遗传和环境因素对原发性高血压人群脑梗死发生的影响
作者：陈义汉 徐文渊 宋艳丽 王奇志 车琳 陆振康 施仲伟 龚兰生
单位：陈义汉 徐文渊 宋艳丽 王奇志 车琳(同济大学医学院附属甘泉医院心内科，上海，200065)；陆振康(同济大学医学院附属甘泉医院神经内科)；施仲伟(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科)；龚兰生(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科)
关键词：原发性高血压；脑梗死；血管紧张素ⅡⅠ型受体；纤溶酶原激活物抑制剂-1；基因型；危险因素
临床心血管病杂志000602 摘要 目的：评估血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)A/C 1166多态性、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)4G/5G多态性和环境因素对原发性高血压(EH)人群脑梗死(CI)发生的影响。方法：随机收集240例神经内科EH病例，根据有无CI病史分为CI组(126例)和非CI组(114例)。采用等位基因特异性寡核苷酸探针杂交方法分析AT1R基因型(AA、AC和CC)和PAI-1基因型(4G/4G、4G/5G和5G/5G)。通过多因素Logistic回归分析识别EH人群CI发生的危险因素。结果：AT1R基因型与EH人群CI发生无显著性关系；CI与非CI EH人群相比，PAI-1基因型分布有显著性差异，前者4G/4G基因型频率显著高于后者，然而，4G/4G基因型并非CI独立危险因素；在4G/4G基因型，甘油三酯(TG)与PAI-1相关性最强；年龄≥70岁、糖尿病和血浆总胆固醇(TC)水平≥5.24 mmol/L是3个独立的CI危险因素(OR值和P值分别为1.83和0.030 7,4.30和0.000 6,1.90和0.039 7)。结论：AT1R基因型对CI发病不产生影响；PAI-1基因型与CI发生有关，但并非CI独立危险因素；PAI-1 4G/4G基因型可能协同TG影响血浆PAI-1水平，促成CI发生；年龄、糖尿病和血浆TC水平是EH人群发生CI的独立预测因子。
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Effects of genetic and environmental factors on the development of cerebral infarction in subjects with essential hypertension
CHEN Yi-han XU Wen-yuan SONG Yan-li WANG Qi-zhi CHE Lin
(Department of Cardiology,Ganquan Hospital,School of Medicine, Tongji University,Shanghai 200065)
LU Zhen-kang
(Department of Neurology,Ganquan Hospital,School of Medicine,Tongji University)
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SHI Zhong-wei GONG Lan-sheng
(Department of Cardiology,Ruijing Hospital,Shanghai Second Medical University)
Abstract Objective:To evaluate the influences of angiotensin II type l receptor (AT1R) A/C 1166 polymorphism, plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) 4G/5G polymorphism and environmental factors on the development of cerebral infarction(CI) in population with essential hypertension (EH).Method:Based on the history of CI 240 patients with EH from the departments of neurology were divided into CI group (n=126) and non-CI group (n=114). AT1R genotypes(AA, AC and CC) and PAI-1 genotypes ( 4G/4G, 4G/5G and 5G/5G) were analyzed by the allele specific oligonucleotide hybridization technique. Multivariate Logistic regression analysis was performed to identify risk factors that might influence the occurrence of CI in patients with EH.Result:AT1R genotypes were not significantly associated with CI in subjects with EH. There was a significant difference in PAI-1 genotypes distribution between the patients with CI and the patients without CI , with the 4G/4G genotype frequency in the former higher compared to that in the latter. However, 4G/4G genotype was not an independent risk factor for CI . Age≥70 years, diabetes mellitus and plasma total cholesterol levels≥5.24 mmol/L were three independent CI risk factors in patients with EH(respective odds ratios and p-values:1.83 and 0.030 7, 4.30 and 0.000 6, 1.90 and 0.039 7).Conclusion: AT1R genotypes do not influence the occurrence of CI in EH. PAI-1 genotypes are related to the development of CI but not independent CI risk factors in EH. Age, diabetes mellitus and total cholesterol level are independent predictors for CI in population with EH.
