在预实验取得最佳剂量后，造模的同时予12%三七或虫草菌丝 灌胃，5ml/kg,1/日。
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1.5 标本采集
各组每隔3周处死8只大鼠，最后一次处死大鼠时间为第9周末。用3%戊巴比妥钠腹腔注射0. 02ml/kg，麻醉成功后，经股动脉放血，分离血清，-20℃保存。留取肝脾组织标本。
1.6 检测指标及方法
1.6.1 应用EX7全自动生化测定仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)含量。
1.6.2 应用上海第二军医大学海军医学研究所提供的透明质酸(hyaluron ic acid,HA)、层粘连蛋白(laminin,LN)放免试剂盒，按说明操作，测定HA、LN含量。
1.6.3 肝组织Hyp含量按许志勤法[1]进行测定。
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1.6.4 病理形态学观察
常规HE染色观察肝组织学改变，Van Gieson胶原纤维染色观察胶原纤维增生情况，电镜观察 肝脏超微结构变化。
1.6.5 统计处理
采用第三军医大学医用数理统计程序进行统计处理。
2 结果
2.1 大鼠一般情况
空白对照组处死前均存活，体重增加128±47g/只。模型组实验中死亡7只。至9周处死前， 体重增加34±29g/只，显著低于空白对照组(p<0.05)。秋水仙碱组实验中死亡4只，体重增 加62±23.6g/只，显著低于空白对照组(p<0.01)而高于模型组(p<0.05)。三七组实验中无死 亡，与模型组比较p<0.05，体重增加87±36g/只，显著高于模型组(p<0.01)。虫草菌丝组实 验中死亡3只，与模型组比较p>0.05，体重增加73±40.7g/只，显著高于模型组而 低于空白对照组(p均<0.05)。死亡者均末列入统计。
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2.2 三七、虫草菌丝对实验大鼠肝功能的影响(见表1)
表1 各组大鼠肝功能变化(
±s，n=8)组别
ALT(IU/L)
Albumin(g/L)
Globulin(g/L)
空白对照组
3周
38.47±4.39
34.51±1.69
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24.19±1.57
6周
37.59±5.32
35.09±1.87
23.78±1.45
9周
39.63±5.13
35.55±2.09
24.01±1.62
模型组
3周
225.38±99.78**
, 百拇医药
31.24±1.92**
27.76±2.20**
6周
312.63±72.21**
28.92±2.93**
30.7 8±1.88**
9周
348.63±90.75**
24.41±2.81**
36.5 2±1.09**
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秋水仙碱组
3周
58.38±12.68**△△
33.86±2.62△
24.14±2.25△△
6周
90.25±58.26*△△
32.10±3.97*
24.78±2 .09△△
9周
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110.0±37.55**△△
32.41±1.96**△△
26.45±2.60△△
三七组
3周
67.13±18.39**△△
34.83±1.58△△
24.01±2.50△△
6周
97.63±38.59**△△
, 百拇医药
34.35±1.54△△
23 .91±1.88△△
9周
68.12±14.34**△△＃
34.50±2.74△△
2 3.88±1.69△△＃
虫草菌丝组
3周
58.00±23.33*△△
30.81±2.23**
, 百拇医药
26.52±2.52*
6周
128.50±53.44**△△
30.27±2.33**
