细针穿刺乳腺组织端粒酶活性检测的临床意义
作者：赵庆丽 张宗久
单位：甘肃省肿瘤医院 兰州 730050
关键词：乳腺肿瘤；细针穿刺活检；端粒酶；PCR-ELIS法
中国现代医学杂志000614 目的：探讨术前细针穿刺活检乳腺组织(FNA)，检测端粒酶活性对乳腺肿瘤的诊断价值。方法：用PCR-ELISA法检测70例术前乳腺组织细针穿刺活检标本中的端粒酶活性，与术后病理检查相对照。结果：良、恶性乳腺肿瘤组织细针穿刺活检端粒酶阳性率差异有显著性(P<0.01)，恶性乳腺肿瘤端粒酶阳性率随病理分型的恶化，肿瘤直径的增大及淋巴结有无转移而增高。结论：术前乳腺组织细针穿刺活检端粒酶活性分析有利于良、恶性乳腺肿瘤的早期鉴别诊断，了解恶性乳腺肿瘤的进展情况。
分类号 R737.9
细针穿刺活检在乳腺肿瘤诊断中应用日趋广泛。本文应用PCR-ELISA法检测70例细针穿刺活检乳腺组织中端粒酶活性，结合术后病理诊断，判断细针穿刺活检在乳腺肿瘤的诊断价值。
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1.1 一般资料
女性乳腺疾病患者70例，年龄15～80岁，平均41.3岁，良性乳腺疾病39例，乳腺纤维腺瘤15例，乳腺囊性增生病24例；恶性乳腺肿瘤31例，早期浸润性导管癌3例；浸润性特殊癌3例，乳头状癌1例，髓样癌伴淋巴细胞浸润1例，鳞癌1例；浸润性非特殊癌24例，浸润性小叶癌3例，浸润性导管癌9例，单纯癌5例，腺癌1例，乳腺肉瘤1例。以上病理学诊断皆经病理科证实。
1.2 方法
患者于术前1天，结合钼靶X照相于肿物中心处或钙化点簇集处定位细针穿刺活检乳腺组织，立刻将针吸组织置于无菌小管中，于液氮中速冻保存于-80℃冰箱备用。
1.3 端粒酶活性测定及评价标准
取无菌小管中冰冻组织→恒冷冰冻切片机切片(15um×30)→收集于试管中→加入200ul冰冷裂解充分混匀→冰浴30min→4℃12?000rpm离心20min→收集上清液3ul加于含有25ul端粒酶混合液和20ul H2O的PCR反应管中混匀→25℃孵育30min→94℃灭活5min到PCR仪(PE480型)上进行PCR循环：94℃30s→50℃30s→72℃90s。30个循环72℃10min终止反应。阳性对照为239细胞株，阴性对照94℃10min灭活的组织裂解上清液。取5ulPCR产物加于含有20ul的变性液的反应管中→室温20min→加225ul杂交液混匀后取100ul加于有亲和素包被的96孔板中→37℃震荡2h→弃去液体→洗液洗3次→加100ul过氧化物酶(peroxidase,POD)标记的抗地高辛抗体(Anti-Dig-POD)37℃30min→弃去液体→洗液洗2次→加100ul四甲基联苯胺(Tetramethl Benzidine,TMB)→加100ul室温显色20min→加100ul终止液终止反应→20min内在酶标仪(Σ960型)上读取A450和A690吸收值。根据A=A450-A690计算结果。端粒酶活性评价标准为阳性对照A值应大于1.5，阴性对照A值应小于0.25，待检标本A值减阴性对照A值大于0.2者视为端粒酶阳性。采用本法对72例乳腺组织端粒酶活性检测，结果详见附表。
, 百拇医药
附表 70例乳腺组织端粒酶活性分析 项目
例数
阳性率(%)
P
乳腺良性病变
39
6(15.3)
乳腺纤维腺瘤
15
3(20)
乳腺增生病
24
3(12.5)
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乳腺恶性肿瘤
26
24(92.3)
