蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞spc-A1的抑瘤研究
作者：邹菁 张丽英
单位：(上海中医药大学附属曙光医院 上海 200021)
关键词：蛇毒复合酶；人肺腺癌细胞spc-A1；瘤细胞生长抑制率；流式细胞术；细胞周期
浙江中西医结合杂志000611
摘要 目的：探讨蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞spc-A1体外生长的抑制作用。方法：经体外细胞培养，采用台盼兰拒染法、细胞形态学观察和流式细胞术，检测人肺腺癌细胞的生长抑制率，以及细胞形态和细胞周期的变化。结果：蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞有明显的抑瘤作用，最大抑瘤率达87.5%。镜检及涂片染色发现癌细胞胞膜破裂、胞质外溢。流式细胞术分析显示蛇毒复合酶主要杀伤G2/M期细胞，同时阻滞G0/G1期细胞进入S期。结论：蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞具有一定体外抑瘤作用，其作用机理与破坏细胞膜和干扰细胞生长周期有关。
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肺癌的发病率在我国已占恶性肿瘤的首位。动物实验已经证明，蛇毒复合酶能抑制荷Lewis肺癌小鼠的自发性肺转移[1]。本实验进一步探讨蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞spc-Al的抑瘤作用及其作用机理。
1 实验材料
1.1 药物 蛇毒复合酶由上海黄山制药厂提供。
1.2 瘤株 人肺腺癌细胞spc-A1，由上海细胞生物学研究所提供。
1.3 仪器 FACS Calibur美国Becton Dickinson公司产品；计算机数据处理软件是ModFITLT for macV1.01
1.4 试剂 RPMI-1640培养液日本日永株式会社出品；三羟甲基氨基甲烷由上海试剂一厂生产；灭活小牛血清由上海细胞生物学研究所提供。
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2 方法和结果
2.1 蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞sp#-A1的抑瘤作用 以三羟基甲氨基甲烷(PH=7.6)作为缓冲液，将蛇毒复合酶配制成浓度为1.5mg/ml溶液(实验前即时配制新鲜溶液)。spc-Al细胞株常规传代，取指数生长期细胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液将其配制成浓度为3×105/ml的细胞悬液。取2ml细胞悬液接种于25ml的培养瓶中，共36瓶。随机分为药物组与对照组，每组18瓶，均置于CO2培养箱中(含5%CO2，37℃)培养24小时后，药物组每瓶加入蛇毒复合酶溶液20μl(培养液中药物终浓度为0.015mg/ml)，对照组加等量缓冲液。再置于CO2培养箱中培养。于0、8、16、24、36、48、72、96、120小时时，每组各取2瓶，显微镜下观察细胞形态，用台盼兰染色后计数存活瘤细胞数，以该2瓶的均值计算瘤细胞生长抑制率，并细胞涂片后瑞氏法染色镜检，上述实验重复1次。
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瘤细胞生长抑制率(%)=(对照组活瘤细胞数-药物组活瘤细胞数)/对照组活瘤细胞数×100%
上述药物在8、16、24、36、48、72、96、120小时时的抑瘤率分别为6.5%、31%、33%、29.5%、31%、80%、84.5%、87.5%。蛇毒复合酶在72小时以后显示对人肺腺癌细胞spc-Al有明显的抑瘤作用。光镜下细胞形态观察发现：药物组细胞生长受抑制，失去粘附性，呈散在圆形细胞，培养至16小时即有部分细胞胞膜破裂、胞质外溢，24小时胞膜破裂、胞质外溢增多，并出现核仁不清晰、核仁固缩，48小时以后除上述变化外，还出现细胞坏死，并随时间延长，坏死细胞增多；而对照组细胞各时相均生长旺盛，成团成蔟贴壁粘附生长。细胞涂片瑞氏染色后镜检示，药物组细胞胞膜破裂及细胞崩解明显高于对照组。