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Key words Essential hypertension Cerebral infarction Angiotensin II type 1 receptor Plasminogen activator inhibitor-1 Genotype Risk factors
本研究以原发性高血压(EH)这个脑梗死(CI)高发人群为研究对象，分析在此高危人群中遗传因素〔血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)1型受体(AT1R)基因型和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)基因型〕和环境因素(性别、年龄、糖尿病和血脂等)对CI发病的影响。
1 对象与方法
1.1 对象
上海普陀区和闸北区3家医院神经内科EH患者(上海地区汉族人种)240例，其中男女各120例，年龄33～89(平均65)岁。CI 126例，非CI 114例。EH入选标准：①过去确诊为高血压者；②本次非同一时间反复3次测量血压符合高血压诊断标准者；③符合上述两项的患者必须同时排除继发性高血压。高血压的诊断按1978年WHO制定的标准：收缩压≥160mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒张压≥95 mmHg。CI诊断标准按1986年第二次全国脑血管病学术会议第三次修订的标准，CI均经CT和(或)MRI证实。CI入选对象：①脑血栓形成；②腔隙性CI。所有病例排除肿瘤、严重感染、严重肝肾疾病以及近期有外伤和手术史。
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1.2 方法
专人采集患者的年龄、性别、身高、体重、EH病程、糖尿病史、吸烟史、饮酒史和CI史。体重指数(BMI)=体重/身高2(kg/m2)。禁食12 h后，晨起采取静脉血。酶法检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白A1(apoA1)和apoB,化学浊度法测定纤维蛋白原(Fib)。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)用Friedwald公式(LDL-C=TC-HDL-C-TG/2.2)计算。ELISA法检测血浆PAI-1抗原水平(福建太阳公司试剂盒)。用WinzardTM基因组DNA纯化试剂盒提取外周静脉血DNA(Promega公司提供试剂盒)。采用等位基因特异性寡核苷酸探针斑点杂交技术分析AT1R和PAI-1基因型。AT1R基因引物序列〔1〕：引物1：5′-AATGCTTGTAGCCAAAGTCACCT-3′，引物2：5′-GGCTTTGCTTTGTCTTGTTG-3′。循环参数：94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃2 min，共30个循环，最后72℃延伸7 min。A和C等位基因探针〔1〕分别为5′-AATGAGCATTAGCTA-3′和5′-AATGAGCCTTAGCTA-3′。PAI-1基因引物序列〔2〕：引物1：5′-AAGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-3′，引物2：5′-GGAGCTGCAGG
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AATTCAGCTGCTGGA-3′。循环参数：95℃ 60 s，55℃ 60 s，72℃ 60 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。4G和5G等位基因探针〔2〕分别为5′-CCACGTGGGGAGTCA-3′和5′-ACGTGGGGGA
GTCA-3′。采用Promega公司提供的5′末端标记试剂盒标记探针，〔r-32P〕ATP购自Amersham公司。常规点膜、预杂交、杂交、洗膜和放射自显影。
1.3 统计学处理
运用SAS软件(6.12版本)进行统计学分析。PAI-1、TG和BMI的分布呈明显的正偏态分布，为采用参数检验，将这3个变量取自然对数，转换后LnPAI-1、LnBMI和LnTG均符合正态分布。在3种基因型中分别计算TG对PAI-1的相关系数，以评价基因型对它们之间关系的影响。计数资料采用χ2检验，计量资料采用方差分析，通过协方差分析控制影响因素，通过Logistic回归模型分析CI危险因素。
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2 结果
2.1 AT1R基因型对CI的作用
AT1R基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(理论分布AA=88.4%, AC=11.2%, CC=0.4%, 实际分布AA=88.0%, AC=12.0%, CC=0.0%, P>0.05),具有人群代表意义。CI组和非CI组不同性别AT1R的分布见表1。
表1 CI组与非CI组不同性别AT1R基因型的分布例数(频率) 组别
男性AT1R基因型
女性AT1R基因型
合计
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AA
AC
AA
AC
CI组
51(0.84)
10(0.16)
57(0.88)
8(0.12)
126
非CI组
55(0.93)
4(0.07)
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48(0.87)
7(0.13)
114
χ2
2.69
0.005
1.211
P
0.101
0.945
>0.05
2.2 PAI-1基因型对CI的影响
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PAI-1基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(理论分布4G/4G=33%，4G/5G=49%，5G/5G=18%，实际分布4G/4G=34%，4G/5G=46%，5G/5G=20%，P>0.05)，具有人群代表意义。从表2可以看出，PAI-1 3种基因型4G/4G、4G/5G和5G/5G在CI组和非CI组分布有显著性差异。CI组4G/4G基因型频率显著高于非CI组，而5G/5G基因型频率则显著低于非CI组。表明PAI-1基因型与CI发病相关。但是，从表3回归分析显示PAI-1基因型未能成为CI发病的独立危险因素。
表2 CI组和非CI组PAI-1 3种基因型分布例数(频率) 组别
4G/4G
4G/5G
5G/5G
合计
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CI组