P<0.01
早期浸润癌
3
1(33)
浸润性特殊癌
3
2(66)
浸润性非特殊癌
24
21(83)
, 百拇医药
0.05>P>0.01
Ⅰ
3
1(33)
Ⅱ
7
5(71.4)
0.05>P>0.01
Ⅲ
14
13(92.8)
P<0.01
Ⅳ
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0
乳腺肉瘤
1
0
肿瘤直径
<20mm
12
8(66.6)
>20mm
19
17(89.4)
P<0.01
淋巴结转移阴性
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10
6(60.6)
淋巴结转移阳性
21
19(90.8)
P<0.01
注：乳腺良性肿瘤与恶性肿瘤组织比较P<0.01
早期浸润癌与浸润性特殊癌比较0.05>P>0.01
浸润性非特殊癌Ⅱ与Ⅲ比较0.05>P>0.01，Ⅰ与Ⅲ比较P<0.01
肿瘤直径<20mm与>20mm比较P<0.01
淋巴结转移阴性与淋巴结转移阳性比较P<0.013 讨论
, 百拇医药
目前资料显示，通过高灵敏度的PCR-TRAP方法检测发现，端粒酶几乎在各种人类恶性肿瘤中均有不同程度的表达，总的表达率在85%，可能是目前已知的最为广谱的恶性肿瘤分子标记物[1]，这说明端粒酶在肿瘤诊断中存在着潜在价值。目前诊断恶性肿瘤的金标准是组织病理诊断，它能对大多数怀疑为恶性的组织标本做出准确的诊断，但对于某些细胞穿刺，组织切缘，细胞涂片及体液来源的标本，如胸水，腹水，腹腔冲洗液，膀胱冲洗液和痰液等诊断的准确性不高[1]。由于PCR-TRAP方法能探及10～15个肿瘤细胞的端粒酶活性，利用这种方法检测这类标本中端粒酶活性，有可能成为某些恶性肿瘤诊断检测，筛选的标记物，但是同位素的应用给普及和应用带来不便。PCR-ELISA端粒酶活性分析法由于采取双标和杂交及ELISA分析，所以其特异性和敏感性与同位素法相似，且不需要同位素。由于PCR-ELISA法简便快速，且特异性和敏捷性也较高，有可能广泛应用。但是PCR-ELISA法与TRAP法一样，其结果为非线性，故只能半定量端粒酶活性，此为该法最大的缺陷，有待改进。本组病例对70例乳腺细针穿刺组织端粒酶活性分析，显示良性乳腺疾病的端粒酶阳性率与恶性肿瘤相比差异有高度显著性，恶性肿瘤的端粒酶活性随病理类型的进展和肿瘤直径增大，淋巴结转移数目增多而逐渐增高，而且早期(早期浸润癌和期)和分化较好的浸润性特殊癌其端粒酶活性皆低于晚期(Ⅱ、Ⅲ期)和分化相对较差的浸润性非特殊癌[2]，本实验的数据与乳腺肿瘤病理组织端粒酶活性分析相一致[3]，表明乳腺细针穿刺组织检测端粒酶活性具有实用性和敏感性。我们认为，术前乳腺细针穿刺组织检测端粒酶活性，结合临床资料，有利于对良性、恶性乳腺肿瘤的早期鉴别诊断，判断恶性乳腺肿瘤的进展，对临床治疗具有指导意义。
参考文献
1，周春晓，陆士新，孙建衡.端粒酶在肿瘤研究中的意义.中华肿瘤杂志，1999；21(5)：235～236
2，Hiyama E,Gollahon Lkataoka T,et al.Telomerase actitvity in human breast tumors.Jnatl Cancer Inst,1996;882:116～122
3，王 欣，邹声泉.乳腺肿瘤端粒酶活性检测的临床意义.中华实验外科杂志，1999；16(3)：270～271, 百拇医药
单位：甘肃省肿瘤医院 兰州 730050
关键词：乳腺肿瘤；细针穿刺活检；端粒酶；PCR-ELIS法
