薏苡仁多糖的分离提取及其降血糖作用的研究
作者：徐梓辉 周世文 黄林清
单位：徐梓辉(第三军医大学附属新桥医院临床药理基地，重庆 400037)；周世文(第三军医大学附属新桥医院临床药理基地，重庆 400037)；黄林清(第三军医大学附属新桥医院临床药理基地，重庆 400037)
关键词：薏苡仁多糖；糖尿病模型；降血糖作用
第三军医大学学报000620 提 要： 目的 从薏苡仁中分离提取薏苡仁多糖(Coixan)，并观察其对多种模型小鼠血糖水平的影响。方法 ①采用热水提取、低温减压浓缩、三氯醋酸法去蛋白、流水透析、Sephadex G-75柱层析等方法。②采用四氧嘧啶、肾上腺素尾静脉注射建立高血糖小鼠模型，尾静脉取血，血糖仪测定血糖水平。结果 ①被提取的薏苡仁多糖是鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，分子量约为1.5×104，产率为0.125%；②口服给予Coixan对正常小鼠无明显降血糖作用；腹腔给予Coxian剂量在50 mg/kg和100 mg/kg时，能降低正常小鼠、四氧嘧啶糖尿病模型小鼠和肾上腺素高血糖小鼠的血糖水平(P<0.05&P<0.01)。且呈现一定的量效关系。结论 薏苡仁多糖对正常及高血糖模型小鼠均有降血糖作用，其降血糖作用与给药途径有关。
中图法分类号： R284.2;R285 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)06-0578-04
Extraction and hypoglycemic action of a polysaccharide from the seeds of coix lacchryma-jobi var, ma-yuen
XU Zi-hui, ZHOU Shi-wen, HUANG Lin-qing
(Base of Clinical Pharmacology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
Abstract： Objective To study the method of extraction of coixan, a polysaccharide from the seeds of coix lacchryma-jobi var, ma-yuen and its hypoglycemic action in mice. Methods ①The dried coix seeds were extracted with hot water and the extract was concentrated under lower pressure to get the crude coixan. Its protein content was removed with trichloracetic acid (TCA). Then the crude coixan was dialyzed with cellulose tubings against flowing water for 7 d and chromatographed over sephadex G-75 with a column of (0-1)mol/L NaCl to obtain purified coixan. ②The model of diabetes mellitus was established with alloxan injection through the tail vein in mice and the mode of hyperglycemia with adrenaline injection in mice too. Blood samples were collected with tail vein puncture to determine blood glucose level. Results ①Refined coixan of 0.125% yielding consisted of rhamonse, arabinose, mannose, galactose and glucose with an estimated molecular weight of 1.5×104. ②Oral administration of coixan to normal mice showed no obvious action to decrease blood glucose level. Peritoneal administration of coixan in the dosage from 50 to 100 mg/kg was able to decrease blood glucose level significantly in normal mice, diabetic and hyperglycemic mice (P<0.05 to P<0.01) in dosage-dependent manner. Conclusion Coixan is able to decrease the blood glucose level in normal, diabetic and hyperglycemic mice and its hypoglycemic action is determined by the route of administration.
Key words: coixan; diabetes model; hypoglycemic action