47(0.37)
60(0.48)
19(0.15)
126
非CI组
34(0.30)
51(0.45)
29(0.25)
114
χ2=8.49,P<0.05
2.3 PAI-1基因型对PAI-1和TG关系的影响
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PAI-1和TG的关系受PAI-1基因型的影响，4G/4G基因型PAI-1与TG相关性最强(r=0.43, P=0.000 1), 4G/5G次之(r=0.29, P=0.001 9),5G/5G最差(r=-0.15,P=0.32)。
表3 各CI(应变量)危险因素(自变量)的Logistic回归分析结果(240例)
B
标准误
Waldx2
P
OR
截距
-1.764 3
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0.577 5
9.332 9
0.002 3
-
年龄
0.602 2
0.278 7
4.669 2
0.030 7
1.83
糖尿病
1.457 9
0.425 4
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11.745 5
0.000 6
4.30
TC
0.641 5
0.311 9
4.229 7
0.039 7
1.90
注：①Logistic 回归采用Stepwise法，sle=0.15, sls=0.15;②参与回归的指标：年龄、性别、BMI、高血压病程、吸烟、饮酒、糖尿病、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Fib、PAI-1、AT1R基因型和PAI-1基因型；③各指标分级标准：年龄≥70岁=1，<70岁=0；男BMI≥25=1，<25=0; 女 BMI≥27=1，<27=0; TC≥5.24 mmmol/L=1, <5.24 mmol/L=0;HDL-C≤1.16 mmol/L=1, >1.16 mmol/L=0; PAI-1≥43 μg/L=1, <43 μg/L=0;④逻辑指标赋值：吸烟：有=1，无=0；饮酒：有=1，无=0；糖尿病：有=1，无=0；性别：男=1，女=0；4G/4G=2，4G/5G=1，5G/5G=0；AA=0，AC=1，CC=22.4 环境因素对CI的危险
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CI组PAI-1水平显著高于非CI组，用年龄或年龄和性别调整后，前者仍然显著高于后者(表4)，说明PAI-1参与CI发病，但是，Logistic回归分析表明PAI-1未能成为CI发病的独立危险因素(表4)。
表4 CI组和非CI组PAI-1水平μg/L，
±s 组别
例数
PAI-1
PAI-1△
PAI-1△△
CI组
126
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30.88±1.97
31.09±1.06
31.19±1.06
非CI组
144
26.05±1.90
25.79±1.06
25.76±1.06
△用年龄调整后的数值，△△用年龄和性别调整后的数值；CI组与非CI组相比，均P<0.053 讨论
多种危险因素与脑卒中有关。最近一些证据表明，除环境因素外，遗传因素在脑卒中发病中也起重要作用。在我国，EH的主要并发症是脑卒中，EH人群CI发生率较正常人群高5～30倍，已经引起世界性关注。
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EH致CI的发病机制主要是加速动脉粥样硬化(AS)的形成和使动脉血管壁重构〔3〕。AngⅡ是肾素-血管紧张素系统(RAS)的主要活性肽。它作用于AngⅡ受体，产生RAS生物学效应。AngⅡ引起血管收缩，刺激平滑肌细胞增生、肥大、迁移，促进血小板粘附、聚集、抑制纤溶系统，从而参与脑AS的发生和血管壁重构，它与CI的发病有内在的联系〔4〕，由此我们推测能够影响AngⅡ功能发挥的遗传变异就有可能改变CI发生。
AngⅡ受体有2个亚型——AT1R和AT2R，AT1R介导了AngⅡ几乎所有的心血管效应。Bonnardeaux等分析AT1R基因后发现5种基因多态性：T/C573、A/G1062、A/C1166、G/T1517和A/G1878，进一步的研究表明，AT1R基因 A/C1166多态性与血压调节、动脉僵硬度、AS、动脉粥样硬化、冠状动脉病变程度和心脏指数相关〔1〕，Tiret等还发现AT1R C等位基因与血管紧张素转化酶(ACE)DD基因型协同作用致使心肌梗死(MI)发生的危险度增加〔5〕。因此，从理论上，我们认为AT1R基因A/C1166多态性可能与EH人群CI发生有关。然而，根据我们的研究结果，AT1R基因型与EH人群CI发生无关，它既不是CI的危险因素，更不是独立危险因素。我们还将240例患者分成男性和女性两组，分析AT1R基因型对不同性别CI发病是否有不同的影响，结果仍然是阴性。我们的研究结果似乎与理论推测有矛盾，解释如下：①腔隙性CI是一种特殊类型的缺血性卒中，约占缺血性卒中的20%，它主要以小血管病变为主。其形成与高血压、糖尿病和吸烟等密切相关，而与AS可能无关〔6〕。AngⅡ可能主要是通过促进AS的形成参与CI的发生，我们未把腔隙性CI区分出来，故出现了阴性结果；②脑AS和CI的发生有种族分布差异；③Tiret等〔5〕报道AT1R C等位基因与ACE DD基因型共同作用增加MI发生的危险性，提示AT1R基因与MI发生之间的相关性基于与ACE DD基因型的协同作用，而本研究未检测ACE基因I/D多态性，因此不能否定AT1R基因A/C 1166多态性可能与ACE DD基因型协同增加EH人群CI发生的危险；④与AT1R基因连锁的新的功能性变异可能影响RAS，从而影响EH人群CI的发生〔7〕。
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越来越多的证据表明PAI-1与AS形成有关。多顶研究表明AS斑块中PAI-1 mRNA表达增强，且与AS的严重程度呈正相关；此外，斑块中玻璃体连接蛋白mRNA表达亦增加，后者与PAI-1相结合，增强PAI-1的稳定性，从而加强PAI-1的生物作用，因而AS性血管局部纤溶活性减弱，抗纤溶活性增强，使纤维蛋白易于沉积，纤维蛋白则可刺激血管平滑肌细胞增生并与LDL特别是Lp(a)结合而促成AS斑块的形成和发展〔8〕。
最近Margalion等〔9〕的回顾性研究表明，血浆PAI-1活性是缺血性卒中发生的独立危险因素；Catto等〔10〕的前瞻性研究表明血浆PAI-1活性是卒中后1个月和3个月发生死亡的独立预测因素。因此PAI-1血浆水平明显地影响卒中的发生和预测。新的研究揭示PAI-1基因4G/5G多态性与PAI-1基因转录相关〔10〕。综上所述，PAI-1基因4G/5G多态性可能对CI发生产生影响。根据本研究结果，PAI-1基因4G/5G多态性确实对EH人群CI的发生起一定作用，但是它并非独立危险因素。