2.2 蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞spc-A1细胞周期的影响 将上述3×105/ml瘤细胞悬液接种于25ml的培养瓶中，共20瓶。随机分为药物组与对照组各10瓶，置于CO2培养箱中培养24小时后，药物组每瓶加入即时配制的1.5mg/ml蛇毒复合酶20μl，对照组加入等量缓冲液，再培养72小时后，分别制成细胞悬液。用PBS清洗，柠檬酸缓冲液固定，调整细胞数至1×106/ml，再经离心、消化、染色、过滤后，样品送入流式细胞仪进行细胞周期分析，得出细胞周期各时相的百分比，并计算细胞增殖指数：PI(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×%。标准变异系数(CV)在3%～5%，结果见表1。
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表1 培养72小时人肺腺癌细胞spc-Al细胞周期分布(
±s) %
n/例
G0/G1
S
G2/M
G2/G1
PI
药物组
10
66±5*
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25±4
7.8±1.4**
1.965±0.019
33.3
对照组
10
62.2±2.3
24.6±2.9
13.1±1.8
2.0±0.03
37.7
与对照组比较*P<0.01 **P<0.001
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3 讨论
在早期的中医药应用中，蛇毒因其剧烈的毒性而很少被利用，随着分析提纯技术的发展，自四十年代以来，蛇毒的生物利用价值才被发掘，并受到医学界的广泛关注。有大量的临床和实验研究表明，蛇毒能直接杀伤肿瘤细胞[2～4]。我们用柱层析法从东北蝮蛇毒与眼镜蛇毒中提取的蛇毒复合酶，已经动物实验证明具有体内外抑瘤作用，并能抑制荷Lewis肺癌小鼠的自发性肺转移。本文进一步观察其对人肺癌细胞的抑瘤作用，显示72小时抑瘤率已达84.5%，最大抑瘤率达87.5%，符合抗癌药物筛选的抑瘤要求(抑瘤率大于50%)。并且抑瘤率随药物作用时间的延长而增高，具明显时效相关性。提示蛇毒复合酶对肺癌可能是一有效的细胞毒药物。
以往研究表明蛇毒对癌细胞的杀伤作用主要是通过破坏细胞膜，使胞浆外渗进而细胞死亡[5]。如中科院昆明动物研究所报导印度产眼镜蛇毒中分离的细胞毒，对吉田肉瘤的体内外抑瘤作用表现在早期细胞膜的通透性改变，及随之而来的胞膜收缩和广泛损伤[6]。本实验结果表明与以往报导结果相一致，蛇毒复合酶的抑瘤作用与其具有特定的膜毒性有关。
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本实验还通过流式细胞术DNA分析，提示蛇毒复合酶对瘤细胞的作用不只是单纯的对癌细胞膜的损伤，还干扰和破坏癌细胞的生长代谢和增殖。实验显示药物组G2/M期细胞百分比显著低于对照组(P<0.001)，G0/G1期明显高于对照组(P<0.01)，PI指数药物组低于对照组(但未达到统计学上差异)。提示蛇毒复合酶主要杀伤G2/M期细胞，干扰有丝分裂，同时阻滞细胞于G0/G1期，抑制细胞增殖。肺癌常用化疗药物DDP，为细胞周期非特异性药物，对细胞各期均有杀伤作用，但对G1期最敏感。依据上述实验结果，如在临床DDP应用中合用蛇毒复合酶，有可能起到协同增敏作用。
参考文献
[1]张丽英，朱红穗，赵正福等.蛇毒复合酶胶囊抗癌作用的实验研究.上海中医药杂志，1996，(10)：41～42
, http://www.100md.com
[2]张谟瑞.复方蛇毒直肠滴注剂治疗晚期癌肿.中国蛇志杂志，1994，6(1)：18
[3]张素胤，陈陵际，朱云祥，等.蛇毒抗人癌裸小鼠移植瘤的初步试验.上海实验动物科学，1994，14(1)：26～27