中国现代医学杂志000614 目的：探讨术前细针穿刺活检乳腺组织(FNA)，检测端粒酶活性对乳腺肿瘤的诊断价值。方法：用PCR-ELISA法检测70例术前乳腺组织细针穿刺活检标本中的端粒酶活性，与术后病理检查相对照。结果：良、恶性乳腺肿瘤组织细针穿刺活检端粒酶阳性率差异有显著性(P<0.01)，恶性乳腺肿瘤端粒酶阳性率随病理分型的恶化，肿瘤直径的增大及淋巴结有无转移而增高。结论：术前乳腺组织细针穿刺活检端粒酶活性分析有利于良、恶性乳腺肿瘤的早期鉴别诊断，了解恶性乳腺肿瘤的进展情况。
分类号 R737.9
细针穿刺活检在乳腺肿瘤诊断中应用日趋广泛。本文应用PCR-ELISA法检测70例细针穿刺活检乳腺组织中端粒酶活性，结合术后病理诊断，判断细针穿刺活检在乳腺肿瘤的诊断价值。
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1.1 一般资料
女性乳腺疾病患者70例，年龄15～80岁，平均41.3岁，良性乳腺疾病39例，乳腺纤维腺瘤15例，乳腺囊性增生病24例；恶性乳腺肿瘤31例，早期浸润性导管癌3例；浸润性特殊癌3例，乳头状癌1例，髓样癌伴淋巴细胞浸润1例，鳞癌1例；浸润性非特殊癌24例，浸润性小叶癌3例，浸润性导管癌9例，单纯癌5例，腺癌1例，乳腺肉瘤1例。以上病理学诊断皆经病理科证实。
1.2 方法
患者于术前1天，结合钼靶X照相于肿物中心处或钙化点簇集处定位细针穿刺活检乳腺组织，立刻将针吸组织置于无菌小管中，于液氮中速冻保存于-80℃冰箱备用。
1.3 端粒酶活性测定及评价标准
取无菌小管中冰冻组织→恒冷冰冻切片机切片(15um×30)→收集于试管中→加入200ul冰冷裂解充分混匀→冰浴30min→4℃12?000rpm离心20min→收集上清液3ul加于含有25ul端粒酶混合液和20ul H2O的PCR反应管中混匀→25℃孵育30min→94℃灭活5min到PCR仪(PE480型)上进行PCR循环：94℃30s→50℃30s→72℃90s。30个循环72℃10min终止反应。阳性对照为239细胞株，阴性对照94℃10min灭活的组织裂解上清液。取5ulPCR产物加于含有20ul的变性液的反应管中→室温20min→加225ul杂交液混匀后取100ul加于有亲和素包被的96孔板中→37℃震荡2h→弃去液体→洗液洗3次→加100ul过氧化物酶(peroxidase,POD)标记的抗地高辛抗体(Anti-Dig-POD)37℃30min→弃去液体→洗液洗2次→加100ul四甲基联苯胺(Tetramethl Benzidine,TMB)→加100ul室温显色20min→加100ul终止液终止反应→20min内在酶标仪(Σ960型)上读取A450和A690吸收值。根据A=A450-A690计算结果。端粒酶活性评价标准为阳性对照A值应大于1.5，阴性对照A值应小于0.25，待检标本A值减阴性对照A值大于0.2者视为端粒酶阳性。采用本法对72例乳腺组织端粒酶活性检测，结果详见附表。
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附表 70例乳腺组织端粒酶活性分析 项目
例数
阳性率(%)
P
乳腺良性病变
39
6(15.3)
乳腺纤维腺瘤
15
3(20)
乳腺增生病
24
3(12.5)
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乳腺恶性肿瘤
26
24(92.3)
P<0.01
早期浸润癌
3
1(33)
浸润性特殊癌
3
2(66)