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回归分析表明TG为PAI-1独立的影响因素〔11〕，然而，迄今为止，TG影响PAI-1的作用机制尚不清楚。根据我们的研究结果，PAI-1与TG的关系受PAI-1基因型的影响，在4G/4G基因型，PAI-1与TG的关系最为密切，在5G/5G基因型，两者相关性最差，提示TG可能通过PAI-1基因影响血浆PAI-1水平，换言之，PAI-1基因型(遗传因素)和TG(环境因素)之间存在协同作用，它们共同影响血浆PAI-1水平。结合本研究结果——PAI-1参与CI发病，我们推测：PAI-1基因型可能与PAI-1和TG协同促成CI。
随着年龄的老化，有趋势表明卒中的发生正在上升，卒中的预测和一级预防已成为众所关注的热点。EH人群比正常人群更倾向于并发高胆固醇血症、糖尿病和肥胖等，高血压与这些危险因素相互作用将导致心血管事件总危险性成倍增加〔11〕。本项研究显示，在EH人群中，高龄、糖尿病和高胆固醇血症是CI的独立危险因素。由此我们认为在EH患者这个CI高危人群，特别是在高龄的EH人群中，应积极控制高脂血症和糖尿病。
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铁道部专项基金资助项目
参考文献
1，Castellano M,Muiesan M L,Beschi M,et al.AngiotensinⅡ type 1 receptor A/C 1166 polymorphism: Relationships with blood pressure and cardiovascular structure.Hypertension,1996,28:1076～1080
2，Ye S,Green F R,Scarabin P Y,et al.The 4G/5G genetic polymorphism in the promoter of the plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) gene is associated with difference in plasma PAI-1 activity but not with risk of myocardial infarction in ECTM study.Thromb Haemost,1995,74:831～841
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3，Rossi G,Rossi A,Sacchetto A,et al.Hypertensive cerebrovascular disease and the renin angiotensin system.Stroke,1995,16:1700～1760
4，Slajszczyk M,Gminski J.The role of DNA polymorphism in the renin-angiotensin system and the path genesis of cardiovascular disease.Posteey Hig Med Dosw,1997,51:171～183
5，Tiret L,Bonnardeaux A,Poirier O,et al.Synergistic effects of angiotensin converting enzyme and angiotensin-Ⅱ type 1 receptor gene polymorphisms on risk of myocardial infarction.Lancet,1994,344:910～913
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6，You R,Naneil J J, O′Malley H M, et al, Risk factors for lancunar infarction syndromes.Neurology,1995,45:1483～1487
7，Poirier O, Georges J L, Ricard S, et al, New polymorphisms of the angiotensin Ⅱ type Ⅰ receptor gene and their associations with myocardial infarction and blood pressure:The ECTIM study. J Hypertens,1998,16:1443～1447
8，Robbie L A, Booth N A, Brown P A J ,et al. Inhibitors of fibrinolysis are elevated in atherosclerotic plaque. Arteriocler Thromb Vasc Biol,1996,16:539～543
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9，Margaglion M, Grandone E,Vecchione G, et al. Plasminogen activator inhibior-1(PAI-1)antigen plasma levels in subjects attending a metabolic ward:Relation to polymorphisms of PAI-1 and angiotensin converting enzyme (ACE)genes. Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17:2082～2087
10，Catto A J, Carter A M, Stickland M, et al. Plasminogen activator inhibitor -1(PAI-1)4G/5G promoter polymorphism and levels in subjects with cerebrovascular disease. Thromb Haemost,1997,77:730～734
11，Juhan V, Alessi M C, Badier C, et al.Relationship between plasma insulin ,triglyceride, body mass index and plasminogen activator inhibitor-1. Diabete Metab,1987,13:331～336
收稿 1999-11-17, 百拇医药
单位：陈义汉 徐文渊 宋艳丽 王奇志 车琳(同济大学医学院附属甘泉医院心内科，上海，200065)；陆振康(同济大学医学院附属甘泉医院神经内科)；施仲伟(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科)；龚兰生(上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科)