2 7.41±1.23**△△
9周
115.38±59.19**△△
30.12±2.13**
2 8.83±3.29**△△
, 百拇医药 与空白对照组相比*：p<0.05**p<0.01 与模型与相比 △：p<0.05 △△:p<0.01
与秋水仙碱组相比 ＃:p<0.01
如表1所示，模型组、秋水仙碱组、三七组、虫草菌丝组不同时相ALT含量均显著高于同期空 白对照组(p<0.01或0.05)，而以模型组最高，显著高于其他同期各组(p<0.01)。模型组白 蛋白下降，3、9周时与秋水仙碱组相比差异显著(p<0.05和p<0.01)，而与虫草菌丝组相比P> 0.05。三七组ALT最低。9周时，三七组ALT低于秋水仙碱组。模型组白蛋白下降，与秋水仙 碱组和三七组相比差异显著(p<0.05或p<0.01)，而与虫草菌丝组相比无差异。模型组球蛋白 增加与其他各组比较差异显著(除虫草菌丝组3周时外)。
2.3 三七、虫草菌丝对大鼠血清HA、LN和肝组织中Hyp的影响(见表2)
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表2 大鼠血清HA、LN和肝组织Hyp的变化(
±s，n=8)组别
HA(μg/L)
LN(μg/L)
Hyp(mg/g)
空白对照组
3周
97.32±15.28
32.47±5.01
2.01±0.39
, 百拇医药 6周
98.45±16.03
33.38±4.56
2.22±0.41
9周
100.13±17.1
33.86±4.28
2.39±0.46
模型组
3周
116.16±20.2
37.48±5.79
, 百拇医药
2.86±0.77
6周
139.69±18.97*
5.70±7.32**
3.56±0.77**
9周
198.78±34.54**
85.56±12.34**
3.9 5±0.98**
秋水仙碱组
, 百拇医药
3周
115.91±21.86
35.47±3.78
2.60±0.57
6周
129.64±22.07**
40.01±6.14*△△
2. 78±0.54△
9周
147.51±21.89**△△
45.81±9.30**
, 百拇医药
3 .11±0.42**
三七组
3周
109.50±17.76
33.04±4.93
2.48±0.41
6周
112.99±20.54△
37.44±4.90△△
2.80±0.6 4△
9周
, 百拇医药
141.56±23.55**△
39.20±4.93*△△
2 .97±0.69△
虫草菌丝组
3周
116.49±21.22
34.68±3.92
2.67±0.50
6周
127.42±21.58*
42.19±8.87*△△
, 百拇医药
2.92±0 .52△
9周
147.81±20.57**△△
50.49±10.33**△△
3.24±0.31**
与空白对照组相比*：p<0.05 **:P<0.01 与模型组相比 △：p<0.05 △△：p<0.01
如表2所示，各组大鼠不同相时血清HA、LN，肝Hyp均较空白对照组升高，且以9周时最为明 显，而三个药物预防组6周时血LN和肝Hyp显著低于同期模型组，9周时血HA与模型组相比P<0 .01，说明慢性CCL4中毒性肝纤维化存在胶原代谢异常，主要表现为血HA、LN和肝Hyp含量 增加，而三七、虫草菌丝和秋水仙碱对此有抑制作用。
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2.4 病理形态学观察
2.4.1 肝脾大体形态观察
模型组3周末肝脏开始肿大，9周末停止肿大，韧度增加，有油腻感。其中有1只大鼠肝脏体 积缩小，黄褐色，表面呈细节状，有腹水。脾脏从第6周末开始肿大，9周末肿大最明显。秋 水仙碱组、虫草菌丝组3周末肝脏开始肿大，9周末仍肿大，但较模型组轻，脾脏肿大不明显 。
2.4.2 光镜观察