薏苡仁为禾本科植物薏苡(Coix lachrgma-jobi var ma-yuen)的种仁。据载具有“温气主消渴”作用， 为中医学临床上治疗“消渴”(糖尿病)常用药物之一[1]。(日)Takahashi M等对其水溶性提取物的实验研究中，发现薏苡仁多糖(Coixan)有显著降血糖作用[2]。然而目前对其降血糖作用机制尚缺乏全面深入的研究，国内还未见Coixan的研究报道。因此，我们就Coixan的分离提取、理化性质及药理活性进行了探讨，现报告如下。
1 材料
1.1 药品与试剂 薏苡仁由重庆市药材公司提供(由我院副主任药师葛勤鉴定)，Sephadex G-75，蓝色葡聚糖为Sigma公司产品，四氧嘧啶(Alloxan)购自Fluka公司。
1.2 动物
昆明种小白鼠，雄性，体重(20±2)g，由第三军医大学实验动物中心提供。
2 方法与结果
2.1 Coixan的提取和纯化
称取薏苡仁10.0 kg加热水(60°C)30 L抽提12 h，滤后再次加入同一温度热水30 L，提取12 h，将所得抽提液混合减压浓缩脱水，得黄色粗提物。将粗提物用蒸馏水溶解，加入等体积15%三氯醋酸(TCA)振荡10 h，使蛋白质与TCA作用生成凝胶物，3000 r/min离心20 min去沉淀，将上清液装入透析袋中，流水透析7d，透析液中逐渐加入1倍量的95%乙醇沉淀，将沉淀物相继用丙酮和乙醚洗涤，真空干燥，再将多糖用蒸馏水溶解，经Sephadex G-75柱层析，用0～1mol/L NaCl溶液梯度洗脱，硫酸-苯酚法[3]鉴定多糖部分，合并多糖反应阳性部分，用蒸馏水透析3 d，减压浓缩，得白色多糖精品，产率为0.125%。
2.2 Coixan的理化性质鉴定
2.2.1Fehling′s反应[4] 称取Coixan、薏苡仁多糖粗提物、葡萄糖、蔗糖各10 mg分装于1、2、3、4试管中，每管加入双蒸水8 ml，摇匀，让其充分溶解，在1、2试管中加入12 mol/L HCl 2 ml后，放入沸水浴中加热30 min，取出试管加入NaOH溶液中和至碱性，再向1、2试管中各加入新配制的费林试剂2 ml摇匀后，放入沸水浴中再加热约3 min后，见有红色沉淀产生。向试管3、4中各加入新配制的费林试剂2 ml，摇匀后再放入沸水浴中加热约2 min，试管3出现大量的红棕色沉淀，5 min后试管4出现少量红棕色沉淀。
2.2.2 酸水解纸层析(PPC)[5] 采用杭州新华滤纸厂产慢速定性层析滤纸(Ⅲ)(10 cm×15 cm)，正丁醇-吡啶-水(6∶4∶3)作溶剂系统，取Coixan 5 mg用2 N H2SO4 2 ml封管在100°C水解3 h，用各种标准单糖作对照，点样后滤纸置于层析缸中饱和1 h，室温展开约16 h，取出干燥后，再重复展开1次，硝酸银一氢氧化钠试剂显色，5%硫代硫酸钠溶液褪色，样品斑点呈褐色，显示含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖。
2.2.3 分子量测定[6] 采用凝胶过滤法测定分子量，根据Kosenko认为分子量小于5万的多糖可采用Sephadex G-75柱层析计算法。将充分溶胀好的Sephadex G-75湿法装柱，用0.5 mol/L NaCl溶液进行平衡，然后将待测Coixan水溶液上柱，同一离子强度的水溶液洗脱，苯酚-硫酸法测定求得洗脱体积Ve，然后再将蓝色葡聚糖(MN>200万)上同一柱，求出柱之空体积Vo，代入公式M1/3=65.45[1.56-(Ve/Vo)1/3]，得薏苡仁多糖分子量约为1.5×104。
2.3 降血糖活性测定
2.3.1Coixan对正常小鼠血糖水平的影响 取正常小鼠50只，随机分5组，每组10只，给药组分别按要求i.g100mg/kg和200mg/kg以及i.p50mg/kg和100mg/kgCoixan，对照组予等体积生理盐水，给药后0、2、7h尾静脉采血，用葡萄糖氧化酶法测定血糖水平，实验期间小鼠禁食12h，自由饮水。结果显示：口服给予Coixan剂量在100mg/kg和200mg/kg时，对正常小鼠无明显影响，而腹腔给药剂量在50mg/kg和100mg/kg时，均有显著的降血糖作用，且降低的程度呈剂量依赖性，见表1。
表1 薏苡仁多糖对正常小鼠血糖水平的影响(
±s，%)Tab 1 Effect of Coixan on blood glucose level in normal mice(
±s，%) GroupDose(mg/kg)
n
Relative blood glucose level
0
2 h
7 h
Control
10
100
95.2±9.15
88.8±9.47
Coixan
100 i.g
10
100
93.5±11.12
86.5±10.34
Coixan
200 i.g
10
100
91.6±10.37
83.6±9.89
Coixan
50 i.P
10
100
86.7±9.63*
66.8±9.52* *
Coixan
100 i.p
10
100
68.3±8.12* *
47.6±9.41* *
*：P<0.05,* *：P<0.01 vs control
2.3.2 Coixan对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖水平的影响 将小鼠禁食48 h后，四氧嘧啶70 mg/kg(临用前用生理盐水配制)尾静脉一次性注射建立模型[7]，对照组给予同样体积的生理盐水，72 h后选取血糖>10 mmol/L作为糖尿病模型小鼠，取糖尿病模型小鼠30只，随机均分为3组，另取10只正常小鼠作对照，分别按要求i.p 50 mg/kg和100 mg/kg Coixan，正常对照组和模型对照组则给予等体积的生理盐水，给药后0、2、7、24 h尾静脉取血测血糖。结果显示腹腔注射Coixan在剂量50 mg/kg和100 mg/kg时，对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠均有明显的降血糖作用。虽高于正常对照组，但与模型对照组相比，2、7 h血糖值可下降20%～40%，见表2。