关键词：原发性高血压；脑梗死；血管紧张素ⅡⅠ型受体；纤溶酶原激活物抑制剂-1；基因型；危险因素
临床心血管病杂志000602 摘要 目的：评估血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)A/C 1166多态性、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)4G/5G多态性和环境因素对原发性高血压(EH)人群脑梗死(CI)发生的影响。方法：随机收集240例神经内科EH病例，根据有无CI病史分为CI组(126例)和非CI组(114例)。采用等位基因特异性寡核苷酸探针杂交方法分析AT1R基因型(AA、AC和CC)和PAI-1基因型(4G/4G、4G/5G和5G/5G)。通过多因素Logistic回归分析识别EH人群CI发生的危险因素。结果：AT1R基因型与EH人群CI发生无显著性关系；CI与非CI EH人群相比，PAI-1基因型分布有显著性差异，前者4G/4G基因型频率显著高于后者，然而，4G/4G基因型并非CI独立危险因素；在4G/4G基因型，甘油三酯(TG)与PAI-1相关性最强；年龄≥70岁、糖尿病和血浆总胆固醇(TC)水平≥5.24 mmol/L是3个独立的CI危险因素(OR值和P值分别为1.83和0.030 7,4.30和0.000 6,1.90和0.039 7)。结论：AT1R基因型对CI发病不产生影响；PAI-1基因型与CI发生有关，但并非CI独立危险因素；PAI-1 4G/4G基因型可能协同TG影响血浆PAI-1水平，促成CI发生；年龄、糖尿病和血浆TC水平是EH人群发生CI的独立预测因子。
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Effects of genetic and environmental factors on the development of cerebral infarction in subjects with essential hypertension
CHEN Yi-han XU Wen-yuan SONG Yan-li WANG Qi-zhi CHE Lin
(Department of Cardiology,Ganquan Hospital,School of Medicine, Tongji University,Shanghai 200065)
LU Zhen-kang
(Department of Neurology,Ganquan Hospital,School of Medicine,Tongji University)
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SHI Zhong-wei GONG Lan-sheng
(Department of Cardiology,Ruijing Hospital,Shanghai Second Medical University)
Abstract Objective:To evaluate the influences of angiotensin II type l receptor (AT1R) A/C 1166 polymorphism, plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) 4G/5G polymorphism and environmental factors on the development of cerebral infarction(CI) in population with essential hypertension (EH).Method:Based on the history of CI 240 patients with EH from the departments of neurology were divided into CI group (n=126) and non-CI group (n=114). AT1R genotypes(AA, AC and CC) and PAI-1 genotypes ( 4G/4G, 4G/5G and 5G/5G) were analyzed by the allele specific oligonucleotide hybridization technique. Multivariate Logistic regression analysis was performed to identify risk factors that might influence the occurrence of CI in patients with EH.Result:AT1R genotypes were not significantly associated with CI in subjects with EH. There was a significant difference in PAI-1 genotypes distribution between the patients with CI and the patients without CI , with the 4G/4G genotype frequency in the former higher compared to that in the latter. However, 4G/4G genotype was not an independent risk factor for CI . Age≥70 years, diabetes mellitus and plasma total cholesterol levels≥5.24 mmol/L were three independent CI risk factors in patients with EH(respective odds ratios and p-values:1.83 and 0.030 7, 4.30 and 0.000 6, 1.90 and 0.039 7).Conclusion: AT1R genotypes do not influence the occurrence of CI in EH. PAI-1 genotypes are related to the development of CI but not independent CI risk factors in EH. Age, diabetes mellitus and total cholesterol level are independent predictors for CI in population with EH.