HE染色和Van Gieson胶原纤维染色后观察，见对空白照组肝小叶结构完整，无变性、坏死、 炎细胞浸润和纤维组织增生。模型组3周时肝细胞广泛脂肪变性，可见少量增生的纤维组织 ；6周时肝组织脂肪变性加重，残存少量肝细胞；9周时肝组织大片脂肪变性，呈空网状，仅 残存少量肝细胞，变性肝组织中穿插纤维组织条索。三七组3周时肝组织脂肪变性较模型组 及秋水仙碱组轻，汇管区少量纤维组织；6周时部分肝组织脂肪变性，肝内灶性炎细胞浸润 ，肝小叶间和中央静脉周围少量纤维组织增生；9周时中央静脉周围大片肝组织脂肪变性， 汇管区及界板区纤维组织少量增生。秋水仙碱组3周时界板区大量脂肪空泡，炎细胞浸润较 多，有少量纤维组织增生；6周时肝组织呈大片网状变性坏死，变性区有成纤维细胞增生和 炎细胞浸润，小叶间少量纤维组织增生；9周时汇管区纤维组织增生，并向周围放射生长， 可见再生肝细胞，界板区纤维组织增生。虫草菌丝组3周时肝中央静脉及小叶结构可见，界 板区肝组织脂肪变性明显，界板及中央静脉周围较多纤维母细胞增生，呈放射状排列；6周 时，肝组织大量脂肪变性，再生肝细胞较多，呈团状，有炎细胞浸润；9周时，肝细胞索排 列紊乱，肝细胞成团增生，体积大，胞浆呈泡沫状，可见双核细胞，小叶间纤维组织增生， 肝假小叶形成。
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此外，对脾脏进行HE染色观察，见正常脾脏有大量淋巴细胞，红、白髓分界明显，模型组脾 窦充血明显，秋水仙碱组的脾脏红髓结构紊乱，有较多不规则空泡形成，有核细胞数量减少 ，有纤维组织样结构形成。
2.4.3 电镜观察
模型组肝细胞浆内充满大小不等的脂肪空泡，有的肝细胞核被挤压变形，核内亦可见空泡。 浆胞内滑面内质网增生，呈典型的肝细胞中毒损伤后的超微结构特征性改变。变性的肝细胞 内线粒体电子密度增强，脊模糊或消失呈均质状。而秋水仙碱组、三七组和虫草菌丝组上述 改变较轻微。
3 讨论
综合各组形态改变和功能变化特点，并与其他组对比分析，可以看出：
3.1 大鼠慢性CCl4中毒可引起肝组织脂肪变性和肝纤维化，病变程度随 中毒时间延长而加重。
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3.2 三七对CCl4引起的肝细胞损伤具有一定保护作用，与虫草菌丝和秋 水仙碱相比保护作用稍强。三七促进肝细胞再生作用没有虫草菌丝强，未见到形成典型再生 肝细胞团块结构。更突出的特点是三七组肝组织成纤维细胞及胶原纤维增生较少，这是与模 型组和虫草菌丝组的最大差别。正是因为三七对肝细胞有相对明显的保护作用，同时减少成 纤维细胞及胶原纤维增生，故有利于减慢肝纤维化的进程。其预防肝纤维化作用，可能是通 过抑制肝脏炎症坏死，促进白蛋白合成及胶原分解，减少胶原合成而实现的。
3.3 人工虫草菌丝组与模型组比较，整体病情明显减轻；肝功能损害远不 如模型组严重，但比空白对照组ALT明显增高；形态学研究观察到虫草菌丝组的肝组织仍发 生灶性或大片有肝细胞脂变及炎细胞浸润，但病变程度较模型组轻。说明虫草菌丝对CCl4 中毒引起肝细胞损伤具有一定的保护作用，但作用较弱。虫草菌丝组有一突出特点是促进肝 细胞再生作用强，再生肝细胞比其他组都多；同时，成纤维细胞和胶原纤维增生也很明显， 有的区域增生的纤维围绕再生肝细胞团形成假小叶结构，部分再生肝细胞再度脂变。我们认 为，虫草菌丝促进肝细胞再生修复对机体是有利的，尤其在肝病早期，肝组织网状支架结构 未严重破坏时应用虫草菌丝促进肝细胞沿网状支架再生修复，恢复正常的肝细胞索结构，才 能达到形态和功能的恢复。如果病情发展到一定严重程度，肝组织网状支架塌陷，再生的肝 细胞成团生长，则不能达到结构修复。尤其值得注意的是，虫草菌丝不仅促进肝细胞再生， 而且促进成纤维细胞和胶原纤维增生，这势必将加快肝纤维化的进程。因此在临床应用中应 充分权衡其利弊。
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3.4 秋水仙碱对肝细胞损伤有一定保护作用，但不如三七作用明显，成纤 维细胞及胶原纤维增生比虫草菌丝组少，比三七组多，再生肝细胞较少。所以肝纤维化进程 没有模型组及虫草菌丝组快。但用秋水仙碱后，脾脏有核细胞(主要是淋巴细胞)数量明显减 少，形成不规则空网结构和纤维样结构，显然这将导致机体免疫功能抑制。
综合分析各组肝组织纤维化的严重程度依次为：模型组>虫草菌丝组>秋水仙碱组>三七组。 本实验条件下，三七组是较理想的预防肝纤维化的药物，并且没有秋水仙碱的毒副作用。