表2 薏苡仁多糖对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠血糖水平的影响(CB/mmol.L-1，
±s，n=10)Tab 2 Effect of Coixan on blood glucose level in alloxan-induced hyperglycemic mice(CB/mmol.L-1，
±s，n=10) GroupDose(mg/kg i.p)
0
2 h
7 h
24 h
Normal
Saline
5.93±0.98
5.74±0.64
4.93±0.61
3.67±1.57
Control
Saline
17.86±3.97* *
17.75±3.21* *
15.62±3.54* *
13.52±3.91* *
Coixan
50
19.14±3.68* *
16.70±2.89* * ▲
12.41±2.72* * ▲
11.26±3.19* * ▲
Coixan
100
18.09±3.17* *
14.80±2.51* * ▲
9.27±2.33* * ▲ ▲
9.16±2.78* * ▲ ▲
* *：P<0.01 vs N, ▲：P<0.05,▲ ▲：P<0.01 vs C
2.3.3 Coixan对肾上腺素致小鼠高血糖水平的影响 取正常小鼠40只，禁食12 h后，随机分为4组，每组10只，用药组i.p Coixan(50,100 mg/kg)，模型对照组和空白对照组给予同体积生理盐水，给药3 h后，用药组、模型对照组i.p肾上腺素(20 μg/kg)，30 min后取血测血糖。结果显示：Coixan在剂量50 mg/kg和100 mg/kg时，能够明显抑制肾上腺素导致的小鼠高血糖，见表3。
表3 薏苡仁多糖对肾上腺素高血糖小鼠血糖水平的影响(
±s，n=10)Tab 3 Effect of Coixan on blood glucose level in adrenalinehyperglycemic mice(
±s，n=10) GroupsDose
(mg/kg i.p)
Adr
(μg/kg i.p)
Blood glucose
level(CB/mmol*L-1，)
Normal
Saline
5.63±0.61
Control
Saline
20
10.6±1.81* *
Coixan
50
20
7.62±0.69▲
Coixan
100
20
6.83±0.83▲ ▲
* *：P<0.01 vs N,▲：P<0.05 vs C，▲ ▲：P<0.01 vs C
3 讨论
薏苡仁作为常用的中药已有一千多年的历史了[1]。现代早期药理研究证明它有解热、镇静、镇痛作用，嗣后发现薏苡仁还有增强免疫、抗肿瘤、降血糖、血钙等重要作用[8]。我们在预试验中发现薏苡仁的水提物有明显降低正常小鼠血糖的作用，在此基础上我们从中进一步分离提取出Coixan，并探讨了Coixan降血糖活性。结果显示口服给予薏苡仁多糖剂量在100 mg/kg和200 mg/kg时无明显的降血糖作用，据分析可能由于多糖口服后被消化酶水解成小分子单糖或寡糖而失去活性。而腹腔给药在剂量50 mg/kg和100 mg/kg时，Coixan有降低正常小鼠血糖作用。有研究表明[9]植物多糖能够促进胰岛分泌胰岛素；影响糖代谢酶的活性；促使外周组织对葡萄糖的利用；抑制糖异生。Coixan的降血糖作用可能与其中的一种或几种作用有关。
一般认为降血糖药的作用机制主要涉及以下两方面[10]：一方面是促进胰岛素的分泌或释放；另一方面是影响胰岛素受体后糖代谢的某些环节，主要是抑制肝脏的糖异生作用。我们利用四氧嘧啶选择性破坏胰岛β细胞建立糖尿病小鼠模型，结果发现Coixan能降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的高血糖，高剂量组下降的幅度大于低剂量组，呈现一定的量效关系。因此我们推测Coixan的降血糖活性主要是通过影响胰岛素受体后糖代谢的某些环节而起作用的。
肾上腺素作为影响血糖水平的重要激素之一，它能促进肝糖原分解，肌糖原酵解，加速糖异生，从而升高血糖[11]。我们试验发现，Coixan在剂量50 mg/kg和100 mg/kg能够显著抑制肾上腺素引起的小鼠血糖升高，因此可以推测Coixan可能有抑制肝糖原分解、肌糖原酵解，抑制糖异生作用，从而达到使血糖水平降低的目的(我们在随后的研究中证示了这点，结果另文发表)。
作者简介：徐梓辉(1969-)，男，湖南省岳阳市人，博士研究生，主治医师，讲师，主要从事植物多糖降血糖作用方面的研究，发表论文6篇。电话：(023)68755311
参考文献：
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[10] Kuhnle H F, Schmidt F H, Deaciuc I V, et al. In vivo and in vitro effects of a new hypoglycemic agent,2-3-methylcinnamylhyd zono)-propionate (BM 42.340) on glucose metabolism in guinea pigs[M]. Biochem Pharmacol,1984,33:1 437-1 444.
[11] 周宜强 主编.糖尿病研治新论[M].北京：中国医药科技出版社,1997.60.
收稿日期：1999-08-10；修回日期：2000-03-07