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Key words Essential hypertension Cerebral infarction Angiotensin II type 1 receptor Plasminogen activator inhibitor-1 Genotype Risk factors
本研究以原发性高血压(EH)这个脑梗死(CI)高发人群为研究对象，分析在此高危人群中遗传因素〔血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)1型受体(AT1R)基因型和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)基因型〕和环境因素(性别、年龄、糖尿病和血脂等)对CI发病的影响。
1 对象与方法
1.1 对象
上海普陀区和闸北区3家医院神经内科EH患者(上海地区汉族人种)240例，其中男女各120例，年龄33～89(平均65)岁。CI 126例，非CI 114例。EH入选标准：①过去确诊为高血压者；②本次非同一时间反复3次测量血压符合高血压诊断标准者；③符合上述两项的患者必须同时排除继发性高血压。高血压的诊断按1978年WHO制定的标准：收缩压≥160mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒张压≥95 mmHg。CI诊断标准按1986年第二次全国脑血管病学术会议第三次修订的标准，CI均经CT和(或)MRI证实。CI入选对象：①脑血栓形成；②腔隙性CI。所有病例排除肿瘤、严重感染、严重肝肾疾病以及近期有外伤和手术史。
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专人采集患者的年龄、性别、身高、体重、EH病程、糖尿病史、吸烟史、饮酒史和CI史。体重指数(BMI)=体重/身高2(kg/m2)。禁食12 h后，晨起采取静脉血。酶法检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白A1(apoA1)和apoB,化学浊度法测定纤维蛋白原(Fib)。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)用Friedwald公式(LDL-C=TC-HDL-C-TG/2.2)计算。ELISA法检测血浆PAI-1抗原水平(福建太阳公司试剂盒)。用WinzardTM基因组DNA纯化试剂盒提取外周静脉血DNA(Promega公司提供试剂盒)。采用等位基因特异性寡核苷酸探针斑点杂交技术分析AT1R和PAI-1基因型。AT1R基因引物序列〔1〕：引物1：5′-AATGCTTGTAGCCAAAGTCACCT-3′，引物2：5′-GGCTTTGCTTTGTCTTGTTG-3′。循环参数：94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃2 min，共30个循环，最后72℃延伸7 min。A和C等位基因探针〔1〕分别为5′-AATGAGCATTAGCTA-3′和5′-AATGAGCCTTAGCTA-3′。PAI-1基因引物序列〔2〕：引物1：5′-AAGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-3′，引物2：5′-GGAGCTGCAGG
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AATTCAGCTGCTGGA-3′。循环参数：95℃ 60 s，55℃ 60 s，72℃ 60 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。4G和5G等位基因探针〔2〕分别为5′-CCACGTGGGGAGTCA-3′和5′-ACGTGGGGGA
GTCA-3′。采用Promega公司提供的5′末端标记试剂盒标记探针，〔r-32P〕ATP购自Amersham公司。常规点膜、预杂交、杂交、洗膜和放射自显影。
1.3 统计学处理
运用SAS软件(6.12版本)进行统计学分析。PAI-1、TG和BMI的分布呈明显的正偏态分布，为采用参数检验，将这3个变量取自然对数，转换后LnPAI-1、LnBMI和LnTG均符合正态分布。在3种基因型中分别计算TG对PAI-1的相关系数，以评价基因型对它们之间关系的影响。计数资料采用χ2检验，计量资料采用方差分析，通过协方差分析控制影响因素，通过Logistic回归模型分析CI危险因素。
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2 结果
2.1 AT1R基因型对CI的作用
AT1R基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(理论分布AA=88.4%, AC=11.2%, CC=0.4%, 实际分布AA=88.0%, AC=12.0%, CC=0.0%, P>0.05),具有人群代表意义。CI组和非CI组不同性别AT1R的分布见表1。