浸润性非特殊癌
24
21(83)
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0.05>P>0.01
Ⅰ
3
1(33)
Ⅱ
7
5(71.4)
0.05>P>0.01
Ⅲ
14
13(92.8)
P<0.01
Ⅳ
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0
乳腺肉瘤
1
0
肿瘤直径
<20mm
12
8(66.6)
>20mm
19
17(89.4)
P<0.01
淋巴结转移阴性
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10
6(60.6)
淋巴结转移阳性
21
19(90.8)
P<0.01
注：乳腺良性肿瘤与恶性肿瘤组织比较P<0.01
早期浸润癌与浸润性特殊癌比较0.05>P>0.01
浸润性非特殊癌Ⅱ与Ⅲ比较0.05>P>0.01，Ⅰ与Ⅲ比较P<0.01
肿瘤直径<20mm与>20mm比较P<0.01
淋巴结转移阴性与淋巴结转移阳性比较P<0.013 讨论
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目前资料显示，通过高灵敏度的PCR-TRAP方法检测发现，端粒酶几乎在各种人类恶性肿瘤中均有不同程度的表达，总的表达率在85%，可能是目前已知的最为广谱的恶性肿瘤分子标记物[1]，这说明端粒酶在肿瘤诊断中存在着潜在价值。目前诊断恶性肿瘤的金标准是组织病理诊断，它能对大多数怀疑为恶性的组织标本做出准确的诊断，但对于某些细胞穿刺，组织切缘，细胞涂片及体液来源的标本，如胸水，腹水，腹腔冲洗液，膀胱冲洗液和痰液等诊断的准确性不高[1]。由于PCR-TRAP方法能探及10～15个肿瘤细胞的端粒酶活性，利用这种方法检测这类标本中端粒酶活性，有可能成为某些恶性肿瘤诊断检测，筛选的标记物，但是同位素的应用给普及和应用带来不便。PCR-ELISA端粒酶活性分析法由于采取双标和杂交及ELISA分析，所以其特异性和敏感性与同位素法相似，且不需要同位素。由于PCR-ELISA法简便快速，且特异性和敏捷性也较高，有可能广泛应用。但是PCR-ELISA法与TRAP法一样，其结果为非线性，故只能半定量端粒酶活性，此为该法最大的缺陷，有待改进。本组病例对70例乳腺细针穿刺组织端粒酶活性分析，显示良性乳腺疾病的端粒酶阳性率与恶性肿瘤相比差异有高度显著性，恶性肿瘤的端粒酶活性随病理类型的进展和肿瘤直径增大，淋巴结转移数目增多而逐渐增高，而且早期(早期浸润癌和期)和分化较好的浸润性特殊癌其端粒酶活性皆低于晚期(Ⅱ、Ⅲ期)和分化相对较差的浸润性非特殊癌[2]，本实验的数据与乳腺肿瘤病理组织端粒酶活性分析相一致[3]，表明乳腺细针穿刺组织检测端粒酶活性具有实用性和敏感性。我们认为，术前乳腺细针穿刺组织检测端粒酶活性，结合临床资料，有利于对良性、恶性乳腺肿瘤的早期鉴别诊断，判断恶性乳腺肿瘤的进展，对临床治疗具有指导意义。
参考文献
1，周春晓，陆士新，孙建衡.端粒酶在肿瘤研究中的意义.中华肿瘤杂志，1999；21(5)：235～236
2，Hiyama E,Gollahon Lkataoka T,et al.Telomerase actitvity in human breast tumors.Jnatl Cancer Inst,1996;882:116～122
3，王 欣，邹声泉.乳腺肿瘤端粒酶活性检测的临床意义.中华实验外科杂志，1999；16(3)：270～271, 百拇医药