3.5 根据中医辨证，结缔组织增生性疾病(包括肝纤维化和肝硬化)与血瘀 证相关，而活血化瘀药物对此类疾病有独特的功效。在肝纤维化的治疗中，目前以活血化瘀 及益气活血法应用得最为广泛。
三七是经典的止血活血良药。临床观察发现，三七有利胆、退黄、降酶等作用，可提高慢肝 病患者的血浆白蛋白[2]。药理研究证实，三七对动物实验性急性肝损伤有明显的 防治作用，其有效成分三七总皂甙是缺血再灌注损伤的有效保护药物[3]，但对其 防治肝纤维化作用研究报道较少。
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人工虫草菌丝是人工培育的和冬虫夏草有类似作用的药物。它具有调节人体免疫功能及抗免 疫损伤性肝硬化的作用，是治疗病毒性肝炎、肝硬化的一个值得推广的药物[4]。 刘成等[5]用该药治疗肝炎后肝硬化的研究表明，该药能提高机体免疫机能，加强 对病毒的消除能力，保护肝细胞而间接抑制肝纤维化的发生发展。朱家旋等[6]用 虫草菌丝对大鼠免疫损伤导致的肝纤维化防治作用的研究表明，该方不仅能减轻肝脏的炎性 细胞浸润和肝细胞变性坏死、抑制总胶原、特别是Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝内的沉积，而且能使已 形成的胶原重新溶解和吸收。
中医认为，虫草为滋补之品，性温，有养阴、补精、益髓之功。而肝硬化(纤维化)又是虚实 夹杂之证，为本虚标实，瘀虚共存。在全病过程中，不同程度的存在着气滞、血瘀、水停、 湿热或寒湿等邪，血瘀是肝纤维化的基本病机，故其治疗在益气、养阴、补益肝肾、疏肝健 脾、软坚散结的同时，离不开活血化瘀。单纯地使用虫草补药则有留邪之弊。这与本实验研 究发现有吻合之处。
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秋水仙碱已用于临床治疗慢性肝病，长期应用可防治实验性和临床病人的肝纤维化和肝硬化 ，并有抑制胶原分泌的作用，被认为是治疗人类肝纤维化的有希望的药物[7]。从 本研究结果分析，秋水仙碱确有抗肝纤维化作用，但毒副作用不容忽视，不宜长期服用。
有学者报道[8]，桃仁提取物合虫草菌丝具有明显的抑制肝内胶原蛋白沉积和纤 维组织增生以及促进纤维化肝脏结缔组织降解的作用。我们推测，如果将虫草菌丝和三七有 机伍用，协同保护肝细胞，早期促进肝细胞再生修复，同时又抑制成纤维细胞增生，可望达 到恢复肝功能、防止肝纤维化的目的。这值得进一步研究。
参考文献
1，许志勤，高兴兰.组织羟脯氨酸测定方法的改进.解放军预防医学杂志 ，1990，8(1)：40～42
2，陶文生，韩淑芳.三七有利胆、退黄、降酶等作用.中医杂志，1994， 35(2)：71
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3，梁力建，何强，吕明德，等.三七总皂甙对大鼠肝缺血再灌注损伤的保 护作用.新消化病学杂志，1997，5(7)：419～420
4，吴勤，唐善令，杨生.冬虫夏草治疗慢性肝病的研究进展.中西医结合 肝病杂志，1997，7(1)：57～59
5，刘成，薛惠明，徐列明.人工虫草菌丝制剂治疗肝炎后肝硬化22例.上 海中医药杂志，1986，(6)：30～31
6，，朱家旋，王宝恩，王泰玲.冬虫夏草对实验性免疫损伤性肝纤维化的预 防和治疗作用的研究.中华消化杂志，1994，14(6)：333～335
7，Cedillo A, Mourelle M, Muriel P. Effect of colchicine and trim ethylcolchicinic acid on CCl4-induced cirrhosis in the rat. Pharmacology and Toxicology,1996,79(4):241～246
8，徐列明，刘平，刘成，等.桃仁提取物合虫草菌丝抗肝纤维化的实验研 究.中国中医药科技，1995，2(1)：18～20
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