表1 CI组与非CI组不同性别AT1R基因型的分布例数(频率) 组别
男性AT1R基因型
女性AT1R基因型
合计
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AA
AC
AA
AC
CI组
51(0.84)
10(0.16)
57(0.88)
8(0.12)
126
非CI组
55(0.93)
4(0.07)
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48(0.87)
7(0.13)
114
χ2
2.69
0.005
1.211
P
0.101
0.945
>0.05
2.2 PAI-1基因型对CI的影响
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PAI-1基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(理论分布4G/4G=33%，4G/5G=49%，5G/5G=18%，实际分布4G/4G=34%，4G/5G=46%，5G/5G=20%，P>0.05)，具有人群代表意义。从表2可以看出，PAI-1 3种基因型4G/4G、4G/5G和5G/5G在CI组和非CI组分布有显著性差异。CI组4G/4G基因型频率显著高于非CI组，而5G/5G基因型频率则显著低于非CI组。表明PAI-1基因型与CI发病相关。但是，从表3回归分析显示PAI-1基因型未能成为CI发病的独立危险因素。
表2 CI组和非CI组PAI-1 3种基因型分布例数(频率) 组别
4G/4G
4G/5G
5G/5G
合计
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CI组
47(0.37)
60(0.48)
19(0.15)
126
非CI组
34(0.30)
51(0.45)
29(0.25)
114
χ2=8.49,P<0.05
2.3 PAI-1基因型对PAI-1和TG关系的影响
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PAI-1和TG的关系受PAI-1基因型的影响，4G/4G基因型PAI-1与TG相关性最强(r=0.43, P=0.000 1), 4G/5G次之(r=0.29, P=0.001 9),5G/5G最差(r=-0.15,P=0.32)。
表3 各CI(应变量)危险因素(自变量)的Logistic回归分析结果(240例)
B
标准误
Waldx2
P
OR
截距
-1.764 3
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0.577 5
9.332 9
0.002 3
-
年龄
0.602 2
0.278 7
4.669 2
0.030 7
1.83
糖尿病
1.457 9
0.425 4
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11.745 5
0.000 6
4.30
TC
0.641 5
0.311 9
4.229 7
0.039 7
1.90
注：①Logistic 回归采用Stepwise法，sle=0.15, sls=0.15;②参与回归的指标：年龄、性别、BMI、高血压病程、吸烟、饮酒、糖尿病、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Fib、PAI-1、AT1R基因型和PAI-1基因型；③各指标分级标准：年龄≥70岁=1，<70岁=0；男BMI≥25=1，<25=0; 女 BMI≥27=1，<27=0; TC≥5.24 mmmol/L=1, <5.24 mmol/L=0;HDL-C≤1.16 mmol/L=1, >1.16 mmol/L=0; PAI-1≥43 μg/L=1, <43 μg/L=0;④逻辑指标赋值：吸烟：有=1，无=0；饮酒：有=1，无=0；糖尿病：有=1，无=0；性别：男=1，女=0；4G/4G=2，4G/5G=1，5G/5G=0；AA=0，AC=1，CC=22.4 环境因素对CI的危险
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CI组PAI-1水平显著高于非CI组，用年龄或年龄和性别调整后，前者仍然显著高于后者(表4)，说明PAI-1参与CI发病，但是，Logistic回归分析表明PAI-1未能成为CI发病的独立危险因素(表4)。
表4 CI组和非CI组PAI-1水平μg/L，
±s 组别例数
PAI-1
PAI-1△
PAI-1△△
CI组
126
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30.88±1.97
31.09±1.06
31.19±1.06
非CI组
144
26.05±1.90
25.79±1.06
25.76±1.06
△用年龄调整后的数值，△△用年龄和性别调整后的数值；CI组与非CI组相比，均P<0.053 讨论