[4]林振桃.眼晴蛇毒组分C对小鼠实验性肝癌细胞生长影响的探讨.中国蛇志杂志，1997，(1)：3
[5]杨惠玲，郭禹标.蛇毒膜毒素抗肿瘤作用的研究进展.癌症，1996，(1)：72～73
[6]覃公平.中国毒蛇学.广西：广西科学技术出版社，1995.567
收稿日期：2000-03-01, http://www.100md.com
单位：(上海中医药大学附属曙光医院 上海 200021)
关键词：蛇毒复合酶；人肺腺癌细胞spc-A1；瘤细胞生长抑制率；流式细胞术；细胞周期
浙江中西医结合杂志000611
摘要 目的：探讨蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞spc-A1体外生长的抑制作用。方法：经体外细胞培养，采用台盼兰拒染法、细胞形态学观察和流式细胞术，检测人肺腺癌细胞的生长抑制率，以及细胞形态和细胞周期的变化。结果：蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞有明显的抑瘤作用，最大抑瘤率达87.5%。镜检及涂片染色发现癌细胞胞膜破裂、胞质外溢。流式细胞术分析显示蛇毒复合酶主要杀伤G2/M期细胞，同时阻滞G0/G1期细胞进入S期。结论：蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞具有一定体外抑瘤作用，其作用机理与破坏细胞膜和干扰细胞生长周期有关。
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肺癌的发病率在我国已占恶性肿瘤的首位。动物实验已经证明，蛇毒复合酶能抑制荷Lewis肺癌小鼠的自发性肺转移[1]。本实验进一步探讨蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞spc-Al的抑瘤作用及其作用机理。
1 实验材料
1.1 药物 蛇毒复合酶由上海黄山制药厂提供。
1.2 瘤株 人肺腺癌细胞spc-A1，由上海细胞生物学研究所提供。
1.3 仪器 FACS Calibur美国Becton Dickinson公司产品；计算机数据处理软件是ModFITLT for macV1.01
1.4 试剂 RPMI-1640培养液日本日永株式会社出品；三羟甲基氨基甲烷由上海试剂一厂生产；灭活小牛血清由上海细胞生物学研究所提供。
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2 方法和结果
2.1 蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞sp#-A1的抑瘤作用 以三羟基甲氨基甲烷(PH=7.6)作为缓冲液，将蛇毒复合酶配制成浓度为1.5mg/ml溶液(实验前即时配制新鲜溶液)。spc-Al细胞株常规传代，取指数生长期细胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液将其配制成浓度为3×105/ml的细胞悬液。取2ml细胞悬液接种于25ml的培养瓶中，共36瓶。随机分为药物组与对照组，每组18瓶，均置于CO2培养箱中(含5%CO2，37℃)培养24小时后，药物组每瓶加入蛇毒复合酶溶液20μl(培养液中药物终浓度为0.015mg/ml)，对照组加等量缓冲液。再置于CO2培养箱中培养。于0、8、16、24、36、48、72、96、120小时时，每组各取2瓶，显微镜下观察细胞形态，用台盼兰染色后计数存活瘤细胞数，以该2瓶的均值计算瘤细胞生长抑制率，并细胞涂片后瑞氏法染色镜检，上述实验重复1次。
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瘤细胞生长抑制率(%)=(对照组活瘤细胞数-药物组活瘤细胞数)/对照组活瘤细胞数×100%