多种危险因素与脑卒中有关。最近一些证据表明，除环境因素外，遗传因素在脑卒中发病中也起重要作用。在我国，EH的主要并发症是脑卒中，EH人群CI发生率较正常人群高5～30倍，已经引起世界性关注。
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EH致CI的发病机制主要是加速动脉粥样硬化(AS)的形成和使动脉血管壁重构〔3〕。AngⅡ是肾素-血管紧张素系统(RAS)的主要活性肽。它作用于AngⅡ受体，产生RAS生物学效应。AngⅡ引起血管收缩，刺激平滑肌细胞增生、肥大、迁移，促进血小板粘附、聚集、抑制纤溶系统，从而参与脑AS的发生和血管壁重构，它与CI的发病有内在的联系〔4〕，由此我们推测能够影响AngⅡ功能发挥的遗传变异就有可能改变CI发生。
AngⅡ受体有2个亚型——AT1R和AT2R，AT1R介导了AngⅡ几乎所有的心血管效应。Bonnardeaux等分析AT1R基因后发现5种基因多态性：T/C573、A/G1062、A/C1166、G/T1517和A/G1878，进一步的研究表明，AT1R基因 A/C1166多态性与血压调节、动脉僵硬度、AS、动脉粥样硬化、冠状动脉病变程度和心脏指数相关〔1〕，Tiret等还发现AT1R C等位基因与血管紧张素转化酶(ACE)DD基因型协同作用致使心肌梗死(MI)发生的危险度增加〔5〕。因此，从理论上，我们认为AT1R基因A/C1166多态性可能与EH人群CI发生有关。然而，根据我们的研究结果，AT1R基因型与EH人群CI发生无关，它既不是CI的危险因素，更不是独立危险因素。我们还将240例患者分成男性和女性两组，分析AT1R基因型对不同性别CI发病是否有不同的影响，结果仍然是阴性。我们的研究结果似乎与理论推测有矛盾，解释如下：①腔隙性CI是一种特殊类型的缺血性卒中，约占缺血性卒中的20%，它主要以小血管病变为主。其形成与高血压、糖尿病和吸烟等密切相关，而与AS可能无关〔6〕。AngⅡ可能主要是通过促进AS的形成参与CI的发生，我们未把腔隙性CI区分出来，故出现了阴性结果；②脑AS和CI的发生有种族分布差异；③Tiret等〔5〕报道AT1R C等位基因与ACE DD基因型共同作用增加MI发生的危险性，提示AT1R基因与MI发生之间的相关性基于与ACE DD基因型的协同作用，而本研究未检测ACE基因I/D多态性，因此不能否定AT1R基因A/C 1166多态性可能与ACE DD基因型协同增加EH人群CI发生的危险；④与AT1R基因连锁的新的功能性变异可能影响RAS，从而影响EH人群CI的发生〔7〕。
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越来越多的证据表明PAI-1与AS形成有关。多顶研究表明AS斑块中PAI-1 mRNA表达增强，且与AS的严重程度呈正相关；此外，斑块中玻璃体连接蛋白mRNA表达亦增加，后者与PAI-1相结合，增强PAI-1的稳定性，从而加强PAI-1的生物作用，因而AS性血管局部纤溶活性减弱，抗纤溶活性增强，使纤维蛋白易于沉积，纤维蛋白则可刺激血管平滑肌细胞增生并与LDL特别是Lp(a)结合而促成AS斑块的形成和发展〔8〕。
最近Margalion等〔9〕的回顾性研究表明，血浆PAI-1活性是缺血性卒中发生的独立危险因素；Catto等〔10〕的前瞻性研究表明血浆PAI-1活性是卒中后1个月和3个月发生死亡的独立预测因素。因此PAI-1血浆水平明显地影响卒中的发生和预测。新的研究揭示PAI-1基因4G/5G多态性与PAI-1基因转录相关〔10〕。综上所述，PAI-1基因4G/5G多态性可能对CI发生产生影响。根据本研究结果，PAI-1基因4G/5G多态性确实对EH人群CI的发生起一定作用，但是它并非独立危险因素。
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回归分析表明TG为PAI-1独立的影响因素〔11〕，然而，迄今为止，TG影响PAI-1的作用机制尚不清楚。根据我们的研究结果，PAI-1与TG的关系受PAI-1基因型的影响，在4G/4G基因型，PAI-1与TG的关系最为密切，在5G/5G基因型，两者相关性最差，提示TG可能通过PAI-1基因影响血浆PAI-1水平，换言之，PAI-1基因型(遗传因素)和TG(环境因素)之间存在协同作用，它们共同影响血浆PAI-1水平。结合本研究结果——PAI-1参与CI发病，我们推测：PAI-1基因型可能与PAI-1和TG协同促成CI。
随着年龄的老化，有趋势表明卒中的发生正在上升，卒中的预测和一级预防已成为众所关注的热点。EH人群比正常人群更倾向于并发高胆固醇血症、糖尿病和肥胖等，高血压与这些危险因素相互作用将导致心血管事件总危险性成倍增加〔11〕。本项研究显示，在EH人群中，高龄、糖尿病和高胆固醇血症是CI的独立危险因素。由此我们认为在EH患者这个CI高危人群，特别是在高龄的EH人群中，应积极控制高脂血症和糖尿病。
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铁道部专项基金资助项目
参考文献
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收稿 1999-11-17, 百拇医药