上述药物在8、16、24、36、48、72、96、120小时时的抑瘤率分别为6.5%、31%、33%、29.5%、31%、80%、84.5%、87.5%。蛇毒复合酶在72小时以后显示对人肺腺癌细胞spc-Al有明显的抑瘤作用。光镜下细胞形态观察发现：药物组细胞生长受抑制，失去粘附性，呈散在圆形细胞，培养至16小时即有部分细胞胞膜破裂、胞质外溢，24小时胞膜破裂、胞质外溢增多，并出现核仁不清晰、核仁固缩，48小时以后除上述变化外，还出现细胞坏死，并随时间延长，坏死细胞增多；而对照组细胞各时相均生长旺盛，成团成蔟贴壁粘附生长。细胞涂片瑞氏染色后镜检示，药物组细胞胞膜破裂及细胞崩解明显高于对照组。
2.2 蛇毒复合酶对人肺腺癌细胞spc-A1细胞周期的影响 将上述3×105/ml瘤细胞悬液接种于25ml的培养瓶中，共20瓶。随机分为药物组与对照组各10瓶，置于CO2培养箱中培养24小时后，药物组每瓶加入即时配制的1.5mg/ml蛇毒复合酶20μl，对照组加入等量缓冲液，再培养72小时后，分别制成细胞悬液。用PBS清洗，柠檬酸缓冲液固定，调整细胞数至1×106/ml，再经离心、消化、染色、过滤后，样品送入流式细胞仪进行细胞周期分析，得出细胞周期各时相的百分比，并计算细胞增殖指数：PI(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×%。标准变异系数(CV)在3%～5%，结果见表1。
, 百拇医药
表1 培养72小时人肺腺癌细胞spc-Al细胞周期分布(
±s) %n/例
G0/G1
S
G2/M
G2/G1
PI
药物组
10
66±5*
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25±4
7.8±1.4**
1.965±0.019
33.3
对照组
10
62.2±2.3
24.6±2.9
13.1±1.8
2.0±0.03
37.7
与对照组比较*P<0.01 **P<0.001
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3 讨论
在早期的中医药应用中，蛇毒因其剧烈的毒性而很少被利用，随着分析提纯技术的发展，自四十年代以来，蛇毒的生物利用价值才被发掘，并受到医学界的广泛关注。有大量的临床和实验研究表明，蛇毒能直接杀伤肿瘤细胞[2～4]。我们用柱层析法从东北蝮蛇毒与眼镜蛇毒中提取的蛇毒复合酶，已经动物实验证明具有体内外抑瘤作用，并能抑制荷Lewis肺癌小鼠的自发性肺转移。本文进一步观察其对人肺癌细胞的抑瘤作用，显示72小时抑瘤率已达84.5%，最大抑瘤率达87.5%，符合抗癌药物筛选的抑瘤要求(抑瘤率大于50%)。并且抑瘤率随药物作用时间的延长而增高，具明显时效相关性。提示蛇毒复合酶对肺癌可能是一有效的细胞毒药物。
以往研究表明蛇毒对癌细胞的杀伤作用主要是通过破坏细胞膜，使胞浆外渗进而细胞死亡[5]。如中科院昆明动物研究所报导印度产眼镜蛇毒中分离的细胞毒，对吉田肉瘤的体内外抑瘤作用表现在早期细胞膜的通透性改变，及随之而来的胞膜收缩和广泛损伤[6]。本实验结果表明与以往报导结果相一致，蛇毒复合酶的抑瘤作用与其具有特定的膜毒性有关。
, 百拇医药
本实验还通过流式细胞术DNA分析，提示蛇毒复合酶对瘤细胞的作用不只是单纯的对癌细胞膜的损伤，还干扰和破坏癌细胞的生长代谢和增殖。实验显示药物组G2/M期细胞百分比显著低于对照组(P<0.001)，G0/G1期明显高于对照组(P<0.01)，PI指数药物组低于对照组(但未达到统计学上差异)。提示蛇毒复合酶主要杀伤G2/M期细胞，干扰有丝分裂，同时阻滞细胞于G0/G1期，抑制细胞增殖。肺癌常用化疗药物DDP，为细胞周期非特异性药物，对细胞各期均有杀伤作用，但对G1期最敏感。依据上述实验结果，如在临床DDP应用中合用蛇毒复合酶，有可能起到协同增敏作用。
参考文献
[1]张丽英，朱红穗，赵正福等.蛇毒复合酶胶囊抗癌作用的实验研究.上海中医药杂志，1996，(10)：41～42
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[6]覃公平.中国毒蛇学.广西：广西科学技术出版社，1995.567
收稿日期：2000-03-01, http://www.100md.com